徐 飛，陳瑾，李志勇

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理教研室, 上海200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 上海200082）

METRNL（Metrn-like）蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和證實(shí)的新的分泌蛋白[1-2]，其與METRN 構(gòu)成了一個(gè)兩蛋白的新蛋白家族。雖然最初的研究表明，該家族蛋白均可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)[2-4]，但兩者表達(dá)差異很大，METRN 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高特異性表達(dá)，而METRNL 則在全身較為廣泛地表達(dá)，提示其可能具有更廣泛的生理功能[1-2,5-6]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，METRNL 對(duì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。其在脂肪組織中表達(dá)較高，特別是皮下脂肪，被認(rèn)為是一種新的脂肪因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，脂肪細(xì)胞中METRNL 過(guò)表達(dá)可提高全身胰島素敏感性，減少脂肪炎癥擴(kuò)大脂肪細(xì)胞的體積等[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，METRNL 可以在運(yùn)動(dòng)后由肌肉組織增加分泌，促進(jìn)脂肪組織棕色化，從而提高代謝率，減輕體重和改善胰島素敏感性[8]。這些研究提示，METRNL可能與提高胰島素敏感性相關(guān)。

噻唑烷二酮類藥物，如羅格列酮，可以通過(guò)激動(dòng)PPARγ 受體，提高胰島素增敏性，被稱為胰島素增敏劑。但是這類藥物與METRNL 蛋白之間的關(guān)系，至今尚不清楚。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，白色脂肪組織中METRNL 過(guò)表達(dá)可以提高PPARγ 的表達(dá)，促進(jìn)脂肪重構(gòu)，降低白色脂肪炎癥，但是激動(dòng)PPARγ 對(duì)METRNL 表達(dá)的影響尚未有報(bào)道。

本研究擬通過(guò)高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型，檢測(cè)血液METRNL 的濃度變化；通過(guò)給予胰島素增敏劑羅格列酮治療，構(gòu)建胰島素增敏動(dòng)物模型，檢測(cè)血液中METRNL 的水平變化，從而明確激動(dòng)PPARγ 對(duì)血液METRNL 水平影響，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)不同組織中METRNL 的表達(dá)，明確PPARγ 通過(guò)何種組織調(diào)控METRNL 的表達(dá)與血液濃度。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物處理

12 周齡的雄性C57BL/6 小鼠與小鼠飼料，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。為檢測(cè)胰島素抵抗對(duì)METRNL 表達(dá)的影響，分兩組小鼠，每組8 只，分別給予正常飲食（NCD）和HFD，均飼養(yǎng)4 個(gè)月；為了檢測(cè)胰島素增敏對(duì)于METRNL 表達(dá)的影響，分兩組小鼠，每組8 只，兩組均先HFD 飼養(yǎng)3 個(gè)月，而后實(shí)驗(yàn)組的飼料中加入藥物羅格列酮（胰島素增敏組），劑量為10 mg/kg·d，治療1 個(gè)月，對(duì)照組繼續(xù)HFD 飼養(yǎng)1 個(gè)月。

1.2 糖耐量實(shí)驗(yàn)

小鼠禁食18 h，腹腔注射30%葡萄糖溶液（2 g/kg），分別在0、30、60、90、120 min 取尾靜脈血，采用強(qiáng)生血糖儀（OneTouch Ultra）檢測(cè)小鼠血糖水平。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

戊巴比妥鈉麻醉小鼠后（80 mg/kg），心臟取血收集血液，室溫靜置2 h，3 000 r/min 離心20 min，取上清液。采用小鼠METRNL ELISA 試劑盒（購(gòu)自美國(guó)R&D biosystem 公司）檢測(cè)血清中METRNL濃度。操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)

取小鼠附睪周圍白色脂肪、肩胛骨間棕色脂肪、肝臟、腓腸肌、腦組織、腎臟、脾臟組織，采用TRIzol 試劑（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司），按照說(shuō)明書(shū)抽提組織總RNA，用RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自中國(guó)TARARA 公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。1 μg 的cDNA 用于檢測(cè)METRNL 的表達(dá)，GAPDH 作為內(nèi)參。采 用2-ΔΔCt法 與SYBR? Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）試劑，反應(yīng)條件為，95 ℃，5 min, 1 個(gè)循環(huán)；95 ℃, 15 s，60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 相關(guān)引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胰島素增敏劑羅格列酮治療改善了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗

對(duì)HFD 3 個(gè)月的小鼠采用羅格列酮治療1 個(gè)月后，葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其糖耐量情況如圖1 所示，羅格列酮治療組給予葡萄糖后30、60、90、120 min 的血糖濃度均明顯低于單純HFD 組（P＜0.01），說(shuō)明羅格列酮治療明顯改善了小鼠的糖耐量，提高了機(jī)體胰島素敏感性。

圖1 羅格列酮對(duì)全身葡萄糖耐量的影響

2.2 胰島素增敏劑羅格列酮治療升高了胰島素抵抗小鼠血液中METRNL 的水平

取正常對(duì)照組、HFD 組、HFD 羅格列酮治療組小鼠的血清，ELISA 檢測(cè)METRNL 的水平，結(jié)果如圖2 所示，羅格列酮組血清中METRNL 的濃度為（6 632±358） pg/ml，是單純HFD 組（4 271±310） pg/ml 的1.6 倍（P＜0.05）。

圖2 羅格列酮對(duì)血清METRNL 水平的影響

2.3 胰島素增敏劑羅格列酮治療增加棕色脂肪組織和腎臟METRNL 的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)肌肉、肝臟、白色脂肪、棕色脂肪、腦、脾臟、腎臟等組織中METRNL的表達(dá)，結(jié)果如圖3 所示，與單純HFD 組相比，羅格列酮治療組棕色脂肪組織METRNL 表達(dá)升高1.6 倍，腎臟組織METRNL 表達(dá)升高1.3 倍。

圖3 羅格列酮對(duì)各組織METRNL 表達(dá)影響

2.4 羅格列酮治療促進(jìn)了棕色脂肪代謝與棕色脂肪標(biāo)記蛋白的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)棕色脂肪組織代謝與棕色脂肪標(biāo)記蛋白等mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示，與單純HFD 組相比，羅格列酮治療組ERRα、UCP-1、clec10a、Mrc-1、Lipe、LPL、FABP4、CD36、PNPLA2 等因子表達(dá)顯著升高。

圖4 羅格列酮治療促進(jìn)了棕色脂肪中代謝與棕色脂肪標(biāo)記蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究通過(guò)HFD 誘導(dǎo)胰島素抵抗的肥胖小鼠，發(fā)現(xiàn)HFD 可以導(dǎo)致METRNL 血液水平升高。對(duì)肥胖小鼠不同組織METRNL 表達(dá)的檢測(cè)顯示，脂肪組織METRNL 表達(dá)顯著升高。HFD 誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠，給予胰島素增敏劑羅格列酮治療后，小鼠糖耐量改善，同時(shí)，血清METRNL 的濃度也升高。這些結(jié)果說(shuō)明，METRNL 并非胰島素敏感性的特異性指標(biāo)，脂肪可能是使血液METRNL水平改變的主要組織之一。

Li 等研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的脂肪組織METRNL表達(dá)增加[7]。本研究也表明，METRNL 的血液濃度在高脂誘導(dǎo)肥胖后升高。L?ffler 等研究發(fā)現(xiàn)，METRNL 與脂肪細(xì)胞的肥大相關(guān)，而脂肪細(xì)胞肥大被認(rèn)為與PPARγ 活性的降低相關(guān)，是胰島素抵抗的重要標(biāo)志之一，進(jìn)而認(rèn)為METRNL 是機(jī)體胰島素抵抗的標(biāo)志[9]。然而，在本研究中，胰島素增敏劑羅格列酮治療后小鼠胰島素敏感性提高，同時(shí)METRNL 表達(dá)也顯著升高，可見(jiàn)METRNL 血液濃度的升高并不能代表胰島素抵抗的增加。

羅格列酮可以顯著提高胰島素的敏感性，故也稱為胰島素增敏劑。本研究表明，其可以顯著提高M(jìn)ETRNL 的表達(dá)，而METRNL 又具有促進(jìn)白色脂肪棕色化和提高胰島素敏感性的作用，所以METRNL 可能參與介導(dǎo)了羅格列酮的胰島素增敏作用。

我們前期的研究表明，增加白色脂肪表達(dá)可以提高血液中METRNL 的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮未促進(jìn)高脂條件下白色脂肪METRNL 的表達(dá)，在檢測(cè)的7 種組織中，羅格列酮顯著提高了棕色脂肪和腎臟METRNL 的表達(dá)，但是對(duì)脾臟、肝臟、肌肉、白色脂肪、腦組織METRNL 的表達(dá)沒(méi)有影響，說(shuō)明羅格列酮可能主要通過(guò)棕色脂肪和腎臟提高血液METRNL 濃度。此外，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅格列酮促進(jìn)了棕色脂肪中代謝和棕色脂肪標(biāo)記蛋白的表達(dá)，這與以往的研究結(jié)果一致[10]，既往研究表明，METRNL 可促進(jìn)白色脂肪棕色化，提示羅格列酮促進(jìn)棕色脂肪代謝的作用可能有METRNL蛋白參與。

本研究發(fā)現(xiàn)了胰島素增敏劑羅格利酮治療可能通過(guò)提高棕色脂肪和腎組織的METRNL 表達(dá)來(lái)升高血清METRNL 水平，提示METRNL 可能參與了羅格列酮對(duì)糖尿病的治療過(guò)程。