閆淑芳,袁慧娟

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 開封 475000;2.河南省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 鄭州 450003)

糖尿病作為慢性代謝性疾病,發(fā)病率逐年上升,尋求新的治療方法十分必要。大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可通過轉(zhuǎn)染胰腺轉(zhuǎn)錄因子被成功分化為胰島素分泌細胞(insulin-producing cells,IPCs)。胰腺的轉(zhuǎn)錄因子是控制胰腺的分化、發(fā)育、增殖和凋亡的關(guān)鍵基因。胰十二指腸同源盒1(pancreatic duodenal homeobox 1,Pdx-1)作為胰腺分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其外源性表達可以誘導(dǎo)非β細胞表達胰腺β細胞的相關(guān)基因,尤其是胰島素基因[1-2]。前期研究已經(jīng)證實Pdx-1可誘導(dǎo)BMSCs轉(zhuǎn)分化為IPCs。另一個關(guān)鍵因子神經(jīng)元素3(neurogenin,Ngn3)激活并啟動上皮祖細胞分化為胰腺內(nèi)分泌細胞[3]。V型肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A(V-type tendon fibrosarcoma oncogene homolog A,MafA)主要功能是在Pdx-1基因表達的前提下反式激活胰島素相關(guān)基因的表達,參與胰腺β細胞的形成以及維持胰腺β細胞的功能。前期研究成功應(yīng)用Pdx-1、Ngn3和MafA共轉(zhuǎn)染BMSCs誘導(dǎo)為IPCs,且具有胰島素分泌細胞的特性[4],那么分化的細胞移植到糖尿病大鼠體內(nèi)是否具有降低血糖的作用呢?本研究擬通過Pdx-1、Ngn3和MafA共轉(zhuǎn)染BMSCs誘導(dǎo)為IPCs,移植到1型糖尿病大鼠的腎被膜下觀察其療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠60只,雄性,90～120 g,購自鄭州大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室,恒溫18～23 ℃,相對濕度55%～66%,光線明暗各12 h,自由進食進水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要儀器及試劑

腺病毒載體pAd-EGFP、pAd-Cherry、pAd-MafA-EGFP和pAd-Pdx-1-T-Ngn3-Cherry(毒滴度為1010pfu·mL-1)(上海吉凱基因化學(xué)有限公司);高糖培養(yǎng)基、低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司,美國);鏈脲佐菌素、水合氯醛、40 g·L-1多聚甲醛、胰島素抗體(abcam公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)BMSCs

取生長良好的P3代細胞,待細胞融合達50%～60%,pAd-MafA-EGFP和pAd-Pdx-1-T-Ngn3-Cherry以MOI均為30轉(zhuǎn)染BMSCs。常規(guī)培養(yǎng)于體積分數(shù)10%胎牛血清、4.5 mmol·L-1葡萄糖DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱,每日倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及熒光表達情況,每2 d換液1次,每次換液前用磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗細胞兩遍。

1.3.21型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食12 h,腹腔一次性注射鏈脲菌素(55 mg·kg-1),3 d后監(jiān)測每日血糖,選取連續(xù)7 d測空腹血糖>16.65 mmol·L-1作為1型糖尿病大鼠模型[5]。45只SD大鼠均造模成功,造模后1周隨機分組進行移植。15只normal組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.3腎被膜下移植

取P3代BMSCs以及誘導(dǎo)7 d后的IPCS,胰蛋白酶消化備用。15只健康大鼠作為正常對照組,將造模成功的45只SD大鼠隨機分為3組:sham-operation組、BMSCs組、IPCs組。腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠,剝離左側(cè)腎臟,1 mL注射器吸取0.2 mL BMSCs(細胞數(shù)2×106)注射到BMSCs組大鼠的腎被膜下,0.2 mL IPCs(細胞數(shù)2×106)注射到IPCs組大鼠的腎被膜下,sham-operation組和normal組大鼠腎被膜下注射等體積的生理鹽水。

1.3.4移植后監(jiān)測空腹血糖、體重及行IPGTT實驗

移植后第0、7、14、21、28天分別監(jiān)測大鼠的體重和空腹血糖。將大鼠放至捕鼠器中固定,用剪刀剪去少許大鼠尾部尖端,擠出少量血液,滴在血糖試紙凹槽中,記錄血糖儀顯示的血糖數(shù)值。鼠籠放置于天平上,設(shè)置天平歸零,將大鼠放入鼠籠中,觀察讀數(shù)并記錄。移植后21 d,將大鼠禁食12 h,葡萄糖按照每公斤體重2 g灌入大鼠胃內(nèi)[6],注射前及注射后30、60、90 min監(jiān)測大鼠血糖并記錄。

1.3.5免疫組織化學(xué)

移植后第28天按照每公斤體重3 mL水合氯醛麻醉大鼠,完整取出腎臟,生理鹽水沖洗,迅速投入40 g·L-1多聚甲醛固定3 h,取出組織放入包埋盒,切片制片后進行組織化學(xué)染色,顯微鏡下拍照并進行ODI統(tǒng)計比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 移植后大鼠空腹血糖及體重變化情況

移植后第0、7、14、21、28天分別監(jiān)測血糖,BMSCs和IPCs組大鼠血糖隨時間下降,移植第21天兩組大鼠空腹血糖低于移植第0天,且均低于同期sham-operation組(P<0.05),移植第28天,IPCs組大鼠空腹血糖低于BMSCs組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠在移植各階段空腹血糖水平

移植后第0、7、14、21、28天分別稱量各組大鼠體重,移植第28天normal組大鼠體重高于移植第0天(P<0.05),sham-operation組大鼠體重低于第0天(P<0.05),而IPCs組大鼠體重高于移植第0天(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠在移植各階段體重水平

2.2 大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗

糖尿病大鼠葡萄糖耐量試驗曲線下面積大于正常大鼠,但各組糖尿病大鼠間也存在差異,糖尿病大鼠中IPCs組和BMSCs組曲線下面積小于sham-operation組,且IPCs組曲線下面積最小(P<0.05)。見圖1。

A圖為各組大鼠腹腔糖耐量實驗血糖水平曲線;B圖為各組大鼠腹腔糖耐量實驗血糖水平曲線下面積; *P<0.05。

2.3 大鼠腎臟免疫組化

大鼠腎臟免疫熒光顯示,normal組和sham-operation組大鼠腎臟組織未見明顯胰島素表達,BMSCs組和IPCs組大鼠腎臟組織可見棕色熒光的胰島素表達(圖2),BMSCs組和IPCs組胰島素熒光光密度高于sham-operation組(P<0.05),且IPCs組胰島素光密度高于BMSCs組(圖3)(P<0.05)。

A為normal組;B為sham-operation組;C為BMSCs組;D為IPCs組。

圖3 大鼠腎臟免疫組織化學(xué)圖片

3 討論

BMSCs分化為IPCs治療糖尿病成為新的研究熱點,前期研究已證實在體外BMSCs可被 Pdx-1-Ngn3聯(lián)合MafA誘導(dǎo)分化為可分泌胰島素并表達胰島素相關(guān)基因的IPCs[4-5,7]。那么其移植到體內(nèi)能否存活及治療糖尿病大鼠呢?本研究擬通過Pdx-1-Ngn3聯(lián)合MafA誘導(dǎo)BMSCs分化為IPCs,移植到1型糖尿病大鼠體內(nèi),觀察其存活情況及療效。

本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果提示移植組大鼠腎臟組織中存在胰島素分泌,證實移植的細胞可在移植部位存活并發(fā)揮分泌胰島素的功能,進而降低糖尿病大鼠的血糖以及改善高糖毒性所致的體重減輕現(xiàn)象。這與既往研究證實干細胞的可降低糖尿病大鼠的血糖[1]一致。

隨著移植時間的變化,各組大鼠血糖的變化提示移植細胞在體內(nèi)發(fā)揮著降低糖尿病大鼠血糖的作用,且IPCs移植后糖尿病大鼠空腹血糖較其他糖尿病大鼠更低。這與體外實驗發(fā)現(xiàn)的IPCs較BMSCs分泌胰島素的水平高[4]是一致的。相反,各移植組糖尿病大鼠的體重隨時間變化出現(xiàn)增加趨勢,不排除這一現(xiàn)象系糖尿病大鼠高血糖狀態(tài)得以緩解的表現(xiàn),也不排除系糖尿病大鼠的胰島素抵抗得以解除所致[8]。研究顯示干細胞的外分泌及定向趨化作用可修復(fù)受損細胞的功能[9]。

腹腔糖耐量實驗曲線下面積顯示,移植組糖尿病大鼠的腹腔糖耐量實驗曲線下面積小于sham-operation組,考慮可能與干細胞移植后兩方面的作用有關(guān),一是通過降低β細胞周圍的血糖濃度使其高糖毒性解除改善內(nèi)分泌功能,二是通過趨化作用修復(fù)受損的β細胞改善糖尿病大鼠的胰島功能[10]。IPCs組腔糖耐量實驗曲線下面積小于BMSCs組,可能與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控后其分化以及功能更加完善有關(guān)[3,11]。

該研究證實BMSCs體外誘導(dǎo)分化后移植到糖尿病大鼠體內(nèi)可發(fā)揮降糖作用,其創(chuàng)新之處在于,既往研究多選擇尾靜脈、腹腔等部位移植細胞[11-12],對于后續(xù)干細胞的追蹤存在一定的弊端,而本研究采用腎被膜下移植可使干細胞的追蹤易于進行。但其也存在不足之處,例如本研究的大鼠樣本量較小,研究時間較短,難免存在觀察方面的誤差。后續(xù)的研究可進一步加大樣本量,延長實驗觀察時間,也可對移植細胞進行熒光染色進行追蹤。

4 結(jié)論

BMSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)分化后移植到糖尿病大鼠體內(nèi)可發(fā)揮分泌胰島素的功能,從而降低糖尿病大鼠血糖。Pdx-1、Ngn3和MafA聯(lián)合誘導(dǎo)后的IPCs發(fā)揮上述作用較BMSCs明顯增強。