李海飛　李　靜　徐國鋒　聶繼云

摘要用高效液相色譜儀(HPLC)快速測定水果中苯并咪唑類農(nóng)藥(多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈)殘留量，樣品經(jīng)乙腈萃取后鹽析，提取液經(jīng)PSA和ODS吸附劑加無水硫酸鎂凈化后，過0.45μm濾膜，直接用HPLC-PDA(二極管陣列檢測器)分離測定，外標(biāo)法定量。采用乙腈/0.02moL/L磷酸緩沖鹽(pH值7.4)=28/72體系為流動(dòng)相，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈在蘋果、梨、葡萄、香蕉、芒果、桔子等6種水果中雜質(zhì)干擾少，分離度較好，靈敏度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。最低檢出限分別為：多菌靈0.045 5mg/kg，噻菌靈0.042 1mg/kg，甲基硫菌靈0.068 6mg/kg。在添加0.2～1.0mg/kg濃度水平的回收率試驗(yàn)中，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈的平均添加回收率分別為82.0%～102.4%、87.6%～104.8%和79.6%～112.5%，RSD均在10%以下，滿足殘留分析的要求。

關(guān)鍵詞苯并咪唑類農(nóng)藥；水果；高效液相色譜儀；殘留；測定

中圖分類號(hào)S66；S482.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)01-0114-03

苯并咪唑類殺菌劑是一類高效、低毒和廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，兼具預(yù)防和治療作用。該類殺菌劑常用于作物生長后期或采后的病害防治，在農(nóng)產(chǎn)品中檢出率較高，蔬菜、水果中尤為突出[1，2]。殘留于果蔬中的苯并咪唑類殺菌劑對人體有一定的毒性。因此，檢測其在果蔬中殘留量，對保證人體健康有重要意義。多菌靈、噻菌靈是苯并咪唑類殺菌劑中的代表性農(nóng)藥，尤其是多菌靈，是苯菌靈、氰菌靈、硫菌靈及醚菌靈等多種農(nóng)藥的共同降解產(chǎn)物。實(shí)際上，在pH值接近中性時(shí)，果實(shí)上的苯菌靈在分析過程中幾乎完全轉(zhuǎn)化成多菌靈，而甲基硫菌靈僅有少量轉(zhuǎn)化成多菌靈，故分析苯并咪唑類殺菌劑殘留時(shí)，只需測定多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈即可[3]。近年來，關(guān)于苯并咪唑類殺菌劑在不同作物中的殘留測定已有報(bào)道[4-10]，但樣品前處理均需經(jīng)過液—液萃取或固相萃取富集、凈化，比較復(fù)雜。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在農(nóng)藥殘留分析中，有2/3的時(shí)間都花在提取和凈化等預(yù)處理上，因此研究快速、有效的樣品預(yù)處理方法在農(nóng)藥殘留分析中具有重要的意義。筆者以蘋果、梨、柑橘、葡萄、香蕉、芒果等6種代表性水果為試材，以多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈等3種主要苯并咪唑類農(nóng)藥為對象，探索建立一種操作步驟較為簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能滿足水果中多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈同時(shí)測定的分析方法。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本島津公司)LC-10A，二極管陣列檢測器PDA，前處理儀器包括漩渦混勻器、離心機(jī)、pH計(jì)等；多菌靈、噻菌靈標(biāo)樣為Sigma公司產(chǎn)品，甲基硫菌靈由農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量中心提供，PSA和ODS吸附劑(Agela Technologies Inc，農(nóng)殘級(jí))，無水硫酸鎂(天津科密歐科技有限公司，優(yōu)級(jí)純)，乙腈(美國TEDIA公司，HPLC級(jí))，磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，優(yōu)級(jí)純)，氯化鈉(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純)，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水，0.45μm濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2色譜條件

流動(dòng)相為乙腈/0.02moL/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)=28/72，用前經(jīng)0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣。色譜柱為Shim-Pack：VP-ODS C18(150.0mm×4.6mm，5μm)，流速為0.8 mL/min，柱溫35℃。進(jìn)樣量為10μL。檢測波長：甲基硫菌靈為265nm，多菌靈為285nm，噻菌靈為300nm。外標(biāo)法定量。

1.3試樣制備

取不少于1 000g水果樣品，將可食部分切碎，充分混勻放入食物加工機(jī)粉碎，制成待測樣，裝入容器中備用。

1.4提取

準(zhǔn)確稱取10.0g試樣于50mL離心管中，加入10.0mL乙腈，旋渦混勻2min，加3~5g氯化鈉到離心管中，旋渦混勻1min，5 500rpm離心3min。

1.5凈化

從離心管中準(zhǔn)確吸取2.0mL乙腈溶液到盛有50mg PSA、50mg ODS、100mg無水MgSO4的10mL離心管中，在旋渦混合器上混勻后，上清液用0.45μm濾膜過濾，待測。

2結(jié)果與分析

2.1檢測波長的確立

經(jīng)二極管陣列檢測器波長掃描，多菌靈在225nm和285nm處有較大吸收峰，甲基硫菌靈在210nm和265nm處有較大吸收峰，噻菌靈在200nm和300nm處有較大吸收峰。但多菌靈在285nm、甲基硫菌靈在265nm、噻菌靈在300nm處雜質(zhì)峰少，基線穩(wěn)定，因此選擇其為檢測波長。

2.2流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的組成對樣品中組分的分離有一定的影響。采用傳統(tǒng)的甲醇/水作為流動(dòng)相體系時(shí)，蘋果、梨、香蕉、芒果等樣品中多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈與雜質(zhì)峰基本可分開，但對于柑橘樣品，無論采用何種比例的甲醇/水為流動(dòng)相，多菌靈和噻菌靈峰均被雜質(zhì)峰掩蓋。采用乙腈/0.02moL/L磷酸緩沖鹽(pH值7.4)= 28/72作為流動(dòng)相體系，6種水果中多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈與雜質(zhì)峰的分離效果較好，均無雜質(zhì)峰干擾，且峰形較好。流動(dòng)相pH值影響被分析物的分離效果。考慮到多菌靈在酸性條件下會(huì)形成鹽，故采用堿性的二乙胺調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值。分別調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為6.0、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4，結(jié)果表明，pH值在7.0以下時(shí)，多菌靈響應(yīng)值偏低，噻菌靈和甲基硫菌靈峰形較寬且有明顯的拖尾現(xiàn)象；pH值在7.2~7.4時(shí)，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈的靈敏度高，峰形尖銳且對稱性好。

2.3色譜分離

在所確定的試驗(yàn)條件下，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈三者分離良好，保留時(shí)間分別為5.710min、7.255min和17.255min。即使基質(zhì)較為復(fù)雜的柑橘樣品，也獲得了良好的分離效果。標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖和柑橘添加標(biāo)樣色譜圖見圖1。

2.4提取與凈化

考慮到綜合提取效率、選擇性、與樣品混合性以及溶劑化作用和滲透能力等因素，本方法采用乙腈作為苯并咪唑類農(nóng)藥殘留量的提取劑，提取速度快，易于操作。對于蔬菜和水果類的農(nóng)殘分析，PSA吸附劑具有弱的陰離子交換能力，有利于吸附樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖及色素，并且對各種性能差異較大的農(nóng)藥具有較高的回收率。為更好地去除對色譜柱性能有影響的雜質(zhì)，本方法采用前處理中在PSA加入一定量ODS和硫酸鎂的凈化方法，在去除水分、色素、蛋白質(zhì)、脂肪、臘質(zhì)等干擾物的同時(shí)又對色譜柱起到一定保護(hù)作用。

2.5線性關(guān)系與檢測限

以0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L等4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度Y對峰面積X進(jìn)行回歸。結(jié)果表明，在0.1~2.0mg/L濃度范圍內(nèi)，苯并咪唑類農(nóng)藥的濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：多菌靈Y=2.0×10-5X+0.013 2，r=0.999 3；噻菌靈Y=1.0×10-5X+0.009 4，r=0.999 9；甲基硫菌靈Y= 3.0×10-5X+0.009 3，r=0.999 0。最低檢出限是以儀器基線噪聲3倍所對應(yīng)的質(zhì)量濃度值計(jì)[13]，在所確定的試驗(yàn)條件下，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈的最低檢出限分別為0.045 5mg/kg、0.042 1mg/kg和0.068 6 mg/kg。

2.6添加回收率試驗(yàn)

水果種類繁多，不同水果其水分、糖、酸、色素等物質(zhì)有較大的差異，本試驗(yàn)選擇蘋果、梨、葡萄、香蕉、芒果、柑橘等6種代表性水果為試材，進(jìn)行3個(gè)水平(0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg)的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平各設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果見表1。多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈在6種水果中的平均添加回收率分別為82.0%～102.4%、87.6%～104.8%和79.6%～112.5%，RSD均在10%以下。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求[13]。

3結(jié)論與討論

本方法采用乙腈為提取劑，PSA吸附劑和ODS吸附劑與無水硫酸鎂組合的提取、凈化方法，不僅可除去提取液中水分、色素、蛋白質(zhì)、脂肪、臘質(zhì)等干擾物，而且有助于去除對色譜柱性能有影響的雜質(zhì)，延長色譜柱使用壽命。提取液凈化后不需濃縮處理，過濾膜后直接進(jìn)樣檢測，操作簡便、快速，大大簡化了樣品前處理步驟，節(jié)約了時(shí)間。以乙腈/0.02moL/L磷酸鹽(pH值7.4)＝28/72體系作為流動(dòng)相，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈在6種代表性水果中均有較好的峰形和分離度，雜質(zhì)干擾少，平均回收率在79.6%～112.5%，RSD均在10%以下，最低檢出限為0.042 1～0.068 6mg/kg。本方法操作簡便、快速，對水果中多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈等3種苯并咪唑類農(nóng)藥殘留量能同時(shí)進(jìn)行測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

4參考文獻(xiàn)

[1] OREELLID，EEDDER，PATREC.Pesticide residues survey in citrus fruits[J].Food Additives and Contaminant，2005，22(5)：423-428.

[2] ATTILIOV，GIVANNIV，SWIZLYSA. Determination of carbendazim，thiabendazole and thiophanate-methyl in banana(Musa acuminate)sam-ples imported to Italy[J].Food chemistry，2004，87(3)：383-386.

[3] TORRESCM，PICOY，MARIESJ. Determination of pesticide residues in fruit and vegetables[J]. Journal of chromatography：A，1996(754)：301-331.

[4] RIAL O R，CANCHO G B，SIMAL G J. Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid—liquid and solid phase extraction followed by liquid chromatography—diode array detection[J].Journal of chromatography：A，2003(992)：121-131.

[5] RODNEY J B，HEATHER L H，JASOTHA K，et al. Determination carbendazim in blue berries by reversed phase high-performance liquid chromatography[J].Journal of chromatography，1991(587)：321-324.

[6] RODRYGUEZ R，PICO Y，F(xiàn)ONT G，et al. Analysis of post—harvest fungicides by micellar electrokinetie chromatography[J].Journal of chromatography：A，200l(924)：387-396.

[7] RODRYGUEZ R，PICO Y，F(xiàn)ONT G，et al. Analysis of thiabendazole and procymidone in fruits and vegetables by eapillary eleetrophoresis-eleetrospray mass spectrometry[J]. Journal of chromatography：A，2002(949)：359-366.

[8] CARLO BICCHI. 高效液相色譜法同時(shí)測定蘋果、梨及其果肉中苯并咪唑類殺菌劑[J].農(nóng)藥，1989，28(5)：39-40.

[9] HUR W，HENNION B，URRUTY L，et al.Solid phase microextraction of pesticide residues from strawberries[J].Food Additives and Contaminant，1999(16)：111-116.

[10] NAVAAAO M，PICO Y，MARYN R，et al. Application of matrix solid-phase dispersion to the determination of a new generation of fungicides in fruits and vegetables[J]. Journal of chromatography：A，2002(968)：201-209.

[11] BLASCO C，PICO Y，F(xiàn)ONT G，et al. Determination of fungicide residues in fruits and vegetables by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of chromato-graphy：A，2002(947)：227-235.

[12] 孔祥虹，何學(xué)文，張妮華.高效液相色譜法測定濃縮蘋果汁中的多菌靈殘留量[J].化學(xué)分析計(jì)量，2003，12(1)：13-14.

[13] 李本昌.農(nóng)藥殘留量實(shí)用檢測方法手冊[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.