黃楠芳 宋 揚(yáng) 郭 娟 賀 琪 吳凌云 張 征 李 曉 常春康 許 峰

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)是一種惡性克隆性造血疾病,主要表現(xiàn)為無效造血、細(xì)胞形態(tài)發(fā)育異常和外周血細(xì)胞減少等骨髓衰竭特征[1, 2]。近年來,MDS的大規(guī)模測(cè)序揭示基因突變是驅(qū)動(dòng)MDS發(fā)生的重要因素,約90%的MDS患者至少攜帶1種基因突變[3]。其中,轉(zhuǎn)錄因子RUNX1(Runt-related transcription factor 1)突變已被證實(shí)發(fā)生在10%～40%的MDS/AML(acute myeloid leukemia)中,可能是MDS發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的驅(qū)動(dòng)因素之一[4, 5]。RUNX1,也稱為急性髓系白血病1蛋白(AML1),是核心結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、造血功能和信號(hào)傳遞等正常生理過程,在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成等異常生命過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用,因此也被認(rèn)為是一種腫瘤標(biāo)志物[6～10]。近年來,有研究報(bào)道,RUNX1突變的AML患者的臨床特點(diǎn),但關(guān)于國(guó)內(nèi)MDS患者的研究較少。本研究通過對(duì)661例初診MDS患者進(jìn)行回顧性分析,研究RUNX1突變的MDS患者的臨床特征、共同突變基因表達(dá)譜及預(yù)后,以期進(jìn)一步優(yōu)化患者的預(yù)后評(píng)估及治療。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:選取2009年1月～2021年2月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院初診的661例MDS患者,其中男性384例,女性277例,年齡11～88歲,中位年齡為60歲。MDS患者的診斷符合維也納最低診斷標(biāo)準(zhǔn)(2016年),并根據(jù)修訂國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IPSS-R)和分子國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IPSS-M)進(jìn)行預(yù)后分組(表1)[11, 12]。在患者診斷時(shí)進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)、血常規(guī)檢測(cè)和基因突變分析。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):2020-YS-236),受試者均簽署知情同意書。

表1 攜帶RUNX1突變MDS患者的臨床特征[n(%),M(Q1,Q3)]

2.高通量二代測(cè)序:高通量二代測(cè)序委托上海金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。抽取初診MDS患者骨髓液3～5ml,置于EDTA抗凝管中短暫儲(chǔ)存,采用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,提取細(xì)胞DNA。采用illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,獲取36個(gè)基因的突變信息。依據(jù)是否發(fā)生突變,將患者分為RUNX1突變組和RUNX1未突變組。

3.染色體核型分析:抽吸初診MDS患者骨髓液2～4ml,并用肝素抗凝,采用24h短期培養(yǎng)法和G顯帶技術(shù)進(jìn)行染色體核型分析,依據(jù)IPSS-R進(jìn)行核型預(yù)后分組。由于RUNX1突變患者被分類為極低危組的例數(shù)較少(IPSS-R 1例;IPSS-M 0例),為便于統(tǒng)計(jì)分析,將IPSS-R≤3.5分的患者歸類為較低危組,>3.5分歸類為較高危組。同時(shí),將IPSS-M合并為3組,即極低危/低危組(包含極低危組、低危組)、中低危/中高危組(包含中低危、中高危組)、高危/極高危組(包含高危、極高危組)。

4.隨訪情況:通過電話、門診及住院病歷進(jìn)行隨訪,隨訪截止時(shí)間為2022年6月,中位隨訪時(shí)間為22(10,61)個(gè)月。失訪患者不納入總體生存及疾病進(jìn)展分析?？傮w生存期(overall survival,OS)是從初診MDS當(dāng)日至患者死亡或隨訪截止時(shí)間。

結(jié) 果

1.RUNX1突變的頻率及位點(diǎn):661例初發(fā)MDS患者中,65例(9.83%)攜帶RUNX1突變,共檢出69個(gè)突變位點(diǎn)。突變位點(diǎn)主要分布于外顯子5號(hào)外顯子(35.38%,23/65)、6號(hào)外顯子(30.77%,20/65)和9號(hào)外顯子(27.69%,18/65),其中4例患者存在不同外顯子的雙突變。根據(jù)突變類型分類,40個(gè)突變?yōu)辄c(diǎn)突變,3個(gè)為剪切位點(diǎn)突變,26個(gè)為移碼突變。中位變異等位基因頻率(variant allele frequency,VAF)為37%。潛在致病的RUNX1突變包括胚系突變和體細(xì)胞突變,由于患者未行自身體細(xì)胞對(duì)照測(cè)序而無法直接區(qū)分突變類別,然而根據(jù)Simon等[13]所報(bào)道的方法,8例患者突變位點(diǎn)為可疑胚系突變(R162*、R166*、R204*和S141*),其中3例患者治療緩解后其他突變消失但RUNX1突變及VAF值幾乎無變化。

2. RUNX1突變患者的臨床特征:RUNX1突變和未突變患者在年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell,WBC)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(absolute neutrophil count,ANC)、血紅蛋白(haemoglobin,Hb)含量和血小板計(jì)數(shù)(platelet,PLT)上比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但RUNX1突變患者多為男性,且骨髓原始細(xì)胞比例(bone marrow blast)較高(χ2=7.348,P=0.007,表1)。RUNX1突變與IPSS-R染色體核型預(yù)后無顯著相關(guān)性。結(jié)果顯示,RUNX1突變患者在IPSS-R較高危組及IPSS-M高危/極高危組中占比較高(χ2=12.627,P<0.001;χ2=46.173,P<0.001)。

3.RUNX1與其他基因的共突變分析:在65例RUNX1突變患者中,59例(90.77%)合并其他基因突變,攜帶其他基因突變的平均數(shù)量高于無RUNX1突變患者(2.17±0.19 vs 1.31±0.05,P<0.001,圖1A)。與年齡<60歲的患者比較,年齡≥60歲的患者合并其他基因突變的數(shù)量更多(2.58±0.26 vs 1.52±0.23,P=0.008,圖1B)。與RUNX1發(fā)生共同突變的基因中,頻率較高的是ASXL1(24.62%,16/65)、TET2(24.62%,16/65)、EZH2(21.54%,14/65)和U2AF1(21.54%,14/65)(圖1C),基因功能類別主要為表觀遺傳學(xué)基因(64.62%,42/65)和剪切子基因(38.46%,25/65,圖1D)。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示,RUNX1突變與EZH2、PHF6和U2AF1突變呈正相關(guān)(Q分別為<0.001、<0.001、0.019)。

圖1 RUNX1共同突變基因分析

4.RUNX1突變對(duì)患者預(yù)后的影響:RUNX1突變的MDS患者中位生存期為16個(gè)月,無RUNX1突變患者中位生存期為47個(gè)月,兩組中位生存期比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖2A)。與RUNX1未突變的MDS患者比較,RUNX1突變患者發(fā)生AML轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)較高(P<0.001,圖2B)。此外,筆者對(duì)影響患者總體生存的因素進(jìn)行探索,并將單因素分析中P<0.05的影響因素納入COX等比例風(fēng)險(xiǎn)模型,結(jié)果顯示,RUNX1突變、年齡和IPSS-R等因素對(duì)患者總體生存仍有顯著影響(表2)。

圖2 RUNX1突變組和未突變組患者生存分析

表2 影響MDS患者總體生存的因素

5.RUNX1主克隆突變和亞克隆突變比較:在合并其他基因突變的59例RUNX1突變患者中,38例(64.41%)患者RUNX1突變?yōu)橹骺寺⊥蛔?21例(35.59%)為亞克隆突變,提示RUNX1突變可能是MDS發(fā)生的早期事件。筆者進(jìn)一步分析了RUNX1主克隆突變和亞克隆突變患者的臨床特征,兩組患者年齡、Blast、WBC、ANC、Hb、PLT、IPSS-R分層、總體生存期及AML轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但亞克隆突變患者多為男性(P=0.011),且合并其他基因突變數(shù)量更多(3.05±0.38 vs 2.03±0.18,P=0.027)。

討 論

RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族是細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程的重要調(diào)節(jié)因子,主要包括RUNX1、RUNX2和RUNX3 3個(gè)家族成員[6, 14]。RUNX1基因位于染色體21q22.12,全長(zhǎng)262kb。RUNX1主要分為3種亞型,轉(zhuǎn)錄自不同啟動(dòng)子,3種亞型均包含128個(gè)氨基酸構(gòu)成的Runt同源結(jié)構(gòu)域(runt homology domain,RHD)[9]。研究發(fā)現(xiàn),RUNX1在維持骨穩(wěn)態(tài)、心臟保護(hù)及血細(xì)胞發(fā)育等正常生理過程中發(fā)揮重要作用[10, 15～18]。不僅如此,RUNX1還參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展,其表達(dá)失調(diào)或突變?cè)诮Y(jié)直腸癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌和胰腺癌等中均有報(bào)道[19～23]。

RUNX1是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的突變基因之一,RUNX1體細(xì)胞突變?cè)贏ML中的發(fā)生率約為10%,在MDS中為7.9%～12.0%,在骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative-neoplasms,MPN)中為2%～4%,在MDS/MPN重疊綜合征約為15%[13, 24]。在一項(xiàng)納入944例MDS患者的研究中,RUNX1突變頻率超過10%,且最常與ASXL1、EZH2和SRSF2基因發(fā)生共同突變,且RUNX1突變患者總體生存期較短[3]。Kaisrlikova等[5]在214例低風(fēng)險(xiǎn)MDS患者中發(fā)現(xiàn),RUNX1突變約占7.9%,最常與RUNX1發(fā)生共同突變的基因?yàn)锳SXL1、EZH2和STAG2;RUNX1突變組和未突變組年齡、性別、血紅蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但兩組血小板計(jì)數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在IPSS-R極低危組、低危組和中危組中,RUNX1突變患者中位生存期均明顯縮短。DiFilippo等[24]在499例MDS/MPN重疊綜合征患者中發(fā)現(xiàn)57例(11%)RUNX1體細(xì)胞突變,突變患者多為男性,血小板計(jì)數(shù)較低,骨髓原始細(xì)胞比例較高;共同突變基因包括ASXL1、SRSF2、TET2和NRAS;不同的是, RUNX1突變患者總體生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但無白血病生存期較短。在一項(xiàng)納入51例AML和7例MDS/MPN患者的小型研究中,8例(6例為AML,2例為MDS/MPN)患者存在RUNX1突變,2例RUNX1突變的MDS/MPN患者均存在ASXL1和EZH2突變[25]。

本研究納入661例初診MDS患者,通過二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)RUNX1突變占9.83%(65例),檢出的69個(gè)位點(diǎn)突變分布于5號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、4號(hào)和8號(hào)外顯子。RUNX1突變組與未突變組患者在年齡、WBC、ANC、Hb和PLT上比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在性別和骨髓原始細(xì)胞比例上比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在65例RUNX1突變患者中,59例(90.77%)同時(shí)存在其他基因突變,年齡≥60歲的患者攜帶其他基因突變的數(shù)量更多。較為常見的共同突變基因?yàn)锳SXL1(24.62%)、TET2(24.62%)、EZH2(21.54%)和U2AF1(21.54%),功能分類主要為表觀遺傳學(xué)基因(63.64%)和剪切子基因(37.88%)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),RUNX1突變與EZH2、PHF6和U2AF1突變呈正相關(guān)。此外,RUNX1突變患者中位生存期較短,AML轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)較高,預(yù)示著RUNX1能夠?qū)DS患者預(yù)后產(chǎn)生不利影響。

本研究結(jié)果基本符合既往研究報(bào)道,由于研究對(duì)象受地區(qū)、人種、納入標(biāo)準(zhǔn)和納入數(shù)量等因素影響,且實(shí)施二代測(cè)序的目的基因種類和方法存在差異,故研究結(jié)果在血小板計(jì)數(shù)、共同突變基因的優(yōu)先級(jí)等方面略有出入。本研究揭示了RUNX1在MDS患者隊(duì)列中的臨床特征、共同突變基因表達(dá)譜及預(yù)后意義,然而也存在一定的局限性。首先,RUNX1致病性突變包括胚系突變和體細(xì)胞突變,兩種突變?cè)诨颊甙l(fā)病年齡、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和預(yù)后等方面有一定差異[13]。但本研究未行患者自身體細(xì)胞對(duì)照測(cè)序而無法明確突變類別,因此無法對(duì)兩種突變方式進(jìn)行深入分析。其次,由于MDS是一種高度異質(zhì)性疾病,患者的危險(xiǎn)分層對(duì)治療方案選擇意義重大[26]。本研究?jī)H初步分析了RUNX1突變患者在IPSS-R和IPSS-M預(yù)后分組的情況,未來仍需進(jìn)一步研究RUNX1及其共同突變基因在不同危險(xiǎn)分層中的意義,以進(jìn)一步優(yōu)化危險(xiǎn)分層,指導(dǎo)治療及評(píng)估預(yù)后。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。