朱鑫宇，白浩然，趙娜萍，戚大川，衛(wèi)立辛，張 黎 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究中心, 上海004；.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海000；.國(guó)家肝癌科學(xué)中心, 上海0805）

肝癌（HCC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尤其在我國(guó)特別高發(fā)，全球HCC 患者超過(guò)半數(shù)在中國(guó)。2022 年我國(guó)HCC 發(fā)病率達(dá)36.77/10 萬(wàn)人，位于惡性腫瘤第4 位；總體病死率達(dá)31.65/10 萬(wàn)人，居惡性腫瘤第2 位[1]。HCC 已然成為我國(guó)一項(xiàng)社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重危害國(guó)民健康，給國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2-4]。目前手術(shù)及肝移植可以臨床治愈早期HCC，但多數(shù)患者診斷時(shí)已是晚期[5]。盡管免疫檢查點(diǎn)抑制劑和小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合治療法為晚期HCC 患者帶來(lái)了希望，但患者的中位生存期僅提高至19.2 個(gè)月[6]。中醫(yī)藥治療晚期HCC 有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以增強(qiáng)化療、靶向、免疫治療療效，減輕毒副作用，改善癥狀，延長(zhǎng)患者總生存期。因此運(yùn)用中醫(yī)藥探索晚期HCC 患者的治療方案，對(duì)阻止該疾病的進(jìn)一步發(fā)展，延長(zhǎng)患者生存期具有重要的意義。

八寶丹起源于明代，至今有近400 年的應(yīng)用歷史，是原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局允許使用天然麝香的特效藥之一。八寶丹成分包含天然牛黃、天然麝香、蛇膽、羚羊角、珍珠、三七等。既往研究已證實(shí)，八寶丹可用于急慢性肝炎、膽囊炎等肝膽系統(tǒng)疾病，具有清熱利濕、祛黃解毒的功效[7-8]，并且八寶丹對(duì)HCC、胰腺癌、膽囊癌等消化系統(tǒng)腫瘤性疾病疾也有治療效果[9-10]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，八寶丹可以通過(guò)抑制慢性炎癥介導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)而抑制HCC 的發(fā)生，但八寶丹對(duì)于晚期HCC 的治療作用機(jī)制尚未明確[11]。因此探尋八寶丹對(duì)晚期HCC 的作用機(jī)制可為中醫(yī)藥治療HCC 提供證據(jù)。

二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠模型是一個(gè)成熟的原發(fā)性HCC 模型。DEN 模型中HCC 的發(fā)展過(guò)程與人類(lèi)HCC 相似，是一種非常合適研究HCC的生物工具[12]。本研究利用DEN 大鼠觀察八寶丹對(duì)HCC 的影響，發(fā)現(xiàn)其能有效延緩HCC 進(jìn)展，但是作用機(jī)制尚不明確。由于八寶丹成分復(fù)雜多樣，需要多組學(xué)分析技術(shù)探明八寶丹中有效藥物成分與疾病的互作關(guān)系，因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和UPLC-MS 方法，篩選八寶丹治療HCC 的有效化合物和潛在治療靶點(diǎn)，構(gòu)建“疾?。颍幬铩钡亩鄬哟尉W(wǎng)絡(luò)，揭示八寶丹調(diào)控疾病進(jìn)展的潛在機(jī)制，為八寶丹的“老藥新用”和HCC 晚期患者的臨床用藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八寶丹膠囊（批號(hào)Z10940006，廈門(mén)中藥廠有限公司）、甲醇（A452-4，F(xiàn)isher）、乙腈（A998-4，F(xiàn)isher）、甲 酸（A117-50，F(xiàn)isher）；DEN（245 437,Sigma-Aldrich）；高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class HF，Water）、色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Water）、PDA 檢測(cè)器（ACQUITY Premier PDA eλ，Water）；高分辨液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（Thermo-Obritrap-QE，Thermo）。

圖1 八寶丹對(duì)HCC 大鼠的影響

圖2 八寶丹通過(guò)多化學(xué)成分和多靶點(diǎn)對(duì)原發(fā)HCC 的影響

圖3 富集分析發(fā)現(xiàn)八寶丹臨床上可能是通過(guò)多途徑影響HCC

1.2 方法

1.2.1 HCC 大鼠模型的建立及分組給藥

將32 只SD 大鼠（6～8 周齡，180～200 g，雄性，SPF 級(jí)）隨機(jī)分為 4 組，每組8 只，分別為：對(duì)照組、八寶丹組、DEN 誘導(dǎo)組（DEN 組）、DEN+八寶丹組。DEN 組和DEN+八寶丹組連續(xù)飼喂12 周DEN 溶液（95 μg/ml）, 對(duì)照組和八寶丹組飼喂滅菌水。八寶丹組不進(jìn)行DEN 誘導(dǎo)，從第12 周開(kāi)始予以八寶丹給藥。DEN 誘導(dǎo)組，DEN 飲水喂養(yǎng)大鼠持續(xù)12 周，誘導(dǎo)HCC 的發(fā)生，然后使用生理鹽水灌胃，1 次/2 d ，持續(xù)4 周。DEN+八寶丹組，DEN誘導(dǎo)HCC 發(fā)生后，八寶丹按照0.5 g/kg 的劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行灌胃，1 次/2 d，持續(xù)4 周（圖1A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死部分大鼠獲取肝臟組織標(biāo)本，剩余部分停藥后繼續(xù)觀察生存期。

1.2.2 UPLC-MS 分析八寶丹中的化學(xué)成分

將八寶丹取出，用液氮研磨均勻后，稱取約98.3 mg 樣本于1.5 ml 離心管中；加入983 μl 甲醇-水溶液（V/V=3∶1，含混合內(nèi)標(biāo)，4 μg/ml），渦旋震蕩1 min，加入鋼珠；放入-40 ℃冰箱中預(yù)冷2 min后，在研磨機(jī)中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴超聲提取60 min，-40 ℃下靜置30 min；離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取全部上清液過(guò)0.22 μm 的有機(jī)相濾膜；4 ℃下靜置過(guò)夜，離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液過(guò)0.22 μm 的有機(jī)相濾膜置于內(nèi)襯管的LC-MS 進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行分析。本次實(shí)驗(yàn)的分析儀器為ACQUITY UPLC I-Class HF 超高效液相串聯(lián)QE 高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件：色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相：水（含0.1%甲酸）和乙腈，梯度洗脫信息詳見(jiàn)表1；流速：0.35 ml/min；進(jìn)樣體積：5 μl；PDA 掃描范圍210～400 nm。質(zhì)譜條件：離子源（HESI，樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式）；數(shù)據(jù)采集模式為DDA；掃描方式為Full MS/dd-MS2（TOP 8）；質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表2。

表1 八寶丹梯度洗脫信息

表2 Thermo-Obritrap-QE 質(zhì)譜參數(shù)信息

1.2.3 八寶丹有效化學(xué)成分篩選策略

八寶丹 UPLC-MS 數(shù)據(jù)由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供，根據(jù)八寶丹化學(xué)成分在210 nm和 254 nm 波長(zhǎng)下的紫外吸收?qǐng)D初步確定其結(jié)構(gòu)類(lèi)型。質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI v3.0 軟件（Nonlinear Dynamics, Newcastle, 英國(guó)）處理（基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化）獲得八寶丹的質(zhì)譜峰表。

1.2.4 八寶丹有效成分鑒定方法

八寶丹的質(zhì)譜峰表中化合的鑒定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片以及同位素分布，并結(jié)合TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，中國(guó)）進(jìn)行鑒定。在本研究中，質(zhì)譜峰表中對(duì)各鑒定物質(zhì)進(jìn)行評(píng)分，滿分80 分，其中，一級(jí)質(zhì)譜精確分子量匹配，20 分；二級(jí)質(zhì)譜碎片匹配，20 分；同位素分布匹配，20 分；保留時(shí)間匹配，20 分。將化合物相對(duì)峰面積的總含量定為100%，得到定性定量結(jié)果數(shù)據(jù)矩陣，并規(guī)定峰面積的比值大于1%，總分大于55，一級(jí)分子量誤差在1.4×10-6以內(nèi)的化合物作為八寶丹的有效成分進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5 八寶丹中有效化學(xué)成分靶點(diǎn)的篩選

根據(jù)前期篩選出的有效化學(xué)成分導(dǎo)入 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)查找與有效活性成分相對(duì)應(yīng)的Smiles 號(hào)，并將Smiles 號(hào)導(dǎo)入 Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）和SuperPred（https://prediction.charite.de/subpa ges）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行有效活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，保留結(jié)合可能性1%以上或文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)與化合物相關(guān)的作用靶點(diǎn)。根據(jù)各成分相關(guān)基因富集情況，利用R（version 3.6.1）構(gòu)建各組分之間互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 HCC 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

使用 GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)和Therapeutic Target Database（https://db.idrblab.net/）篩選HCC 對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，以“Hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選。并根據(jù)文獻(xiàn)比對(duì)，保留與HCC 相關(guān)的靶點(diǎn)用于后續(xù)研究。

1.2.7 有效成分與HCC 互作分析

根據(jù)前期有效成分相關(guān)靶點(diǎn)篩選和HCC 相關(guān)靶點(diǎn)的選擇，取交集進(jìn)行后續(xù)分析。將共同靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再利用Cytoscape3.9.0 軟件，以介數(shù)中心數(shù)為參考，篩選出關(guān)鍵調(diào)控蛋白。

1.2.8 GO 功能注釋及 KEGG 通路富集分析

將有效成分和HCC 之間的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為人，P＜0.01，分別勾選 GO 分析中的生物過(guò)程、細(xì)胞組成 、分子功能以及Pathway 中的 KEGG 進(jìn)行富集分析，提取結(jié)果后，應(yīng)用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平臺(tái)將富集分析結(jié)果可視化。

1.2.9 TCGA 相關(guān)性分析

將有效成分和HCC 之間的共有靶點(diǎn)依次導(dǎo)入GEPIA2 （http://gepia2.cancer-pku.cn/）中，以182例TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中保留的臨床HCC 患者的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分析共有靶點(diǎn)與患者生存期的相關(guān)性。

1.2.10 H&E 染色

大鼠被處死后，用磷酸鹽緩沖鹽水和 4% 多聚甲醛進(jìn)行經(jīng)心灌注。取肝臟組織進(jìn)行病理評(píng)估。石蠟包埋后肝臟切成 5 μm 厚的切片。染色時(shí)將HCC 組織石蠟切片，60 ℃烘烤固片30 min；脫蠟至水，并按照生產(chǎn)商的方案用蘇木精-伊紅染色，最后鏡下觀察各組織病理學(xué)情況。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行方差分析，每次實(shí)驗(yàn)的定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 分析用于進(jìn)行生存期分析。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較各組存活時(shí)間。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 八寶丹延長(zhǎng)原發(fā)HCC 大鼠生存期并減少腫瘤負(fù)荷

在實(shí)驗(yàn)觀察期間，對(duì)照組和八寶丹組的大鼠均存活，而DEN 組平均生存期為17.1 周，DEN+八寶丹組平均生存期為23 周，是DEN 組的1.35 倍（圖1B）。同時(shí)觀察肝臟大體發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和八寶丹組肝臟組織未見(jiàn)異常；DEN 組肝臟組織中均出現(xiàn)大量肉眼可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；而DEN+八寶丹組肝臟組織中雖然出現(xiàn)了部分肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，但大體形態(tài)上相較于DEN 組損傷較輕（圖1C）。通過(guò)對(duì)腫瘤結(jié)節(jié)的最大直徑和數(shù)量測(cè)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)DEN+八寶丹組腫瘤負(fù)荷和最大腫瘤直徑顯著小于DEN 組（圖1D）。同時(shí)，對(duì)各肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估和H&E 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，八寶丹組和正常肝臟組織組織排列緊密，未出現(xiàn)肝臟損傷，而DEN 組出現(xiàn)明顯的組織空泡化，組織間排列彌散，肝臟損傷嚴(yán)重。盡管DEN+八寶丹組大鼠肝臟組織相較于八寶丹組和正常對(duì)照大鼠出現(xiàn)了明顯的炎癥浸潤(rùn)和肝纖維化，但是，相較于DEN 組的肝臟組織損傷較輕且組織排列較為緊密（圖1E）。H&E 染色結(jié)果表明，八寶丹對(duì)大鼠肝臟未發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性病理?yè)p傷，并且緩解了同期DEN 大鼠的肝臟病理狀態(tài)。上述結(jié)果表明，八寶丹能延緩DEN 大鼠的生存期并減少腫瘤負(fù)荷，但是具體機(jī)制尚不明了。

2.2 八寶丹可能通過(guò)多種化合物和多靶點(diǎn)調(diào)控HCC的進(jìn)展

為進(jìn)一步探索八寶丹對(duì)HCC 的影響機(jī)制，本研究首先對(duì)八寶丹進(jìn)行UPLC-MS 中藥化學(xué)成分檢測(cè)。中藥成分鑒定流程如圖2A 所示，將八寶丹顆粒進(jìn)行溶解、研磨、過(guò)濾和提純后上機(jī)檢測(cè)。紫外吸收?qǐng)D譜發(fā)現(xiàn)，210 nm 處皂苷類(lèi)成分在該波長(zhǎng)下有強(qiáng)吸收，254 nm 處含有苯環(huán)、雙鍵等結(jié)構(gòu)的成分在該波長(zhǎng)下有強(qiáng)吸收。然后通過(guò)基峰色譜圖反應(yīng)樣品的整體信息，3 次重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果可知該檢測(cè)方法離子相應(yīng)響度、保留時(shí)間重復(fù)性良好，由此說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)儀器穩(wěn)定、數(shù)據(jù)可靠。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI 軟件處理和TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性后，共發(fā)現(xiàn)851 個(gè)中藥成分，保留9 個(gè)主要活性成分供后續(xù)研究，分別是?；遣菽懰猁}、12-酮脫氧膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨膽酸、三七皂苷R1、環(huán)氧油酸和3α,7α-二羥基-12-羰基-5β-膽烷酸。將主要活性成分信息分別導(dǎo)入PubChem 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得285 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，并繪制出化合物之間的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)八寶丹中主要化學(xué)成分之間關(guān)系密切，相互存在多個(gè)共有靶點(diǎn)（圖2B）。在Therapeutic Target Database、GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中共篩選出與HCC 相關(guān)的靶點(diǎn)637 個(gè)，保留八寶丹與HCC 共有相關(guān)性靶點(diǎn)16 個(gè)（圖2C）作為潛在調(diào)控分子。將潛在調(diào)控分子導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白與蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)（圖2D），再利用Cytoscape3.9.0 軟件，以介數(shù)中心數(shù)（網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過(guò)該節(jié)點(diǎn)的路徑的數(shù)目占最短路徑數(shù)的比例）為參考，將潛在調(diào)控分子進(jìn)行排序，介數(shù)中心數(shù)越大，圓形的直徑越大，顏色越藍(lán)，說(shuō)明在該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)度就越高，反之圓形的直徑越小，顏色越綠（圖2E）。其中，潛在調(diào)控分子介數(shù)中心數(shù)排名前5 的分別是：白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、過(guò)氧化酶增殖因子活化受體-γ（PPARG）和雌激素受體1（ESR1）。

2.3 八寶丹臨床上可能通過(guò)多途徑影響HCC

為探索八寶丹調(diào)控HCC 的潛在作用機(jī)制，本研究基于DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)將上述16 個(gè)共有相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析。GO 富集分析顯示802 個(gè)生物過(guò)程、11 個(gè)細(xì)胞組成、43 個(gè)分子功能，KEGG 通路富集分析共90 條通路，展示排名前10 的富集條目。

圖3A 提示八寶丹在生物過(guò)程中通過(guò)沉默細(xì)胞中mRNA 的轉(zhuǎn)錄，抑制上皮樣細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合調(diào)控HCC；圖3B 提示八寶丹有效化學(xué)成分在細(xì)胞層面上通過(guò)結(jié)合各種細(xì)胞器或細(xì)胞膜受體發(fā)揮作用；圖3C 提示八寶丹有效化學(xué)成分能調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、細(xì)胞因子的分泌及細(xì)胞核的狀態(tài)。圖3D 提示八寶丹調(diào)控HCC 是通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)之間的相互作用。最后在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢了共有相關(guān)靶點(diǎn)與HCC 患者的臨床相關(guān)性，在182 例臨床樣本的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)基因的高表達(dá)提示著患者的總生存期較短，分別為ESR1（LogrankP=0.000 69）、PPARG（LogrankP=0.000 74）和COL18A1（LogrankP=0.006），詳見(jiàn)圖3E～G，P值由Kaplan-Meier 生存曲線和log-rank 檢驗(yàn)確定。

3 討論

HCC 是一種典型的炎癥相關(guān)癌癥，近90%的HCC 與病毒性肝炎、過(guò)度酒精攝入、非酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝引起的長(zhǎng)期炎癥相關(guān)。在HCC 慢性炎癥微環(huán)境中，先天免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞被募集并激活至損傷部位分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，有利于腫瘤細(xì)胞的增殖或抵消凋亡[6]。研究表明，NF-κB 和JAK-STAT 兩條經(jīng)典通路是促進(jìn)HCC 的關(guān)鍵炎癥信號(hào)通路，抑制炎癥通路的激活能有效抑制住HCC 進(jìn)一步進(jìn)展[13]。八寶丹作為傳統(tǒng)中藥復(fù)方，臨床上已發(fā)現(xiàn)對(duì)HCC、胰腺癌、膽囊癌等消化系統(tǒng)腫瘤性疾病疾也有著積極的治療效果，但是具體機(jī)制尚不明了。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，八寶丹可以通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子分泌和減少肝前體細(xì)胞上TRL4 的表達(dá)，從抑制肝前體細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生[11]。因此本研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)八寶丹減緩了原發(fā)性HCC 的腫瘤進(jìn)展。

在本研究中，通過(guò)觀察八寶丹對(duì)DEN 誘癌大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)八寶丹可以延長(zhǎng)DEN 大鼠的生存期，并且緩解DEN 導(dǎo)致的肝臟腫瘤負(fù)荷。但是，目前尚未有具體的機(jī)制闡明這一現(xiàn)象。為探索是八寶丹中何種中藥成分發(fā)揮了作用，利用UPLCMS 技術(shù)檢測(cè)出化學(xué)成分851 個(gè)，鑒定出主要活性成分9 個(gè)，其中大部分是人體膽汁酸中主要成分，也發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)抗炎作用的三七皂苷R1[14]，主要活性成分之間關(guān)系密切。共篩選出285 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。在與HCC 相關(guān)靶點(diǎn)取交集后，篩選出八寶丹調(diào)控HCC 的16 個(gè)潛在靶點(diǎn)。利用上述靶點(diǎn)構(gòu)建了八寶丹“化學(xué)成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型以及PPI 網(wǎng)絡(luò)，將潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)了HCC 小鼠模型已驗(yàn)證能加速HCC 的發(fā)展并影響腫瘤的侵襲性免疫信號(hào)IL-6 和TNF[15]；HCC 中的顯性突變驅(qū)動(dòng)因子TP53 和RB1[16]；與HCC 炎癥相關(guān)的信號(hào)分子STAT3；與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的分子MTOR 和AFP[17]。

GO 富集分析結(jié)果提示，八寶丹調(diào)控HCC 在生物過(guò)程上參與miRNA 對(duì)基因的沉默負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后miRNA 對(duì)基因的沉默負(fù)調(diào)控、RNA 對(duì)基因的沉默負(fù)調(diào)控等；在細(xì)胞組分上富集到RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物、吞噬作用相關(guān)受體、細(xì)胞膜受體等詞條；在分子功能上富集到與轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合，激活核受體，與配體結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG 信號(hào)通路提示，八寶丹參與了癌癥中的蛋白聚糖、乙型肝炎、HIF-1 信號(hào)通路、化學(xué)致癌受體激活、EGFR 絡(luò)氨酸激酶抑制劑耐藥等通路。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，ESR1、PPARG 和COL18A1 高表達(dá)與HCC 患者總生存期密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，PPARG 高表達(dá)可激活WNT/CTNNB1 信號(hào)通路，從而維持腫瘤細(xì)胞干性特征，促進(jìn)癌癥進(jìn)展[18]。人類(lèi)HCC 臨床樣本調(diào)查和組織染色也證實(shí)，ESR1 可通調(diào)控miR-141-3p /GSN 信號(hào)影響原發(fā)性HCC 進(jìn)展[19]；肌成纖維細(xì)胞分泌的膠原α-1（ⅩⅤⅢ）鏈（COL18A1）可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，加速HCC 進(jìn)展[20]。因此TCGA 結(jié)果提示，八寶丹可能是通過(guò)調(diào)控ESR1、PPARG 和COL18A1 來(lái)延長(zhǎng)原發(fā)性HCC 患者的生存期。

綜上所述，本研究證實(shí)了八寶丹對(duì)治療原發(fā)性HCC 的積極影響，并且發(fā)現(xiàn)9 種八寶丹的有效活性成分。還利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，分析揭示八寶丹可能是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路來(lái)調(diào)控原發(fā)HCC，并結(jié)合已有的研究進(jìn)行分析驗(yàn)證，提出新的視角與思路，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。