摘要：目的 探討微小RNA-582-5p（miR-582-5p）靶向調(diào)控叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1）對新生大鼠缺血缺氧性腦病（HIE）神經(jīng)元損傷的影響。方法 90只新生大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法均分為對照（NC）組、模型（HIE）組、miRNA對照（LV-miRNA-NC）組、miR-582-5p過表達(dá)（LV-miR-582-5p）組、miR-582-5p過表達(dá)+mRNA對照（LV-miR-582-5p+LV-NC）組、miR-582-5p過表達(dá)+FOXO1過表達(dá)（LV-miR-582-5p+LV-FOXO1）組。除NC組外的各組大鼠建立HIE模型，對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，TTC染色測定腦梗死體積，Real-time PCR檢測miR-582-5p和FOXO1表達(dá)，雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-582-5p和FOXO1靶向關(guān)系，HE染色觀察海馬組織病理變化，TUNEL和Neu N熒光雙標(biāo)共定位檢測海馬組織神經(jīng)元凋亡，免疫組化染色檢測FOXO1、胱天蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表達(dá)。結(jié)果 miR-582-5p和FOXO1具有靶向關(guān)系，與NC組比較，HIE組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積、FOXO1表達(dá)、神經(jīng)元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表達(dá)增加，miR-582-5p表達(dá)降低，海馬組織出現(xiàn)病理損傷（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積、FOXO1表達(dá)、神經(jīng)元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，miR-582-5p表達(dá)增加，海馬組織病理損傷好轉(zhuǎn)（P＜0.05）；LV-FOXO1可以逆轉(zhuǎn)LV-miR-582-5p對于HIE大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。結(jié)論 miR-582-5p可以直接靶向負(fù)調(diào)控FOXO1表達(dá)，減少HIE新生大鼠神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：缺氧缺血，腦；創(chuàng)傷，神經(jīng)系統(tǒng)；叉頭框蛋白O1；微小RNA-582-5p

中圖分類號：R342，R722.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20230591

Effect of miR-582-5p targeting regulation of FOXO1 on neuronal damage in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy

YAN Haifeng1， WU Xiaohong1， LIN Yuqing1， HUO Kaiming1， WANG Yingying2

1 Department of Pediatric Area II， 2 Department of Laboratory， the Second Affiliated Hospital of

Hainan Medical College， Haikou 570311， China

Abstract： Objective To investigate the effect of microRNA-582-5p （miR-582-5p） on neuronal damage in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy （HIE） through targeted regulation of forkhead box transcription factor O1 （FOXO1）. Methods Newborn rats （n=90） were randomly grouped into the control （NC） group， the model （HIE） group， the miRNA non-specific control （LV-miRNA-NC） group， the miR-582-5p overexpression （LV-miR-582-5p） group， the miR-582-5p overexpression+mRNA control （LV-miR-582-5p+LV-NC） group and the miR-582-5p overexpression+FOXO1 overexpression （LV-miR-582-5p+LV-FOXO1） group. HIE model was established in all groups except the NC group， and neurological deficits were scored on rats. TTC staining was applied to measure the volume of cerebral infarction. Real-time PCR was applied to detect miR-582-5p and FOXO1 expression. Dual fluorescence reporter gene experiment was applied to detect the targeting relationship between miR-582-5p and FOXO1. HE staining method was applied to observe pathological changes in hippocampal tissue. TUNEL and NeuN fluorescence dual labeling co localization were applied to detect neuronal apoptosis in hippocampal tissue. Immunohistochemistry was applied to detect expressions of FOXO1 and Caspase-3 proteins. Results There was a targeting relationship between MiR-582-5p and FOXO1. Compared with the NC group， the neurological deficit score， cerebral infarction volume， FOXO1 expression， neuronal apoptosis rate， FOXO1 and Caspase-3 protein expression were increased in the HIE group， and the miR-582-5p expression obviously decreased， the hippocampal tissue showed obvious pathological damage （P＜0.05）. Compared with the LV-miRNA-NC group， the neurological deficit score， cerebral infarction volume， FOXO1 expression， neuronal apoptosis rate， FOXO1 and Caspase-3 protein expression obviously decreased in the LV-miR-582-5p group， and the miR-582-5p expression obviously increased， the pathological damage of" hippocampus tissue was obviously improved （P＜0.05）. LV-FOXO1 was able to reverse the protective effect of LV-miR-582-5p on neuronal damage in HIE rats. Conclusion MiR-582-5p can directly target FOXO1， negatively regulate FOXO1 expression， reduce neuronal apoptosis in HIE neonatal rats， and have a protective effect on neural injury.

Key words： hypoxia-ischemia， brain; trauma， nervous system; forkhead box protein O1; microRNA-582-5p

新生兒缺血缺氧性腦?。╤ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是全球新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率和病死率高的主要原因之一。研究顯示，15%～20%的HIE新生兒容易在早期死亡，而幸存的新生兒多患有腦癱、癲癇，視力、聽力和認(rèn)知障礙等嚴(yán)重的神經(jīng)損傷［1-2］。miRNA長度為21～22個核苷酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，可與其靶向mRNA的3′-UTR結(jié)合，通過沉默mRNA來抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯［3］。miR-582-5p是一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼基因，其參與腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)［4］。叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，通過調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、氧化應(yīng)激和能量代謝［5］，抑制其表達(dá)可以減少腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡［6］。本研究建立新生HIE大鼠模型，探討miRNA-582-5p靶向FOXO1對新生HIE大鼠神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 90只7日齡SPF級新生SD大鼠，體質(zhì)量12～14 g，購自廣東維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0063。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，檢查無異常后用于后續(xù)實驗。HEK-293細(xì)胞購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；DAB染色試劑盒購自廣州市外顯子生物技術(shù)有限公司；雙螢光素酶報告基因試劑盒均購自深圳子科生物科技有限公司；TUNEL（FITC標(biāo)記）染色液購自廣州威佳科技有限公司；兔抗鼠Neu N抗體、兔抗鼠FOXO1抗體、兔抗鼠胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體、兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、TRITC標(biāo)記和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分組 將新生大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照（NC）組、模型（HIE）組、miRNA對照（LV-miRNA-NC）組、miR-582-5p過表達(dá)（LV-miR-582-5p）組、miR-582-5p過表達(dá)+mRNA對照（LV-miR-582-5p+LV-NC）組、miR-582-5p過表達(dá)+FOXO1過表達(dá)（LV-miR-582-5p+LV-FOXO1）組，每組15只。除NC組外，麻醉75只新生大鼠，暴露左側(cè)頸動脈并結(jié)扎，室溫放置1 h后，置于缺氧倉（37 ℃、8%O2和92%N2）中處理2 h，大鼠出現(xiàn)左旋即為造模成功［7］。NC組只暴露左側(cè)頸動脈，不做結(jié)扎和缺氧處理；各慢病毒組在造模前分別將LV-miRNA-NC、LV-miR-582-5p、LV-miR-582-5p+LV-NC、LV-miR-582-5p+LV-FOXO1注入側(cè)腦室，注射體積10 μL。HIE組在造模前于側(cè)腦室注射等量生理鹽水，NC組于暴露左側(cè)頸動脈前在側(cè)腦室注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積測定 觀察大鼠站立和行走狀態(tài)，評分根據(jù)5級4分法進(jìn)行。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損；1分：右前肢伸展障礙；2分：行走時對側(cè)旋轉(zhuǎn)打圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識渙散，昏迷。每組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉取腦，迅速冷凍10 min，將腦組織連續(xù)冠狀切片，室溫下使用TTC染色對切片進(jìn)行染色25 min，Image J軟件測定腦梗死體積。

1.2.3 Real-time PCR檢測大鼠海馬組織miR-582-5p和FOXO1表達(dá) 每組繼續(xù)隨機(jī)取5只大鼠，麻醉處死。取大鼠海馬組織，勻漿后，加入Trizol試劑提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取適量cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。miR-582-5p：上游5′-GCGGTTACAGTTGTTCAACC-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；FOXO1：上游5′-TTTGCCCCAGATGCCTATAC-3′，下游5′-GGAGAGTCAGAAGTCAGCAAC-3′；U6：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；GAPDH：上游5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。FOXO1以GAPDH為內(nèi)參，miR-582-5p以U6為內(nèi)參。2-ΔΔCt法檢測miR-582-5p和FOXO1 mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.4 miR-582-5p和FOXO1的靶向關(guān)系驗證 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測miR-582-5p和FOXO1的結(jié)合位點。取對數(shù)生長期HEK-293細(xì)胞，胰蛋白酶消化后重懸。構(gòu)建FOXO1野生型（WT）和突變型（MUT）質(zhì)粒，分別記為FOXO1-WT、FOXO1-MUT，將miR-NC與FOXO1-WT或FOXO1-MUT（miR-NC和FOXO1-WT共轉(zhuǎn)染組、miR-NC和FOXO1-MUT共轉(zhuǎn)染組），miR-582-5p" mimics與FOXO1-WT或FOXO1-MUT（miR-582-5p mimics與FOXO1-WT共轉(zhuǎn)染組、miR-582-5p mimics與FOXO1-MUT共轉(zhuǎn)染組）分別共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞懸液中，轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)雙螢光素酶試劑盒檢測各組細(xì)胞螢光素酶活性。實驗重復(fù)6次。

1.2.5 海馬組織病理變化和海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測 取每組剩余的5只大鼠，麻醉處死并取腦，分離海馬組織，乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟水化，根據(jù)HE試劑盒說明書進(jìn)行染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。余石蠟切片脫蠟后梯度乙醇脫水，加入不含DNase的蛋白酶K孵育10 min，PBS洗滌后，加入Neu N（1∶500）抗體和TUNEL（FITC標(biāo)記）染色液（1∶100），置于37 ℃孵育2 h，PBS洗滌后，加入二抗（TRITC標(biāo)記，1∶1 000），37 ℃孵育45 min，光學(xué)顯微鏡下拍照。凋亡神經(jīng)元顯示綠色熒光，正常神經(jīng)元顯示紅色熒光。采用Image J軟件進(jìn)行量化。凋亡率（%）=綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞/（綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞+紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞）×100%。

1.2.6 免疫組化檢測FOXO1、Caspase-3蛋白表達(dá) 取1.2.5制備的石蠟切片，常規(guī)脫蠟，使用10%過氧化氫甲醇溶液避光處理40 min，胰蛋白酶抗原修復(fù)10 min，山羊血清封閉后加入一抗FOXO1（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000），37 ℃放置1 h后，4 ℃過夜。PBS沖洗后加入二抗（1∶500），37 ℃孵育40 min后加入DAB顯色，封片后光學(xué)顯微鏡下觀察。目的蛋白陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)（染成黃褐色的細(xì)胞）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用[x] ±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積變化比較 與NC組比較，HIE組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積增加（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積降低（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積增加（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 各組大鼠海馬組織FOXO1和miR-582-5p表達(dá)比較 與NC組比較，HIE組FOXO1表達(dá)增加，miR-582-5p降低（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組FOXO1表達(dá)降低，miR-582-5p增加（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組FOXO1表達(dá)增加（P＜0.05），見表2。

2.3 miR-582-5p和FOXO1靶向關(guān)系驗證 生物信息學(xué)分析顯示miR-582-5p與FOXO1 3′-UTR存在7個連續(xù)的核苷酸結(jié)合位點，見圖2。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與miR-NC和FOXO1-WT共轉(zhuǎn)染組（1.03±0.10）比較，miR-582-5p mimics與FOXO1-WT共轉(zhuǎn)染組（0.45±0.04）細(xì)胞螢光素酶活性降低（n=6，t=13.191，P＜0.05）；與miR-NC和FOXO1-MUT共轉(zhuǎn)染組（0.99±0.11）比較，miR-582-5p mimics與FOXO1-MUT共轉(zhuǎn)染組（1.02±0.10）細(xì)胞螢光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，t=0.494，P＞0.05）。

2.4 各組海馬組織病理學(xué)變化 NC組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞排列整齊；HIE組和LV-miRNA-NC組大鼠缺血側(cè)海馬組織細(xì)胞腫脹變形，排列紊亂，大量細(xì)胞死亡，部分細(xì)胞核固縮；LV-miR-582-5p組和LV-miR-582-5p+LV-NC組大鼠海馬組織病理變化好轉(zhuǎn)，細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞死亡數(shù)量減少；LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠海馬組織細(xì)胞死亡增多，細(xì)胞排列紊亂。見圖3。

2.5 過表達(dá)miR-582-5p或FOXO1對大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響 NC組、HIE組、LV-miRNA-NC組、LV-miR-582-5p組、LV-miR-582-5p+LV-NC組、LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組的海馬組織神經(jīng)元凋亡率（%）分別為1.01±0.02、28.22±4.35、29.05±3.12、17.24±2.01、16.55±2.36、23.21±2.29（n=5，F(xiàn)=73.940，P＜0.01）。與NC組比較，HIE組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率增加（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率增加（P＜0.05）。見圖4。

2.6 各組海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平比較 與NC組比較，HIE組大鼠海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。見表3、圖5。

3 討論

HIE是由圍產(chǎn)期窒息誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是引發(fā)新生兒死亡的第二大常見原因［8］。HIE不僅影響兒童的智力水平，還會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，腦缺血損傷后易引起神經(jīng)元死亡，進(jìn)而加重神經(jīng)損傷［9］。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，HIE組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積增加，并出現(xiàn)神經(jīng)元死亡，提示造模成功。

miRNA在身體的發(fā)育和代謝過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中miRNA與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化和生理功能密切相關(guān)，對腦缺氧缺血后的神經(jīng)病變和功能障礙起重要的調(diào)節(jié)作用［10］。細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-582-5p可以抑制神經(jīng)元凋亡［11］。miR-582-5p還可以增強(qiáng)神經(jīng)球的形成和維持神經(jīng)干細(xì)胞的干性，并且促進(jìn)其神經(jīng)干細(xì)胞增殖，可為腦病研究和體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生提供新的靶點［12］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-582-5p可改善新生HIE大鼠海馬組織病理學(xué)改變，并且神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積降低，表明過表達(dá)miR-582-5p可改善新生HIE大鼠神經(jīng)功能和腦損傷，提示miR-582-5p可能是臨床治療HIE的潛在靶點。

FOXO1是心臟、骨骼肌、肝臟和大腦自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過去乙?；疐OXO1來抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷，在維持自噬降解活性和發(fā)育神經(jīng)元的形態(tài)成熟方面起著重要作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1是miR-582-5p的靶基因，miR-582-5p可靶向下調(diào)FOXO1表達(dá)來抑制單核細(xì)胞凋亡［14］。miRNA可以通過調(diào)節(jié)其靶基因來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展，如miR-9通過抑制孤兒核受體Tailless樣蛋白（TLX）表達(dá)來抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖并促進(jìn)神經(jīng)分化［15］。本研究雙螢光素酶基因報告實驗結(jié)果顯示，miR-582-5p可以與FOXO1的3′-UTR結(jié)合，并靶向負(fù)調(diào)控FOXO1表達(dá)，過表達(dá)miR-582-5p抑制了神經(jīng)元凋亡，且過表達(dá)FOXO1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-582-5p對于神經(jīng)元損傷的改善作用，提示miR-582-5p可通過調(diào)節(jié)FOXO1表達(dá)來參與HIE大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

HIE引發(fā)的腦損傷是一個復(fù)雜過程，涉及氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡等病理生理過程，腦缺氧缺血后通常引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元凋亡［16］。細(xì)胞凋亡在圍產(chǎn)期腦損傷和神經(jīng)元損傷中具有重要作用，而抑制神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)腦再生和修復(fù)對于HIE治療至關(guān)重要［17］。Caspase-3是Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，是啟動凋亡程序的重要因子［18］。本研究結(jié)果顯示，HIE大鼠較NC組大鼠的海馬組織神經(jīng)元凋亡增加，促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)增加；而過表達(dá)miR-582-5p抑制了神經(jīng)元凋亡，下調(diào)了Caspase-3表達(dá)，并且改善了海馬組織病理損傷，再次證實了miR-582-5p可通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡來保護(hù)HIE大鼠神經(jīng)元。

綜上所述，miR-582-5p通過靶向下調(diào)FOXO1表達(dá)來抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮對HIE大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，但是miR-582-5p/FOXO1保護(hù)神經(jīng)元的機(jī)制較為復(fù)雜，對于FOXO1調(diào)節(jié)下游蛋白來改善神經(jīng)元損傷的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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基金項目：2020年度海南省衛(wèi)生健康行業(yè)科研項目［瓊衛(wèi)科教（2020）9號389］

作者單位：1海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科二區(qū)（郵編570311），2檢驗科

作者簡介：顏海峰（1980），男，副主任醫(yī)師，主要從事新生兒（早產(chǎn)兒）醫(yī)學(xué)、重癥醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)與兒童健康方面研究。E-mail：vj3byi2@163.com

（本文編輯 陸榮展）