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        基于解吸電噴霧質(zhì)譜成像技術(shù)分析番紅花球莖中代謝物的組織分布

        2024-04-30 08:17:24謝星光馮坤苗陸穎潔海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室上海200433
        藥學(xué)實(shí)踐雜志 2024年4期
        關(guān)鍵詞:番紅花蜀黍頂芽

        陳 希,謝星光,馮坤苗,陸穎潔,韓 婷 (海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室, 上海 200433)

        西紅花,為鳶尾科多年生植物番紅花(Crocus sativusL.)的干燥柱頭,具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效[1]。番紅花是三倍體不育植物,只能通過被稱為球莖的塊狀球莖無性繁殖。西紅花的產(chǎn)量和品質(zhì)與球莖大小直接相關(guān)[2]。而球莖中包含的有機(jī)酸、脂肪酸、萜類等化合物[3]與球莖生長代謝過程密切相關(guān),并在很大程度上影響球莖的大小。然而,目前球莖中內(nèi)源性代謝物的分析方法均需要將樣本進(jìn)行勻漿后檢測,這就會造成空間信息的丟失,無法實(shí)現(xiàn)原位分析。因此,利用新的技術(shù)手段研究番紅花球莖中內(nèi)源性代謝物的空間分布規(guī)律至關(guān)重要。

        解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像(DESI-MSI)無需復(fù)雜的預(yù)處理步驟,可直接對樣品進(jìn)行可視化分析[4]。目前已在解析植物內(nèi)源性代謝物的空間定位方面顯示出強(qiáng)大的分析能力。本研究通過優(yōu)化切片厚度,建立了一種靈敏、高覆蓋的質(zhì)譜成像分析方法,以可視化番紅花球莖中內(nèi)源性代謝物在不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地不同部位的空間分布,實(shí)現(xiàn)了番紅花球莖中黃酮、有機(jī)酸、氨基酸、類胡蘿卜素和環(huán)烯醚萜苷的原位表征。為探究番紅花全生命周期內(nèi)的生長過程和開展番紅花球莖種質(zhì)篩選提供了新的技術(shù)支持。

        1 材料和方法

        1.1 儀器和試劑

        1900-冷凍切片機(jī)(浙江益迪醫(yī)療科技有限公司);SYNAPT G2-Si HDMS 質(zhì)譜成像儀、HD Imaging質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)分析軟件 (Waters 公司);標(biāo)準(zhǔn)級顯微鏡載玻片(上海泰坦科技股份有限公司)。

        OCT 包埋劑(美國櫻花SAKURA 公司);甲醇(HPLC 級,美國Merck 公司)。

        1.2 樣品收集和前處理

        番紅花球莖分別購自上海崇明、浙江建德和安徽亳州西紅花種植合作社,批號分別為20230901SH、20230830ZJ、20230830AH,經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)韓婷教授鑒定。將新鮮球莖置于冷凍切片機(jī)中預(yù)冷30 min之后,用OCT 包埋劑固定于切片機(jī)樣品托上。連續(xù)切片,分別制備成20、30、40、50 μm 的切片,黏附于載玻片上,在室溫下干燥20 min 后備用。

        1.3 DESI 質(zhì)譜成像分析

        將準(zhǔn)備好的組織切片置于X 軸和Y 軸二維操控臺上,使用SYNAPT G2-Si HDMS 質(zhì)譜成像儀在正離子模式下進(jìn)行檢測。檢測的質(zhì)荷比(m/z)范圍設(shè)定為50~650;空間分辨率為200 μm;施加在電噴霧針上的電壓為3.0 kV;電噴霧針與二維操控臺的角度為38°;離子傳輸管溫度為100 ℃;二維操控平臺移動速度為200 μm/s。質(zhì)譜成像原始數(shù)據(jù)文件利用HD imaging 軟件轉(zhuǎn)化成圖片,用總離子流圖進(jìn)行歸一化。

        2 結(jié)果和討論

        2.1 切片厚度的優(yōu)化

        組織切片是獲得高質(zhì)量質(zhì)譜成像圖像的關(guān)鍵步驟[5]。組織切片的厚度會影響切片的完整性,如果碎裂就無法獲得完整的空間分布圖像[6]。質(zhì)譜成像在動物、人體內(nèi)源性代謝物的可視化分布研究起步較早。對于哺乳動物組織,推薦5~20 μm 作為檢測低分子量的最優(yōu)厚度[7]。然而受限于植物組織富含水分,組織容易破碎的特點(diǎn),難以制成薄片。為了獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖片,本研究進(jìn)行了切片厚度的優(yōu)化。在番紅花球莖中,除了水分之外,淀粉是其干物質(zhì)的重要組成之一[8],因此切片時成形性較差,極易造成組織破碎、結(jié)構(gòu)不完整。本研究選用在20~50 μm 之間的浙江建德球莖,以10 μm為梯度,進(jìn)行了4 個不同的切片厚度探索。結(jié)果表明,切片厚度為20 μm 時,頂芽部位存在大部分缺失,球莖部分也存在部分碎裂;30 μm 和40 μm時,頂芽的部位切片完整,但球莖部分仍然不完整,其中40 μm 球莖完整度好于30 μm;而50 μm 切片整體完整度較高,能良好的呈現(xiàn)球莖和頂芽形態(tài)(圖1)。因此本研究選擇50 μm 切片厚度進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜成像檢測。

        圖1 不同切片厚度的優(yōu)化

        2.2 代謝物在球莖不同部位中的分布特征

        使用優(yōu)化的條件直接進(jìn)行DESI-MSI 檢測,獲得球莖切片在正離子模式下的平均質(zhì)譜圖,如圖2所示,可以觀測到豐富的信號峰,其中,m/z范圍在150~400 之間信號豐度較高,在450~650 范圍內(nèi)也觀察到不少代謝物,但是豐度較低。用總離子流圖進(jìn)行歸一化后在HD imaging 軟件中提取質(zhì)荷比,結(jié)合數(shù)據(jù)庫和已報道文獻(xiàn)檢索,共獲得了66 種化合物的空間分布信息。其中,觀察到代謝物在球莖的不同部位具有不同的分布特征。

        圖2 番紅花球莖在正離子模式下的DESI 質(zhì)譜圖

        值得關(guān)注的是,芹菜素7-(6''-O-乙?;?葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷幾乎只分布在頂芽中;芹菜素7-O-二葡糖醛酸同樣主要分布在頂芽中,球莖部分也有少量分布(圖3)。蜀黍氰苷是廣泛分布于植物界的一種含氮化合物,通過在食草動物的組織破裂時釋放氰化氫而起到化學(xué)防御作用[9]。在萌發(fā)的高粱種子中,發(fā)現(xiàn)蜀黍氰苷主要積累在萌發(fā)的胚芽中[10]。本研究中觀察到蜀黍氰苷主要在番紅花球莖萌發(fā)的頂芽中分布,與文獻(xiàn)報道一致,其分布的特異性可能是由于對抗食草動物從而保護(hù)新興的組織。黃酮類化合物作為中藥成分的重要藥效部分,具有一定的抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等作用[11]。異鼠李素-3-O-葡萄糖苷在西紅花中已有檢測,本次發(fā)現(xiàn)其在頂芽中豐度較高,推測與芽承擔(dān)運(yùn)輸功能有關(guān)。

        圖3 浙江建德番紅花球莖中不同部位代表性代謝物的質(zhì)譜成像圖

        在球莖中,主要觀察到氨基酸和部分次生代謝物的分布,如L-瓜氨酸、苯乙酰甘氨酸、紫苜蓿酚和梔子苷等均只特異性分布在球莖中(圖3)。氨基酸作為一種重要的初生代謝物,不僅在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的角色,還是生物堿合成的重要前體[12]。因球莖是番紅花的營養(yǎng)器官,故氨基酸主要積累于球莖部位,為其生長提供所需物質(zhì)和能量。

        某些化合物在頂芽和球莖中均可以觀察到,如咖啡酸3-葡萄糖苷、咖啡?;野彼?、迷迭香酸和牡荊素(圖3)。有趣的是,酪氨酸除了分布于球莖部分,在頂芽中也有不少分布。研究表明,酪氨酸參與植物色素合成且是生物堿合成的重要前體[12],其在球莖和頂芽中均有分布,說明球莖在萌發(fā)過程中已經(jīng)開始色素和生物堿合成的準(zhǔn)備。

        2.3 代謝物在不同產(chǎn)地番紅花球莖中的分布特征

        總體來說,大多數(shù)化合物都呈現(xiàn)出一致的分布規(guī)律。對于在球莖部位分布的化合物來說,在上海的球莖中豐度最高,浙江次之,安徽最低,但是浙江球莖檢測到的化合物種類最多。此外,我們還觀察到了某些化合物在不同產(chǎn)地具有不同的分布規(guī)律。如梔子苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷和芹菜素7-(6''-O-乙?;?葡萄糖苷在上海球莖中未觀察到分布,而異鼠李素-3-O-葡萄糖苷在安徽球莖中未觀察到分布(圖4)。番紅花喜涼怕酷熱、怕嚴(yán)寒、喜濕潤,對生長環(huán)境要求較高[13]。上海崇明地處中國最大河流長江入海口,氣候溫和濕潤,年平均氣溫16.5 ℃,年平均降雨量1 128.9 mm;浙江建德年平均氣溫17.8 ℃,年降水量1 905.1 mm,氣候同樣溫暖濕潤;而安徽亳州年平均氣溫14.9 ℃,屬溫帶半濕潤氣候區(qū),年平均降雨量僅831 mm。與安徽亳州相比,上海崇明和浙江建德的氣候特點(diǎn)顯然更適于番紅花生長。同時,從光學(xué)照片可以發(fā)現(xiàn),浙江球莖的頂芽分化早于上海和安徽球莖,這可能是浙江球莖內(nèi)代謝物較為豐富的原因之一。

        圖4 不同產(chǎn)地番紅花球莖中代表性代謝物的質(zhì)譜成像圖

        3 結(jié)論

        本文通過優(yōu)化切片厚度,利用DESI 質(zhì)譜成像技術(shù)對不同產(chǎn)地番紅花球莖內(nèi)源性代謝物的分布特征進(jìn)行了可視化研究,實(shí)現(xiàn)了黃酮、類胡蘿卜素、氨基酸和有機(jī)酸的原位表征。不同化合物在球莖不同部位顯示出不同分布,其中蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、芹菜素衍生物主要分布于頂芽中,而作為能量和物質(zhì)供應(yīng)的氨基酸則主要積累在球莖。此外,不同產(chǎn)地的番紅花球莖也存在較大差異。從成像豐度來看,上海的球莖物質(zhì)豐度較高,其次是浙江,安徽豐度最低。就化合物的分布規(guī)律而言,大部分代謝物在不同產(chǎn)地球莖中分布是一致的,但也觀察到了一些差異。如梔子苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷和芹菜素7-(6''-O-乙?;?葡萄糖苷在上海未觀察到分布,而異鼠李素-3-O-葡萄糖苷僅在上海和浙江產(chǎn)地觀察到分布。我們推測,這可能是由于不同地域的溫度、濕度等環(huán)境因素所致。本研究首次可視化了不同產(chǎn)地番紅花球莖中不同物質(zhì)在不同部位的分布特征,為探究番紅花全生命周期內(nèi)的生長過程和開展番紅花球莖種質(zhì)篩選提供了新的技術(shù)支持。

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