薛鳴,李春青,楚蕾蕾,劉佟,武莉萍

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院 a.放療科;b.腫瘤內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453000)

肺癌是公認(rèn)的全球頭號癌癥殺手,在全球范圍內(nèi)每年造成幾十萬人失去生命、幾百萬人忍受著肺癌病痛的折磨[1]。當(dāng)前的肺癌治療方法包括外科手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療生物免疫治療及靶向治療等,但是各種治療方式均有局限性,盡管肺癌的臨床治療效果在多年前有了顯著的改善,但是肺癌患者的5 a生存率仍然較低。雖然目前的治療方法在提高患者生存率方面做出了一定的貢獻(xiàn),但仍需要進(jìn)一步的研究和創(chuàng)新,以改善肺癌的治療效果[2]。

貝伐珠單抗(bevacizumab,Bev)是由世界著名藥廠羅氏公司針對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的重組、人源化的用于多種腫瘤的抗癌藥物,能夠抑制癌組織中內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新血管生成,并可使已有的腫瘤血管退化[3]。奧希替尼(osimertinib,Osi)是近年來被臨床上推薦為晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的一線藥物[4]。雖然兩種藥物在治療中均有較好的效果,但是由于藥物本身的局限性,當(dāng)用藥過久或者用藥量大后會使患者出現(xiàn)耐藥反應(yīng)、高血壓等副作用,但是用藥量不足又發(fā)揮不了藥物本身具備的效果[5]。因此針對這種“難題”,本研究針對以Bev與Osi“半單位”聯(lián)合使用與兩藥“1單位”水平使用作為對比,研究聯(lián)合用藥協(xié)同抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人肺癌A549細(xì)胞系,人胚肺MRC-5細(xì)胞均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

貝伐珠單抗,貨號CS00004,購自武漢科斯坦生物科技有限公司;奧希替尼,CAS 1421373-66-1,貨號:wkq-09057,購自四川省維克奇生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、MEM(含NEAA)培養(yǎng)基、胎牛血清均購于上海研卉生物科技有限公司,青霉素鏈霉素及胰蛋白酶及磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)均由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供;CCK-8試劑盒,AnnexinV/PI凋亡試劑盒均由上海吉至生化科技有限公司提供;所有一抗抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG均由武漢艾美捷科技有限公司提供;2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2’, 7’-dichlorofluorescent yellow diacetate,DCFH-DA)、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購于由北京百奧萊博科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。人胚肺成纖維MRC-5細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),兩種細(xì)胞都被放置在溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、濕度為飽和的培養(yǎng)箱中進(jìn)行生長。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時,本研究根據(jù)一定的比例將細(xì)胞分離出一部分,在新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2CCK-8檢測

首先將A549及MRC-5細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔1×104的密度接種于96孔板中,36 h后分別加入濃度梯度為0、5、10、15、20、30 μmol·L-1的Bev、Osi,對照組加DMSO,每組設(shè)8個復(fù)孔。處理1 d后,按照試劑盒說明書將10 μL CCK-8試劑加入每個孔中,并將孔置于37 ℃下孵育2 h。隨后,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度值,得到細(xì)胞增殖抑制圖,并計算出半數(shù)致死濃度(IC50值)。隨后分組為空白對照組、Bev組、Osi組及聯(lián)合處理組,處理方式分別為DMSO處理,IC50值Bev處理,IC50值Osi處理及1/2 IC50值Bev+1/2 IC50值Osi處理。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況

將細(xì)胞濃度控制在大約80%的范圍內(nèi),以確保細(xì)胞的數(shù)量處于合適的狀態(tài),后通過計數(shù)細(xì)胞數(shù)量來確定接種的細(xì)胞懸液的濃度。將細(xì)胞懸液均勻地分種至6孔板中,每孔接種1×105個A549細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到每孔1×107后按照1.3.2的分組方式分別處理A549細(xì)胞,在收集細(xì)胞并經(jīng)過PBS清洗后,根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的操作說明,首先需要將細(xì)胞重懸于195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液中,這有助于細(xì)胞與相應(yīng)的染色劑結(jié)合。隨后,需要加入3 μL的Annexin V-FITC和2 μL的PI,以確保凋亡細(xì)胞能夠被準(zhǔn)確地檢測出來。待混合均勻后,將混合液置于避光條件下的室溫下孵育15 min,以促使染色劑與細(xì)胞發(fā)生充分的反應(yīng)。補(bǔ)足總體積達(dá)到500 μL,隨后將樣品轉(zhuǎn)移至流式管中,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

線粒體膜電位檢測的前期處理同細(xì)胞凋亡,收集細(xì)胞后根據(jù)JC-1試劑盒說明書,取10 μL的DCFH-DA將細(xì)胞染色,隨后將其轉(zhuǎn)移至流式管中,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞鐘活性氧變化情況。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞活性氧水平

前期處理同1.3.3。為了判斷各組細(xì)胞ROS水平是否有差異,待按照分組處理24 h后,PBS洗滌1次,去除殘留的上清液。加10 μmol·L-1的DCFH-DA,37 ℃恒溫避光水浴孵育0.5 h,將孵育0.5 h后的細(xì)胞樣品加入490 μL PBS中,將重懸后的細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移到流式管中,然后使用流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

1.3.5Western Blotting法檢測各種蛋白的變化情況

前期處理方法同1.3.3,在處理A549細(xì)胞培養(yǎng)物24 h后,將細(xì)胞收集于離心管中。然后,利用BCA蛋白濃度測定試劑盒來測定收集的細(xì)胞中的蛋白濃度。接下來,需要配制10%～15%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白。將分離得到的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)膜上,然后使用脫脂乳進(jìn)行封閉處理,持續(xù)2 h。隨后,在4 ℃的水平搖床上孵育一抗體,使其與目標(biāo)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合,并持續(xù)過夜。使用TBST緩沖液洗膜以去除未結(jié)合的一抗體。接下來,將用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗體孵育在室溫下,以促使其與一抗體結(jié)合。隨后,使用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色,從而產(chǎn)生熒光信號。最后,使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍攝NC膜上的熒光信號。在Western Blotting過程中,內(nèi)參蛋白α-tubulin被選擇為標(biāo)準(zhǔn)來準(zhǔn)確地衡量目標(biāo)蛋白的信號強(qiáng)度。利用Image J軟件,可以對所得到的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析,從而量化蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.6統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bev與Osi聯(lián)合用藥實(shí)現(xiàn)高效低毒的抗癌效果

如圖1A的CCK-8結(jié)果所示,隨著Bev與Osi處理水平的不斷增加,A549細(xì)胞的存活率大幅下降,經(jīng)計算Bev和Osi對A549細(xì)胞的半數(shù)致死水平分別為17.8 μmol·L-1及13.4 μmol·L-1。隨后按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計得出聯(lián)合處理組水平應(yīng)為8.9 μmol·L-1Bev+6.7 μmol·L-1Osi。得出各組用藥水平后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計對A549及人胚肺MRC-5細(xì)胞進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn),從結(jié)果1B中可以看出,聯(lián)合處理組對A549細(xì)胞的增殖抑制效果要優(yōu)于Bev和Osi單獨(dú)處理組,同時聯(lián)合處理組對MRC-5細(xì)胞的毒副作用要小于Bev和Osi單獨(dú)處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A為不同水平Bev及Osi對A549細(xì)胞的抑制增殖作用;B為各組處理對A549及MRC-5細(xì)胞的增殖抑制作用。

2.2 Bev與Osi聯(lián)合用藥通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡

分組處理A549細(xì)胞24 h后,檢測細(xì)胞凋亡情況如圖2A所示,Bev組、Osi組凋亡細(xì)胞比率分別為47%及45%,聯(lián)合處理組的凋亡細(xì)胞比率為70.38%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時檢測了線粒體膜電位變化情況,如圖2B所示,相比較于Bev組及Osi組來看,聯(lián)合處理組的線粒體膜電位更為顯著(P<0.05)。接下來對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測,可以看出聯(lián)合處理組的Caspase-3,Cytochrome C及Bad的增幅及Bcl-2蛋白的降低幅度要大于Bev與Osi組(P<0.05)。

A為流式檢測A549細(xì)胞凋亡情況;B為JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位變化情況;C為Western Blotting法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化情況。

2.3 Bev與Osi聯(lián)合使用上調(diào)人肺癌A549細(xì)胞中ROS水平

Bev與Osi聯(lián)合使用能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,為了進(jìn)一步探究聯(lián)合使用誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生大幅凋亡的機(jī)制是否與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有關(guān),分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計分組水平處理24 h后,加入DCFH-DA熒光探針,并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化情況。從圖3A中可以看出,Bev與Osi聯(lián)合使用后,ROS水平上升,與兩藥單獨(dú)處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨后為了驗(yàn)證ROS的調(diào)節(jié)作用,加入ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)后檢測細(xì)胞凋亡變化,從圖3B中可以看出當(dāng)加入NAC后聯(lián)合處理組的凋亡細(xì)胞比率大幅下降,恢復(fù)至基本與Bev及Osi單獨(dú)處理組的水平,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A為各組ROS水平變化情況;B為加入NAC后各組凋亡細(xì)胞變化情況。

2.4 Bev與Osi聯(lián)合使用通過調(diào)控細(xì)胞中的p38/ERK信號通路來誘導(dǎo)大幅凋亡

針對ROS調(diào)控的p38/ERK信號通路進(jìn)行了檢測,從圖4A中可以看出,Bev與Osi聯(lián)合使用后,細(xì)胞中p-p38的表達(dá)水平上升,p-ERK的表達(dá)水平下降,與空白對照組、Bev組、Osi組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨后,本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了1/2 IC50值Bev單獨(dú)處理及1/2 IC50值Osi單獨(dú)處理對A549細(xì)胞中p38/ERK信號通路的影響,結(jié)果如圖3 B所示,低水平的Bev與Osi不會影響A549細(xì)胞中的p38/ERK信號通路。

A為Western Blotting法檢測各組細(xì)胞中p38/ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化情況;B為A圖蛋白的定量分析;C為Western Blotting法檢測低濃度Bev與Osi單獨(dú)處理對A549細(xì)胞中p38/ERK通路相關(guān)蛋白的影響;D為C圖蛋白的定量分析。

3 討論

根據(jù)期刊A Cancer Journal for Clinicians(CA)公布2023年癌癥數(shù)據(jù),肺癌是全球癌癥的首要死因,每天350人死于肺癌[6]。手術(shù)切除、放化療、靶向治療及免疫治療是肺癌臨床治療的主流方法。Bev能夠抑制腫瘤血管的生成從而阻斷腫瘤營養(yǎng)供給,但其會帶來的高血壓、心臟毒性等較強(qiáng)的副作用[7]。Osi是屬于第三代酪氨酸激酶抑制劑,它通過抑制腫瘤細(xì)胞中的EGFR激活來發(fā)揮抗腫瘤作用,同時Osi使用后存在痤瘡樣皮疹、鼻腔出血及耐藥等副作用,也更有大批患者還沒等耐藥的出現(xiàn),就因經(jīng)濟(jì)原因無奈中止治療[8]。單藥大劑量使用會出現(xiàn)較多的副作用和耐藥性的問題,單藥小劑量不能發(fā)揮藥物的藥效價值,因此尋找新的治療方案已經(jīng)成為當(dāng)前肺癌治療中迫在眉睫的關(guān)鍵[9]。聯(lián)合使用不同的藥物,能夠在降低用藥劑量的同時最大限度發(fā)揮藥物的作用。因此在本研究中,首先針對Bev及Osi對A549細(xì)胞的IC50值進(jìn)行核定,得出數(shù)值后將聯(lián)合處理組的使用劑量調(diào)整為8.9 μmol·L-1Bev+6.7 μmol·L-1Osi,可以看出聯(lián)合處理組對A549細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng),同時在對正常肺部細(xì)胞的毒副作用檢測中,聯(lián)合處理組的毒副作用更小,初步證明聯(lián)合使用較兩種藥物單獨(dú)使用具有高效低毒的效果。

誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是每一種抗癌藥物發(fā)揮藥效的關(guān)鍵。線粒體依賴性凋亡是最為經(jīng)典的凋亡信號途徑。Cyt-c、Bax等促凋亡因子隨著線粒體膜電位的降低釋放出來,從而使Caspase-3蛋白被剪切,引發(fā)細(xì)胞凋亡[10]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出:聯(lián)合處理組中凋亡細(xì)胞比率大幅增加,與Bev及Osi單藥處理組相比分別增加45.7%和42.6%,在線粒體膜電位的檢測中,聯(lián)合處理組的膜電位較Bev及Osi單藥處理組分別降低19.4%和18.3%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。隨后Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,聯(lián)合處理組的Bax及Caspase-3的表達(dá)水平升高程度及Bcl-2的表達(dá)水平下降程度均大于單藥處理組,說明低濃度聯(lián)合用藥能夠加大對A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

活性氧在機(jī)體中扮演著重要的角色,有研究指出,當(dāng)機(jī)體中活性氧水平上升時,會抑制癌細(xì)胞的增殖和血管的生成,近幾年來流行的高壓氧艙治療也直接印證了這一理論。研究證明,上調(diào)ROS水平能夠通過調(diào)控多條信號通路蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,因此調(diào)控ROS水平也是誘導(dǎo)凋亡的重要手段[11]。在本研究中,Bev及Osi單藥處理組中ROS水平無明顯的變化,但是在聯(lián)合處理組中ROS水平明顯上升,與其他3組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。為了驗(yàn)證聯(lián)合處理組引起的大幅細(xì)胞凋亡是否為通過上調(diào)ROS水平所達(dá)到的,加入了ROS清除劑NAC,隨后又檢測細(xì)胞凋亡情況,可以看出當(dāng)聯(lián)合處理組加入NAC后,凋亡細(xì)胞數(shù)量大幅下降,基本恢復(fù)到Bev及Osi單藥處理組相當(dāng)?shù)乃?因此可以判斷兩藥聯(lián)合使用是通過上調(diào)ROS水平來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡來發(fā)揮作用的。

絲裂原活化蛋白激酶是一類蛋白激酶,主要包括ERK、JNK和p38 3個亞族,調(diào)控著細(xì)胞的生長、分化和凋亡等多項(xiàng)生命進(jìn)程[12]。p38的磷酸化上調(diào)剪切過的Caspase-3的表達(dá),誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。ERK的磷酸化在多種腫瘤類型的分化、凋亡和血管生成中發(fā)揮重要的作用,同時這兩條信號通路能夠調(diào)控著Bcl-2家族蛋白及Caspase家族蛋白進(jìn)而多種癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。并且研究表明ROS能夠直接調(diào)控p38及ERK信號通路,當(dāng)ROS上升時,p-p38的表達(dá)會增加,p-ERK的表達(dá)會抑制[13]。在本研究中聯(lián)合處理組中的p-p38的表達(dá)上升,p-ERK的表達(dá)被抑制,而這一變化在Bev及Osi單藥處理組中是沒有的。隨后,本研究驗(yàn)證了1/2 IC50值Bev單獨(dú)處理及1/2 IC50值Osi單獨(dú)處理對A549細(xì)胞中p38/ERK信號通路的影響,結(jié)果顯示低水平的Bev單獨(dú)使用或者Osi單獨(dú)使用不會影響A549細(xì)胞中的p38/ERK信號通路蛋白的變化。因此可以說明,聯(lián)合用藥能夠調(diào)控p38/ERK信號通路蛋白進(jìn)而調(diào)控下游的凋亡通路。

4 結(jié)論

小劑量Bev與Osi聯(lián)合可上調(diào)細(xì)胞中ROS水平,進(jìn)而調(diào)控p38/ERK信號通路蛋白的磷酸化。進(jìn)而調(diào)控Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外,二者聯(lián)合使用還能降低線粒體膜電位,激活線粒體依賴性凋亡途徑,進(jìn)一步促使A549細(xì)胞的凋亡。本研究初步證明了Bev與Osi聯(lián)合使用具有較強(qiáng)的開發(fā)潛力,聯(lián)合用藥在肺癌治療提供了一定的理論依據(jù),但仍然需要更進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來進(jìn)行反復(fù)印證,以期更好地服務(wù)肺癌的研究。