陳 弋，孫青?，黎 翔，孫 旸，劉 霞 （.海軍軍醫(yī)大學藥學系臨床藥學教研室, 上海 00433；.先導物成藥性研究全國重點實驗室，上海 003）

0 前言

肥胖是因體內(nèi)脂肪過度蓄積導致健康損害的一種機體狀態(tài)。目前已證實與肥胖相關聯(lián)的疾病多達21 種，廣泛涉及心血管、消化、呼吸、神經(jīng)、肌肉骨骼等系統(tǒng)相關疾病甚至傳染性疾病[1]。根據(jù)2023 年3 月世界肥胖聯(lián)盟（WOF）公布的《2023世界肥胖地圖》，預計到2035 年，肥胖或超重（WHO標準BMI≥25 kg/m2）率將達到51%，引起的經(jīng)濟損失超過4 萬億美元[2]。中國同樣面臨肥胖發(fā)病率逐年增高的嚴峻問題，根據(jù)最新報道，按照中國人的BMI 分 級（BMI≥24 kg/m2），我 國 目 前 已 有34.8%的人超重，14.1%的人肥胖[3]。而我國上市的關于肥胖的治療藥物卻屈指可數(shù)，自2007 年脂肪酶抑制劑奧利司他獲批以來，只有胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑利拉魯肽和貝納魯肽于2023 年7 月獲批超重（肥胖）適應證[4]。但這兩類藥物仍存在各自的弊端：奧利司他因嚴重脂肪瀉導致部分患者不耐受，且因減肥效果有限而不被推薦用于合并并發(fā)癥的肥胖治療[5]；利拉魯肽和貝納魯肽減肥效果優(yōu)異[6]，但需注射給藥且價格昂貴，近期還有報道稱此類藥物胃腸道不良反應遠比其公布的要嚴重[7]，并有可能增加腸梗阻風險，甚至使少數(shù)使用者產(chǎn)生自殺念頭[8]。因此，研發(fā)可有效治療肥胖且不良反應小的藥物對治療肥胖、減少并發(fā)癥具有重要的意義。

研究人員前期發(fā)現(xiàn)，脂肪因子血清類粘蛋白（ORM）可作用于下丘腦瘦素受體，抑制攝食并調(diào)控能量平衡[9]，是潛在的減重藥物研發(fā)靶點（專利號：ZL201510230870.2）。但ORM 為高度糖基化的大分子蛋白質(zhì)，制備困難且需注射給藥，限制了其藥物開發(fā)前景。研究人員前期篩選到一個全新小分子化合物HMS-01，該化合物由大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥紅霉素改造而來，為一種未上市的在研新藥，可顯著升高ORM 并降低肥胖小鼠體質(zhì)量，且具有可經(jīng)消化道用藥、無抗菌活性的特征，有望為藥物治療肥胖開辟新賽道。

根據(jù)創(chuàng)新藥物臨床前研究的國際國內(nèi)指導原則[10-11]，新藥上市前需通過藥效學和毒理學研究評估藥物的有效性和安全性，其中，遺傳毒性研究是毒理學研究的重要部分。遺傳毒性是指化合物能直接或間接損傷生物體遺傳物質(zhì)，造成基因改變或突變，危及生物體及其后代健康。近年來，因具有致突變性而引起的藥品召回事件時有發(fā)生[9]。本研究通過鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames 試驗）對該化合物的遺傳毒性進行實驗探究，以期為創(chuàng)新藥物的遺傳安全性及其臨床前毒理學評估提供支持。

1 實驗材料

1.1 受試樣品及對照品

受試樣品：HMS-0（西安秦申嘉合藥物研究有限公司，批號20190127，純度98%）。陰性對照品：二甲基亞砜（DMSO，Sigma-aldrich，CAS:67-68-5）。陽性對照品：吖啶誘變劑ICR-191（Sigma-aldrich，CAS：17070-45-0）、2-硝基芴（Sigma-aldrich，CAS：607-57-8）、疊氮鈉（Sigma-aldrich，CAS：26628-22-8）、甲基磺酸甲酯（Sigma-aldrich，CAS：66-27-3）、2-氨基蒽（Sigma-aldrich，CAS：613-13-8）。

1.2 主要試劑及配制方法

營養(yǎng)肉湯（賽默飛，CM0067）；磷酸鹽緩沖液（生工生物）；頂層瓊脂培養(yǎng)基（Solarbio，貨號：LA3080） ；底層培養(yǎng)基（Solarbio，貨號：3090）；S9混合液溶劑（按照180 ml 試驗用量配制）：氯化鉀（生工生物，CAS：7447-40-7）6.6 mmol、氯化鎂（生工生物，CAS：7791-18-6）1.6 mmol、葡糖-6-磷酸（Sigmaaldrich，CAS：3671-99-6）1 mmol、輔酶Ⅱ（Sigmaaldrich，CAS：24292-60-2）0.8 mmol、0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（20×PBS 緩沖液，Solarbio，貨號：P1032）120 ml、去離子水定容至180 ml；S9混合液： 代謝活化系統(tǒng)S9是經(jīng)苯巴比妥/β-萘黃酮誘導的雄性SD 大鼠肝勻漿上清液制備而成，購自Molecular Toxicology，使用前與S9溶劑按照1∶9（V/V）的比例配制。

1.3 主要儀器設備

全自動 Ames 實驗儀（北京慧榮和科技有限公司，型號：HRH-AMES116）；全自動菌落分析儀（杭州澤析生物科技有限公司，型號：DTS3）；倒置顯微鏡[徠卡貿(mào)易（上海）有限公司，型號：Leica DMi8 M/C/A]。

1.4 試驗菌株

此次試驗所使用的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535，購自Molecular Toxicology 公司，符合實驗要求。

2 方法

根據(jù)毒理學研究的國際標準[12-13]，設計制定Ames 試驗以檢測受試藥物HMS-01 的遺傳毒性。Ames 試驗亦稱細菌回復突變實驗，是利用傷寒沙門氏菌具有回復突變的特性，以鑒定受試物是否具有致突變性的一種試驗方法。his-鼠傷寒沙門氏菌，因不能自主合成組氨酸而不能在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長，但在外界致突變因素的作用下可突變?yōu)槟茏灾骱铣山M氨酸的原養(yǎng)型沙門氏菌，從而能在無組氨酸的培養(yǎng)基上正常生長。因此，可通過觀測其經(jīng)受試物作用后，在無組氨酸培養(yǎng)基上的菌落生長情況來判定受試物是否具有致突變毒性。

試驗結果要求應滿足以下條件：①陰性對照組的回復突變菌落均數(shù)在歷史陰性/溶媒對照范圍內(nèi)；②陽性對照組的回復突變菌落均數(shù)為其對應的陰性對照組的3 倍以上；③污染平皿數(shù)不超過平皿總數(shù)的5%。

2.1 試驗菌鑒定及擴增培養(yǎng)

5 種試驗菌（TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535）應具備表1 所示的特性，因此于實驗前進行如下生物學特性鑒定 ：his-鑒定、脂多糖屏障缺陷（rfa 突變）鑒定、氨芐青霉素抗性（菌株R 因子缺失）鑒定、紫外線敏感性（ΔuvrB 突變）鑒定、四環(huán)素（pAQ1）抗性的鑒定、自發(fā)回變菌落數(shù)（his+）測定 、對陽性誘變劑的回變敏感性測定，以確定試驗菌株符合試驗標準。

表1 各試驗菌株生物學特性

取鑒定合格試驗菌分別接種于裝有7 ml 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，于（35±2） ℃、（120±25） r/min條件下在空氣恒溫震蕩器中擴增培養(yǎng)16～18 h，使用酶標儀檢測菌液光密度并估算活菌濃度，待濃度達1×109個/ml 以上時可用于試驗。

2.2 試驗分組

設置6 個HMS-01 實驗組，最高劑量為HMS-01 5 000 μg/皿，其下等比稀釋設置5 個劑量組分別為1 666.7、555.6、185.2、61.7、20.6 μg/皿。除此之外，另設置空白對照組及各菌對應的陽性對照組，分組情況見表2。

表2 各試驗菌對應的陽性誘變劑及劑量

2.3 平板滲入法

用全自動Ames 實驗儀進行試驗，即2 ml 融溶狀態(tài)下的頂層瓊脂培養(yǎng)基與下列物質(zhì)混合：0.5 ml S9混合液或0.5 ml 磷酸鹽緩沖液、0.1 ml 對應受試藥品、0.1 ml 擴增菌液，迅速混勻，室溫靜置，待平皿凝固后倒置于（37±1） ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48～72 h。各組共設置3 個平行皿，重復試驗1 次。

2.4 試驗結果觀察及判定

培養(yǎng)結束后肉眼或顯微鏡下觀察各皿的受試藥品是否有析出以及背景菌斑的生長情況，并計數(shù)各平行皿的回變菌落數(shù)。每個組分別求均值，并將結果以（±s） 的方式列出，各組平行數(shù)表示為n。

根據(jù)中國食品藥品檢定研究院發(fā)布的《細菌回復突變試驗技術指導原則（征求意見稿）》制定的結果判斷標準，對于TA97a、TA98、TA100 及TA102，其誘導的回復突變菌落均數(shù)大于各自陰性對照組的2 倍，且具有濃度依賴性及可重現(xiàn)性，即可判定為陽性結果；對于TA1535，其誘導的回復突變菌落均數(shù)高出各自陰性對照組的3 倍，且具有濃度依賴性及可重現(xiàn)性，結果可判定為陽性。受試藥品在加S9或不加S9混合液的條件下，經(jīng)上述5 種試驗菌株測定后，只要有1 種試驗菌株為陽性，即可認定該受試藥品的細菌回復突變試驗為致突變陽性，反之則判斷為陰性。

3 結果

3.1 受試樣品析出及背景菌斑生長情況

受試藥品HMS-01 在有S9處理條件下的TA97a和TA1535 菌株實驗中，1 666.7 和5 000 μg/皿濃度組有觀察到鏡下非干擾沉淀，其余所有處理條件均未觀察到供試品沉淀，結果見表3。所有試驗組均未觀察到背景菌斑抑制現(xiàn)象。

表3 HMS-01 細菌回復突變試驗結果(n=3)

3.2 回復突變菌落數(shù)

受試藥品HMS-01 在所有處理條件下的回復突變菌落平均數(shù)均小于各自陰性對照組的2 倍，且無濃度依賴性升高，結果見表4。本次試驗條件中，在有（或無）代謝活化條件時，受試品HMS-01對組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535 均無潛在致突變性。

表4 HMS-01 細菌回復突變試驗結果(n=3)

4 討論

遺傳毒性因其對生物體及其后代影響巨大，一直是新藥臨床前毒理學評價的重要組成部分。細菌回復突變試驗由美國加利福尼亞大學B·N·Ames教授于1975 年建立并經(jīng)后來者的不斷發(fā)展完善，也稱為Ames 試驗，現(xiàn)今已成為全球基因毒性測試中的最為公認的方法之一，通常作為體外毒理學測試的第1 步，被廣泛應用于藥物致突變性的初篩檢驗。該試驗以his-的沙門氏菌為指示生物，試驗中包含了加與不加代謝活化系統(tǒng)，通過該菌特定的生物效應能檢測基因突變，對受試物的遺傳毒性進行分析。本研究利用細菌回復突變試驗對受試藥物HMS-01 遺傳毒性進行評價，結果顯示，HMS-01 在有（或無）代謝活化條件下，均無致突變性，未發(fā)現(xiàn)其具有遺傳毒性。該結果將為HMS-01 的后續(xù)新藥研發(fā)提供有力支撐。