張 琳,賀 真,陸振華,韓 婧,2,周 琦,2,李瑞山,3,孫世偉,4,邵中軍*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系流行病學(xué)教研室 特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710032;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西西安 712046;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅蘭州 730101;4.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040)

蜱(tick)作為僅次于蚊的媒介生物,分布廣泛,全世界報(bào)道超過(guò)800種蜱類[1],在中國(guó)已發(fā)現(xiàn)有硬蜱科和軟蜱科兩大類,包含9屬129種[2],約占全球蜱類總數(shù)的16%。蜱類分布主要呈點(diǎn)狀和帶狀分布,其中東北三省共有2科7屬21種[3],青海省蜱類共有27種[4],貴州省現(xiàn)有2科5屬12種[5]。蜱種的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類主要依據(jù)生殖孔的位置,假頭基、足基節(jié)等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒別,雖然有圖譜可以借鑒,但是容易出現(xiàn)錯(cuò)誤,鑒別難度大[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,將傳統(tǒng)分類和分子鑒定有機(jī)結(jié)合,使分類鑒定更加客觀、準(zhǔn)確,廣泛用于蜱種的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究[7]。核糖體在生物的生命活動(dòng)中起著重要作用,蜱蟲(chóng)的核糖體DNA(ribosomal DNA,rDNA)是由小亞基5.8S和18S,大亞基28S,以及非核糖體編碼區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(分為ITS1和ITS2)和基因間隔區(qū)IGS組成的基因簇[8]。由于核糖體18S和ITS序列在同種蜱的不同地域株間差異小[9],所以被用于蜱種鑒定[10-11]。28S序列在其他物種中也作為研究系統(tǒng)進(jìn)化的特征序列,如舌形蟲(chóng)[12],螨蟲(chóng)[13]。盡管GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所報(bào)道的核糖體基因序列很多,但是對(duì)于陜西省長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalislongicornis)核糖體的報(bào)道很少。本研究對(duì)陜西省渭南市和商洛市長(zhǎng)角血蜱核糖體DNA進(jìn)行擴(kuò)增和比較,對(duì)5.8S、18S、28S、ITS1、ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),研究基因多態(tài)性,從而對(duì)研究蜱蟲(chóng)的種群遺傳結(jié)構(gòu)以及鑒定和分化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 2022年7月于陜西省渭南市和商洛市,采集寄生在綿羊體表的硬蜱。選取渭南市蜱蟲(chóng)8只,商洛市蜱蟲(chóng)8只,編號(hào)01～16。

1.1.2 主要試劑 RLT裂解液(1048449),德國(guó)凱杰QIAGEN公司產(chǎn)品;核酸提取試劑盒(T324),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序,奧科鼎盛生物(北京奧科)公司產(chǎn)品;PremixTaq(R004A),日本TaKaRa BIO公司產(chǎn)品;DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000(3427A),日本TaKaRa BIO公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 體式顯微鏡(RH-2000),日本浩視(HIROX)公司產(chǎn)品;研磨儀(Tissuelyser-32L),上海凈信有限公司產(chǎn)品;全自動(dòng)核酸提取試劑儀(GeneRotex 96),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;普通PCR儀(Gentier 48S),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;核酸電泳儀(164-5050),美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad Laboratories公司產(chǎn)品;全自動(dòng)凝膠成像儀(Gel Doc XR+),美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司產(chǎn)品;常溫離心機(jī)(Pico17),美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;干式恒溫器(K30),杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蜱種形態(tài)學(xué)鑒定 將蜱蟲(chóng)在75%乙醇中洗滌后,在體視顯微鏡下觀察,參考《常見(jiàn)醫(yī)學(xué)蜱螨圖譜》根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 DNA提取 將鑒定后的蜱蟲(chóng)裝入1.5 mL的離心管,加入RLT裂解液、小鋼珠,在65 Hz、500 s條件下進(jìn)行研磨。研磨后在56 ℃的干式恒溫器里進(jìn)行加熱10 min。在12 000 r/min、1 min條件的常溫離心機(jī)中進(jìn)行離心。完成后使用核酸提取試劑盒,按照操作在全自動(dòng)核酸提取試劑儀中進(jìn)行核酸提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 參考美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上的蜱蟲(chóng)核糖體基因組,在軟件MEGA 11上針對(duì)具體序列設(shè)計(jì)引物,并在Oligo 7軟件上進(jìn)行引物評(píng)價(jià)。對(duì)28S序列進(jìn)行分段引物設(shè)計(jì),分為28S1,28S2,28S3共3對(duì)引物。具體的引物序列如表1所示。樣本的PCR體系(共50 μL)含有:25 μL的2×PremixTaq,上游引物1 μL,下游引物1 μL,蒸餾水18 μL,5 μL的模板DNA。18S、ITS1、ITS2、28S1、28S2、28S3序列PCR條件設(shè)置如下:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。5.8S序列PCR條件設(shè)置如下:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠,在220 V、400 mA、30 min的條件下進(jìn)行電泳,檢測(cè)擴(kuò)增效率。合格的PCR產(chǎn)物被送往奧科鼎盛生物公司進(jìn)行雙向一代測(cè)序。

表1 長(zhǎng)角血蜱PCR擴(kuò)增中所使用的引物序列

1.2.4 序列比對(duì)和基因多態(tài)性分析 獲得的DNA序列在MEGA 11軟件中進(jìn)行編輯,28S rDNA序列使用DNA Star軟件中SeqMan模塊進(jìn)行組裝。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載不同種屬蜱的核糖體序列,使用Clustal W算法對(duì)齊所有序列,并刪除未對(duì)齊的側(cè)翼序列,采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ法)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,采用Bootstrap方法,對(duì)每棵樹(shù)進(jìn)行1 000次的重復(fù)測(cè)試,在節(jié)點(diǎn)處顯示百分比?；蚨鄳B(tài)性用DNA Star軟件中MegAlign模塊進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

肉眼觀察,兩地共16只蜱均為雌性。體式顯微鏡鏡下可見(jiàn)雌蜱假頭寬短,無(wú)眼,假頭基呈矩形,須肢第2節(jié)外緣明顯超出假頭基腹面寬短,孔區(qū)呈卵圓形,盾板呈亞圓形,無(wú)花斑,邊緣弧形或微波狀,氣門(mén)板呈圓形,背突短鈍,有后肛溝和緣垛。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為長(zhǎng)角血蜱。

2.2 長(zhǎng)角血蜱各片段電泳結(jié)果

本研究共獲得15條18S序列,7條ITS1序列,16條5.8S,13條ITS2序列,13條28S序列。長(zhǎng)角血蜱18S長(zhǎng)度在1 730 bp左右,ITS1長(zhǎng)度約1 370 bp,ITS2片段長(zhǎng)度在1 620 bp左右,28S-1、28S-2片段長(zhǎng)度在1 200 bp左右,28S-3片段長(zhǎng)度在1 500 bp左右,5.8S片段長(zhǎng)度約175 bp(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;A.18S片段檢測(cè)電泳圖;B.ITS1片段檢測(cè)電泳圖;C.5.8S片段檢測(cè)電泳圖;D.ITS2片段檢測(cè)電泳圖;E.28S片段檢測(cè)電泳圖,其中E1代表28S-1片段,E2代表28S-2片段,E3代表28S-3片段。

2.3 長(zhǎng)角血蜱各序列系統(tǒng)發(fā)育分析

18S序列進(jìn)化樹(shù)顯示,本研究的長(zhǎng)角血蜱所有樣本在同一分支,與河北、云南的長(zhǎng)角血蜱屬于不同分支但同處于一個(gè)亞群分支,與尼泊爾血蜱和其余不同屬的蜱種不在同一分支(如圖2)。18S序列不僅可區(qū)分不同種屬的蜱蟲(chóng),且不同地域的長(zhǎng)角血蜱屬于不同分支。本研究的7條ITS1序列與中國(guó)6地的長(zhǎng)角血蜱ITS1序列同處于一個(gè)進(jìn)化分支,但與羅馬尼亞長(zhǎng)角血蜱同屬于一個(gè)根節(jié)點(diǎn),和其他屬的蜱屬于不同分支(圖3)。ITS1序列不能區(qū)分中國(guó)不同地域的長(zhǎng)角血蜱,但與國(guó)外長(zhǎng)角血蜱屬于不同分支,而且可區(qū)分不同種屬的蜱蟲(chóng)。長(zhǎng)角血蜱5.8S序列與各種蜱比較不能形成單獨(dú)的簇,不能作為區(qū)分蜱種的代表序列(圖4)。ITS2序列進(jìn)化樹(shù)顯示,本研究的長(zhǎng)角血蜱ITS2序列除04號(hào)差異較大外,形成3個(gè)亞群分支,02號(hào)和10號(hào)與中國(guó)和日本其他地區(qū)的長(zhǎng)角血蜱形成同一分支,長(zhǎng)角血蜱與其余種屬的蜱種區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖5)。ITS2序列不能區(qū)分不同地域的長(zhǎng)角血蜱,無(wú)國(guó)內(nèi)外差異,但可區(qū)分不同種屬的蜱蟲(chóng)。本研究的13條28S序列同屬于一個(gè)大的進(jìn)化分支,與其余種屬的蜱蟲(chóng)區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖6)。但由于NCBI上傳的長(zhǎng)角血蜱28S完整序列較少,無(wú)法與其他地域的長(zhǎng)角血蜱進(jìn)行比較,不能判定28S是否能區(qū)分地域株。

▲.為本研究所獲得的序列?！?The sequence obtained in this study.

▲.為本研究所獲得的序列?！?The sequence obtained in this study.

▲.為本研究所獲得的序列?！?The sequence obtained in this study.

▲.為本研究所獲得的序列?！?The sequence obtained in this study.

▲.為本研究所獲得的序列?！?The sequence obtained in this study.

2.4 長(zhǎng)角血蜱核糖體18S、ITS1、ITS2 rDNA基因多態(tài)性分析

應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)長(zhǎng)角血蜱核糖體18S、ITS1、ITS2片段進(jìn)行多態(tài)性分析,如圖7所示。18S序列共有10處堿基位點(diǎn)插入,1處G→T突變(圖7-A)。ITS1序列共有1處堿基位點(diǎn)插入,2處A→G突變,1處G→A突變,1處C→G突變,1處T→C突變(圖7-B)。ITS2序列共有9處堿基位點(diǎn)插入,3處T→C突變,4處G→A突變,3處T→G突變,10處G→C突變,2處C→T突變,4處A→C突變,1處A→T突變,2處C→G突變,1處A→G突變(圖7-C)。

Majority.全部序列中相同位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)最多的序列,圖中省略位點(diǎn)相同的基因比對(duì)區(qū)域;A.18S基因多態(tài)性;B.ITS1基因多態(tài)性;C.ITS2基因多態(tài)性。

3 討論

陜西省報(bào)道的蜱蟲(chóng)有5類屬10多種[14],其中長(zhǎng)角血蜱為優(yōu)勢(shì)種[15]。長(zhǎng)角血蜱傳播多種病原體,危害很大[16]。本研究對(duì)陜西省渭南市和商洛市長(zhǎng)角血蜱共16個(gè)樣本的核糖體DNA進(jìn)行檢測(cè),獲得15條18S序列,7條ITS1序列,16條5.8S,13條ITS2序列和13條28S序列。刁沛文等[8]報(bào)道,蜱蟲(chóng)的18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S片段長(zhǎng)度通常為1 784～1 815 bp,407～2 005 bp,152 bp,955～1 707 bp,3 418～4 005 bp[8]。本文中5.8S序列較報(bào)道的長(zhǎng),為175 bp,其余序列符合報(bào)道長(zhǎng)度。研究報(bào)道5.8S在個(gè)體和物種之間幾乎沒(méi)有差異,18S序列通常作為區(qū)分物種的代表性序列[17-18],ITS序列被報(bào)道用于鑒定微小扇頭蜱[19]。研究結(jié)果顯示,5.8S序列不能在各個(gè)蜱種中進(jìn)行區(qū)分,其余序列均能區(qū)分不同種屬的蜱蟲(chóng),ITS2序列無(wú)地域差異,ITS1和18S序列可區(qū)分國(guó)內(nèi)外地域株,而且18S序列可區(qū)分國(guó)內(nèi)不同地域株。18S序列可作為鑒定長(zhǎng)角血蜱的遺傳標(biāo)記。通過(guò)MegAlign軟件對(duì)長(zhǎng)角血蜱進(jìn)行基因多態(tài)性分析,除18S序列的03、09、11、13號(hào)樣本不存在基因多態(tài)性外,其余18S序列的11個(gè)樣本以及ITS1和ITS2序列的所有樣本均存在多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性與地域環(huán)境有關(guān)[20]。18S較ITS序列多態(tài)性位點(diǎn)少,說(shuō)明不同序列多態(tài)性的區(qū)別與序列的保守性有關(guān),18S序列的穩(wěn)定性也反映了其作為鑒定長(zhǎng)角血蜱的優(yōu)勢(shì),進(jìn)一步證實(shí)18S序列可作為鑒定長(zhǎng)角血蜱的遺傳標(biāo)記?？傊?本研究成功擴(kuò)增得到陜西省長(zhǎng)角血蜱核糖體基因簇單元18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S序列全長(zhǎng),并對(duì)基因多態(tài)性分析,結(jié)果表明18S序列區(qū)分不同地域株能力最強(qiáng),可作為蜱蟲(chóng)分類研究和分子鑒定的有效工具。