◎ 孫銀峰，靳 智，崔芳芳，姜志虎

（青島元信檢測技術(shù)有限公司，山東 青島 266000）

農(nóng)藥的使用對自然環(huán)境產(chǎn)生了不同程度的污染，通過食物鏈富集到動(dòng)物體內(nèi)，污染了動(dòng)物源性食品，威脅人類健康。為保護(hù)食品安全和人類身體健康，世界各國和不少組織制定了動(dòng)物源性食品中農(nóng)藥殘留的相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)和限量規(guī)定。例如，國際食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC） 制 定 了包含動(dòng)物源性食品在內(nèi)的農(nóng)藥最高限量值（Maximum Residue Limits，MRLs）。我國也制定了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021），其中規(guī)定了禽肉106 種、哺乳動(dòng)物肉類117 種農(nóng)藥殘留的限量[1]。但存在如吡蟲啉等部分農(nóng)藥殘留沒有指定檢測方法，指定的檢測標(biāo)準(zhǔn)大多只檢測一種或一類農(nóng)藥殘留，覆蓋范圍窄，檢測技術(shù)不統(tǒng)一，甚至存在方法不適用的問題。因此，建立一個(gè)適用于畜禽肉中大部分農(nóng)藥殘留的檢測方法，有利于提高方法科學(xué)性，高效和準(zhǔn)確地完成畜禽肉中農(nóng)藥殘留的檢測，為畜禽肉的食品安全提供更有力的技術(shù)支持和保障。

動(dòng)物肌肉因脂肪、蛋白質(zhì)含量較高，致使其基質(zhì)較為復(fù)雜，選擇適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚硖崛『蛢艋绞綔p少農(nóng)藥檢測過程中脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的干擾，是該檢測方法的重點(diǎn)工作。當(dāng)前，農(nóng)藥殘留檢測的前處理凈化方法主要有固相萃取法（GB 23200.49—2016）、凝膠色譜凈化法（GB/T 20772—2008、GB/T 19650—2006）等。現(xiàn)有的樣品前處理凈化方法雖各有優(yōu)勢，但也存在一些不足和局限性。例如，凝膠滲透色譜法能準(zhǔn)確分離出農(nóng)藥殘留組分，但需要購買貴重的前處理儀器凝膠滲透色譜儀，檢測成本高、儀器操作維護(hù)煩瑣、溶劑消耗量大、檢測周期長。與凝膠滲透色譜法等方法相比，QuEChERS法具有檢測效率高、成本低、操作簡便、回收率高、環(huán)境友好等優(yōu)勢[2]，已在禽肉、禽蛋、牛奶、淡水魚等動(dòng)物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測采用[3-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇QuEChERS 法對畜禽肉中農(nóng)藥殘留進(jìn)行前處理。

農(nóng)藥殘留的儀器檢測技術(shù)主要有氣相色譜（Gas Chromatography，GC）、液相色譜（Liquid Chromatography，LC）、氣相色譜質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）等。其中，GC 檢測范圍有限，不利于揮發(fā)性小、熱穩(wěn)定性差、分子質(zhì)量大的樣品檢測。LC 易受復(fù)雜基質(zhì)干擾，檢測農(nóng)藥種類少，靈敏度低。GC-MS 不能進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，抗干擾能力較差。較之上述方法，MS/MS 增加了二級子離子的質(zhì)譜信息，采用離子對及其比值進(jìn)行定性分析，目標(biāo)化合物色譜圖不分離也能進(jìn)行定性定量。其多反應(yīng)監(jiān)測模式具有較高靈敏度和抗干擾能力，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于痕量農(nóng)藥殘留的檢測。因此，本實(shí)驗(yàn)基于QuEChERS 前處理方法，建立一種可同時(shí)檢測畜禽肉中263 種農(nóng)藥殘留的LC-MS/MS 方法。該方法的建立可以滿足客戶對肉類食品原料篩選、產(chǎn)品質(zhì)量及出口監(jiān)控等需求，為我國畜禽肉食品中農(nóng)藥殘留的快速檢測以及食品安全監(jiān)管提供科學(xué)技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-G6470 高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源；TGL-16M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；BRAUN-3205 型博朗料理機(jī)；KQ-500DB 型超聲波清洗器；DMT-2500 型多管旋渦混合儀；YP502 型電子天平；0.22 μm 微孔濾膜；實(shí)驗(yàn)用水為一級水；正己烷、丙酮、乙腈、乙酸銨、甲酸、乙酸，均為色譜純；QuEChERS 萃取鹽包［6 g 無水硫酸鎂（MgSO4）、1.5 g 醋酸鈉（NaOAc）］；QuEChERS凈 化 包［900 mg 無 水 硫 酸 鎂（MgSO4）、150 mg N－丙基乙二胺（PSA）、150 mg 十八烷基硅烷（C18）］；263 種農(nóng)藥及其代謝物（10 mg·L-1），均購于北京曼哈格生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用豬肉、雞肉、羊肉，均為市面隨機(jī)購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

樣品用絞肉機(jī)絞碎，充分混勻，準(zhǔn)確稱取5 g 樣品（精確至0.01 g），置于50 mL 離心管中，加入5 mL水浸泡后，渦旋振蕩3 min，準(zhǔn)確加10 mL 乙腈，渦旋振蕩3 min，加QuEChERS 萃取鹽包（1.5 g 醋酸鈉+6 g 無水硫酸鎂）渦勻，渦旋振蕩10 min 提取，2 800 r·min-1冷凍離心3 min，然后取上清液經(jīng)QuEChERS凈化包（900 mg 無水硫酸鎂、150 mg N－丙基乙二胺、150 mg 十八烷基硅烷）凈化后，過0.22 μm 微孔針式過濾器后上機(jī)檢測。

1.2.2 標(biāo)液配制

分別吸取一定量的10 mg·L-1混標(biāo)儲(chǔ)備溶液，用乙腈定容至10 mL，配制成1.00 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃下避光、密封保存。取空白樣品，按照上述前處理方法處理成空白基質(zhì)液，配制基質(zhì)曲線濃度為5 μg·L-1、10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 儀器測定條件

色 譜 條 件：ZORBAX Eclipse C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流速：0.300 mL·min-1；進(jìn)樣量：5.0 μL；柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：0.1%甲酸的0.005 mol·L-1乙酸銨溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序表

質(zhì)譜條件：離子模式（ESI+、ESI-）；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；氣流速：3 mL·min-1；離子源溫度：300 ℃；霧化氣、鞘氣和碰撞氣為普通氮?dú)?，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的選擇優(yōu)化

配制含有263 種農(nóng)藥的200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參考GB 23200.121—2021 中農(nóng)藥的母離子和子離子等質(zhì)譜信息，分別在正離子模式和負(fù)離子模式下，找出適用于本質(zhì)譜儀器的最優(yōu)裂解電壓和碰撞電壓。在相同實(shí)驗(yàn)條件下分別將乙腈和甲醇作為有機(jī)相進(jìn)行對比。實(shí)驗(yàn)表明，甲醇為有機(jī)相時(shí)大部分農(nóng)藥的峰形、響應(yīng)優(yōu)于乙腈，故選擇甲醇為有機(jī)相。水相中添加甲酸和乙酸銨能提高電噴霧離子化的離子響應(yīng)強(qiáng)度，因此考察水相中添加不同濃度的甲酸（0.01%、0.10%）、乙酸銨（2 mmol·L-1、5 mmol·L-1）對峰形、響應(yīng)值的影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，添加含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨水溶液時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥的響應(yīng)值高、峰形好。因此最終確定流動(dòng)相的條件為含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨水溶液－甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，保留時(shí)間見表2。

表2 263 種農(nóng)藥的保留時(shí)間表 單位：min

2.2 提取溶劑的選擇

結(jié)合動(dòng)物肌肉中脂肪、蛋白質(zhì)含量高的特點(diǎn)以及各目標(biāo)農(nóng)藥殘留的特性，分別采用乙腈、1%乙酸乙腈、正己烷∶丙酮（1 ∶1）、飽和正己烷的乙腈溶液作為樣品提取溶劑。分別向空白基質(zhì)中添加100 μg·kg-1混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，在其他實(shí)驗(yàn)條件相同情況下，通過回收率比較4 種不同提取劑的提取效果。由表3 可知，乙腈、飽和正己烷的乙腈溶液、1%乙酸乙腈在豬肉、雞肉、羊肉3 種基質(zhì)中均呈現(xiàn)出較佳的提取效果。其中，乙腈效果最好。本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為最終提取溶劑。

表3 不同提取溶劑對263 種農(nóng)藥的添加回收率統(tǒng)計(jì)表 單位：種

2.3 方法的線性范圍及定量限

由加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)可知，263 種農(nóng)藥在實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中都呈現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。本方法采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，減小基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響。取未檢出農(nóng)藥殘留的豬肉、雞肉、羊肉，按照前處理方法處理成空白基質(zhì)液，配制曲線濃度為5 μg·L-1、10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以峰面積對濃度分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在5 ～200 μg·L-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。往空白樣品中添加0.010 mg·kg-1濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，前處理后上機(jī)檢測，平行測定6 份。得263 種農(nóng)藥的信噪比均大于10，確定定量限為0.010 mg·kg-1。

2.4 準(zhǔn)確度及精密度

以空白豬肉、雞肉、羊肉加標(biāo)的回收率表示方法的準(zhǔn)確度，以回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的精密度。分別在陰性樣品中加入10 μg·kg-1、20 μg·kg-1和50 μg·kg-13 個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)測定6 次，平均加標(biāo)回收率在60.6%～119.1%，精密度（RSD）小于15%，見表4。該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足畜禽肉中多種農(nóng)藥殘留的檢測要求。

表4 263 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及精密度表（n=6）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對畜禽肉中多種農(nóng)藥殘留定性鑒別和定量測定的檢測方法。前處理操作快速、簡單、低廉、有效、穩(wěn)定和安全，并且實(shí)驗(yàn)所需的試劑耗材等用量大大減少，為動(dòng)物源性食品中高脂肪、高蛋白等基質(zhì)影響提供解決思路。該方法不僅能夠覆蓋農(nóng)藥殘留檢測項(xiàng)目，實(shí)現(xiàn)高水平、高效率、高附加值的差異化服務(wù)，還能滿足客戶對肉類食品原料篩選、產(chǎn)品質(zhì)量及出口監(jiān)控等需求，大批量樣品多項(xiàng)目檢驗(yàn)的要求，為我國畜禽肉中農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測以及食品安全監(jiān)管提供科學(xué)支持。