摘要：目的 了解2020—2022年陜西省手足口病主要病原構(gòu)成情況和流行規(guī)律。方法 收集陜西省各省轄市手足口監(jiān)測病例的核酸檢測結(jié)果和病例資料，分離腸道病毒核酸檢測陽性樣本，并對流行優(yōu)勢病原的腸道病毒VP1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測定和毒株基因亞型鑒定。結(jié)果 2020—2022年陜西省共采集6 352例手足口病例樣本，腸道病毒核酸檢測陽性4 417例（69.54%）。2020年和2021年，以除外EV-A71和EV-A16的其他腸道病毒為主要流行型別，構(gòu)成比分別為95.43%和74.35%；2022年，以CV-A16型為主要流行型別，構(gòu)成比52.88%。對8個省轄市4 145例手足口實驗室確診病例開展其他腸道病毒中CV-A6型和CV-A10型檢測，2020年—2022年CV-A6型在其他腸道病毒的占比分別是75.31%、62.56%和61.15%，是陜西省其他腸道病毒中的優(yōu)勢流行型別。2020—2022年陜西省分離測序毒株239株，CV-A16型151株，CV-A6型72株，CV-A10型6株，CV-A4型2株，CV-B3型8株。CV-A16型和CV-A6型是主要流行型別，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析，CV-A6型以D3亞型為主要流行亞型，CV-A16型以B1a和B1b共存，2021年和2022年B1a亞型占比逐年升高，并取代B1b成為主要流行亞型。結(jié)論 2020—2022年陜西省手足口病較往年處于低流行水平，主要病原以其他腸道病毒、CVA16交替出現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：手足口??；腸道病毒；病原構(gòu)成；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；陜西

中圖分類號：R512.57 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231032

Pathogenic Surveillance of HFMD and molecular epidemic characteristics of major epidemic types in Shaanxi province， China， from 2020 to 2022

DU Yanhua， GUAN Luyuan， FENG Xuan， ZHENG Yuan， YU Pengbo

Shaanxi Center for Disease Control and Prevention， Xi’an 710054， China

Abstract： Objective To investigate the composition and prevalence of hand-foot-mouth disease （HFMD） in Shaanxi province from 2020 to 2022. Methods Nucleic acid detection results and case data of HFMD surveillance cases in cities of Shaanxi province were collected. Positive samples of enterovirus nucleic acid detection were isolated. PCR amplification， sequence determination and gene subtype identification of enterovirus VP1 region of epidemic dominant pathogen were performed. Results From 2020 to 2022， a total of 6 352 samples of HFMD cases were collected in Shaanxi province， and 4 417 samples tested positive for enterovirus nucleic acid， with a positive rate of 69.54%. In 2020 and 2021， other enteroviruses excluding EV-A71 and EV-A16 were the main epidemic types， with a composition ratio of 95.43% and 74.35%， respectively. In 2022， CV-A16 was the main epidemic type， with a composition ratio of 52.88%. CV-A6 and CV-A10 types of other enteroviruses were detected in 4 145 laboratory confirmed cases of HFMD in 8 cities. CV-A6 accounted for 75.31%， 62.56% and 61.15% of other enteroviruses， which was the dominant epidemic type of other enteroviruses in Shaanxi province. From 2020 to 2022， 239 isolates， 151 CV-A16 isolates， 72 CV-A6 isolates， 6 CV-A10 isolates， 2 CV-A4 isolates and 8 CV-B3 isolates were sequenced in Shaanxi province. CV-A16 and CV-A6 were the main epidemic types. According to phylogenetic analysis， the D3 subtype was the main epidemic subtype of CV-A6， while B1a and B1b coexisted for CV-A16. The proportion of B1a subtype increased year by year in 2021 and 2022， and it replaced B1b as the main epidemic subtype. Conclusion From 2020 to 2022， the prevalence of HFMD in Shaanxi province" is at a lower level than that in previous years， and the main pathogens are other enteroviruses and CVA16.

Key words： hand，foot and mouth disease; enterovirus; pathogen composition; phylogenetic analysis; Shaanxi

手足口?。╤and，foot，and mouth disease，HFMD）是由多種腸道病毒引起的常見急性傳染病，其中腸道病毒屬A組71型（enterovirus A71，EV71）和柯薩奇A組16型（coxsackievirus A16，CA16）最為常見。發(fā)病人群以5歲及以下兒童為主，同一兒童可因感染不同血清型的腸道病毒而多次發(fā)?。?］。該病以臨床診斷為主，病原監(jiān)測依賴各級疾病預(yù)防控制中心針對腸道病毒型別的監(jiān)測，主要手段是用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測臨床標(biāo)本是否為EV71、CA16或其他腸道病毒感染，陽性樣本再次測序鑒定基因型，從而掌握手足口病病原譜和基因變異變遷規(guī)律［2］。為了解陜西省手足口病的病原譜和分子流行特征，本研究對2020—2022年陜西省手足口病監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行了病原分析，并對腸道病毒VP1區(qū)基因特征進(jìn)行了總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD細(xì)胞）由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所贈予。核酸提取試劑盒（磁珠法）購自西安天隆科技公司。腸道病毒通用型核酸檢測試劑（熒光RT-PCR法）購自江蘇碩世公司。One Step RT-PCR Kit購自寶生物工程（大連）有限公司。引物合成與一代測序服務(wù)均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。全自動核酸提取儀購自西安天隆科技公司。CFX96型熒光PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2 樣本來源 樣本來源于2020—2022年陜西省各省轄市送檢的手足口病臨床診斷病例樣本。按照《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）》［2］的要求，采樣同時收集病例基本信息，樣本類型包括肛拭子、咽拭子和糞便。根據(jù)指南要求，以縣（區(qū)）為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本；當(dāng)月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例時，全部采樣，進(jìn)行EV71、CV16和其他腸道病毒的血清型分型檢測。由各省轄市完成本轄區(qū)所有標(biāo)本的腸道病毒核酸檢測，將檢測陽性的標(biāo)本送至陜西省疾病預(yù)防控制中心。

1.3 病毒分離培養(yǎng)與鑒定 根據(jù)肛拭子、咽拭子和糞便的類型取核酸檢測陽性樣本進(jìn)行預(yù)處理。咽拭子和肛拭子處理方法為拭子充分?jǐn)噭?0 s，4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min后取上清液。糞便標(biāo)本處理方法為取糞便約2 g，加入10 mL PBS、1 mL氯仿和1 g玻璃珠，使用機(jī)械振蕩器劇烈混勻20 min，4 ℃條件下，3 000 r/min離心20 min后取上清液。處理后的標(biāo)本上清液取200 μL，分別接種于形態(tài)良好的單層RD細(xì)胞，36 ℃培養(yǎng)7 d，每份標(biāo)本至少盲傳3代，不出現(xiàn)特異的細(xì)胞致病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）判為陰性，如出現(xiàn)特異的CPE，立即收集，-80 ℃保存。取200 μL病毒培養(yǎng)液，應(yīng)用磁珠法核酸提取試劑盒提取后，用腸道病毒通用型核酸檢測試劑（熒光RT-PCR法）進(jìn)行鑒定。

1.4 腸道病毒VP1序列測定 參照文獻(xiàn)［3］，合成CA16、CA6型腸道病毒VP1引物以及腸道病毒VP1通用型引物，采用One Step RT-PCR Kit擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄實驗結(jié)果。獲得的基因片段送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建與序列分析 測定的序列采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，搜索并下載CV-A16、CV-A6型國內(nèi)外不同基因亞型代表株序列，對與所有測序成功的VP1區(qū)序列進(jìn)行比對和剪切，采用最大鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值為1 000。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用描述性流行病學(xué)的方法分析手足口病病原監(jiān)測數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，率的比較用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 陜西省手足口病病原核酸檢測結(jié)果 2020—2022年共采集6 352例手足口病例樣本，其中2020年2 182例、2021年2 185例、2022年1 985例。腸道病毒核酸檢測陽性4 417例（69.54%），其中輕癥病例4 389例，重癥病例28例，無死亡病例。2020—2022年陽性分別為1 533例（70.26%）、1 583例（72.45%）和1 301例（65.54%），陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.236，P＜0.001）。

2020—2022年手足口病檢測病例腸道病毒檢測陽性的4 417例為實驗室確診病例，EV-A71型65例（1.47%），CV-A16型1 141例（25.83%），其他腸道病毒3 214例（72.76%）。2020年，EV-A71型4例（0.26%），CV-A16型69例（4.5%），其他腸道病毒1 463例（95.43%），以其他腸道病毒為主要流行型別；2021年，EV-A71型22例（1.39%），CV-A16型384例（24.26%），其他腸道病毒1 177例（74.35%），以其他腸道病毒為主要流行型別，但CV-A16型較2020年上升；2022年，EV-A71型39例（3.00%），CV-A16型688例（52.88%），其他腸道病毒574例（44.12%），以CV-A16型為主要流行型別。

全省除了3個地市未開展對其他腸道病毒中CV-A6和CV-A10的檢測，對2020—2022年開展CV-A6和CV-A10檢測的8個省轄市合計4 145例手足口實驗室確診病例進(jìn)一步分析，見圖1、表1。2020年—2022年對CV-A6型在其他腸道病毒（不含EV-A71和CV-A16）中的構(gòu)成情況進(jìn)行分年統(tǒng)計，分別是790例、605例和266例，是陜西省其他腸道病毒中的優(yōu)勢流行株。在其他腸道病毒（不含EV-A71和CV-A16）的占比分別是75.31%、62.56%和61.15%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=48.026，P＜0.01）。

2.2 陜西省腸道病毒分離結(jié)果 2020—2022年從手足口病病例樣本中成功分離并完成腸道病毒VP1區(qū)測序的毒株共計239株，2020年55株，2021年52株，2022年132株。成功分離出5種腸道病毒血清型，分別是CV-A16型151株，CV-A6型72株，CV-A10型6株，CV-A4型2株，CV-B3型8株。陜西省所有省轄市均有腸道病毒毒株成功分離，其中延安市113株、咸陽市31株、安康市19株、西安市15株、銅川市14株、寶雞市11株、榆林市10株、商洛市9株，楊凌區(qū)9株，渭南市5株，漢中市3株。

2.3 腸道病毒CV-A16型分離株VP1區(qū)基因遺傳進(jìn)化分析 2020—2022年分離CV-A16型腸道病毒152株，經(jīng)VP1區(qū)測序后鑒定，均為B1亞型，其中4株（2.6%）為B1b亞型，148株（97.4%）均為B1a亞型。2021年B1a亞型17株，B1b亞型2株；2022年B1a亞型131株，B1b亞型2株。2020年未分離到CV-A16型腸道病毒。選取近年來國內(nèi)外15株CV-A16型腸道病毒與各市選取2株作為代表株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2，與我國云南、深圳等地近年流行株親緣關(guān)系近，屬于同一分支，為主要流行株。

2.4 腸道病毒CV-A6型分離株VP1區(qū)基因遺傳進(jìn)化分析 2020—2022年分離CV-A6型腸道病毒72株，2020年分離52株，2021年分離20株，經(jīng)鑒定均為D3亞型，分離自延安、咸陽、安康、西安、銅川、寶雞、商洛和渭南市。2022年未成功分離到CV-A6型病毒株。從各市選取2株作為代表，并選取近年來國內(nèi)外20株CV-A6型腸道病毒構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3，D3亞型為陜西省主要流行株，與我國北京、遼寧、廣西、云南等地近年來CV-A6型分離株親緣關(guān)系近，在同一分支上。

3 討論

手足口病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，常出現(xiàn)流行或暴發(fā)，20世紀(jì)末至今，該病在東南亞及太平洋地區(qū)持續(xù)高發(fā)，中國及日本、柬埔寨、越南等周邊國家更是手足口病的重災(zāi)區(qū)［4-5］。2008年手足口病正式被納入丙類法定傳染病管理至今，我國發(fā)病數(shù)與發(fā)病率一直居法定報告?zhèn)魅静〉母呶唬蔀槲覈匾墓残l(wèi)生問題［6］。陜西省2020—2022年共報告手足口病61 040例，年平均發(fā)病率為52.03/10萬，低于陜西省2008—2019年的年平均發(fā)病率127.62/10萬，為2008年以來歷史最低水平［7-9］。同期全國其他地區(qū)手足口病的發(fā)病水平也呈下降趨勢，山東省2020年發(fā)病率19.07/10萬，2021年發(fā)病率32.54/10萬［10］；深圳市2020年發(fā)病率84.42/10萬［11］。其均低于我國2008—2017年平均發(fā)病率134.59/10萬［12］，與陜西省相仿，各地手足口病發(fā)病水平較新冠疫情前顯著下降。2020—2022年是新冠疫情乙類甲管的三年，由于一系列新冠防控非藥物干預(yù)措施的實施，特別是中小學(xué)、幼兒園等機(jī)構(gòu)的停課措施，再加上EV-A71疫苗接種率的提升，有效遏制了手足口病的傳播流行［13-14］。

我國2008—2017年手足口病病原監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，全國2013、2015和2017年3個單數(shù)年份以其他腸道病毒占優(yōu)勢，其余年份均以EV-A71占優(yōu)勢［12］。陜西省手足口病病原監(jiān)測結(jié)果與全國趨勢基本一致，略有不同，2013年以CV-A16型為優(yōu)勢血清型，2015年以其他腸道病毒為優(yōu)勢血清型，2008—2017年中除2013和2015年的其余8年以EV-A71占優(yōu)勢。2017年EV-A71疫苗上市后，全國EV-A71構(gòu)成比大幅降低，未再突顯優(yōu)勢血清型，陜西省與全國趨勢一致，以CV-A16型和其他腸道病毒交替占據(jù)顯著地位［15］。2018年和2019年以CV-A16型為優(yōu)勢血清型［16］，2020年和2021年以其他腸道病毒為優(yōu)勢血清型，其他腸道病毒中以CV-A6型為優(yōu)勢血清型，2022年又以CV-A16型為優(yōu)勢血清型，每間隔2年在CV-A16型和CV-A6型之間交替流行。在陜西省的不同地區(qū)，優(yōu)勢病原也有所差異。通過對8個省轄市開展其他腸道病毒中CV-A6和CV-A10的加強(qiáng)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，2020年除榆林以非CV-A6和CV-A10的其他腸道病毒為主要流行型別，其余7個省轄市CV-A6的構(gòu)成比均超過50%，為主要流行型別。2021年，陜西省全省以其他腸道病毒為優(yōu)勢流行型別，而渭南CV-A16的構(gòu)成比為51%，為主要流行型別，不同于其他7個省轄市以其他腸道病毒為主要流行型別。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，榆林CV-A6的構(gòu)成比較2020年上升，安康、寶雞、商洛、銅川、咸陽和延安6個省轄市CV-A6的構(gòu)成比較2020年下降，CV-A16的構(gòu)成比較2020年上升。2022年陜西省全省以CV-A16為優(yōu)勢流行型別，其中商洛、咸陽、延安和榆林4個省轄市CV-A16的構(gòu)成比均超過50%，與全省優(yōu)勢型一致，以CV-A16為主要流行型別；而其余4個省轄市病原構(gòu)成差異較大。銅川市CV-A6和EV-A71的構(gòu)成比分別是48.19%和42.37%，共同為主要流行型別；渭南、寶雞和安康市以其他腸道病毒為主要流行型別。

2017年以后，CV-A16和CV-A6型腸道病毒是陜西省手足口病的優(yōu)勢流行型別，每間隔1—2年發(fā)生型別轉(zhuǎn)換，因此本研究對2020—2022年陜西省分離到的CV-A16和CV-A6型腸道病毒株VP1區(qū)進(jìn)行了測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析。對于CV-A6，我國2013年以后均是以D3亞型為絕對優(yōu)勢基因型［17］。陜西省與全國的基因型變異變遷規(guī)律一致，以D3亞型作為優(yōu)勢流行株。對于CV-A16，我國2008年以前主要是B1a和B1b亞型的地方共循環(huán)，2008—2018年B1b亞型占主導(dǎo)，2019年以后B1a亞型又逐漸增多［18-19］。從陜西省近年的監(jiān)測結(jié)果看，2011年以前，以B1a和B1b亞型共循環(huán)為主，2012—2016年B1b亞型為優(yōu)勢流行型別，監(jiān)測病例中未發(fā)現(xiàn)B1a，2019年B1a再次出現(xiàn)，與2019—2021年北京市、吉林省B1a和B1b亞型共存的流行規(guī)律一致［20-21］，又回歸到B1a和B1b亞型共循環(huán)。陜西省2019年B1a的占比為47.06%（32/68）［9］，2021年B1a的占比為89.47%（17/19），2022年B1a的占比為98.50%（131/133），B1a亞型取代B1b亞型以逐漸成為陜西省優(yōu)勢流行型別。

因新冠疫情使得2020—2022年陜西手足口病的病原分離工作受到一定影響，采樣數(shù)量、質(zhì)量以及送樣及時性均較疫情前顯著下降。另外，一些地區(qū)采用滅活的采樣管采樣，加之一些非滅活采樣管質(zhì)量不過關(guān)，導(dǎo)致有些地市送樣量不少，但病毒分離率低，分離種類少，有的年份只有優(yōu)勢流行型別能分離到。因此，在今后的工作中亟需提升標(biāo)本采樣質(zhì)量，提高病毒分離率和型別鑒定水平，從而更精準(zhǔn)地了解手足口病原的構(gòu)成情況以及基因變異變遷規(guī)律。

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基金項目：陜西省衛(wèi)生健康科研基金項目（2022A014）

作者單位：陜西省疾病預(yù)防控制中心（郵編710054）

作者簡介：杜燕華（1981），女，主任技師，主要從事病原微生物檢驗方面研究。E-mail：duyh325@163.com

（本文編輯 胡小寧）