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        秦川牛宰后成熟期間BSG對MAPK信號通路及細(xì)胞凋亡的影響

        2024-04-08 02:41:10蘇曉鳳李亞蕾羅瑞明
        食品科學(xué) 2024年6期
        關(guān)鍵詞:秦川牛宰后肌細(xì)胞

        蘇曉鳳,李亞蕾,羅瑞明

        (寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

        動(dòng)物剛被屠宰放血后,線粒體仍有一定活性,但隨著氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的終止,細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡體系被打破,活性氧大量累積,必然造成肌細(xì)胞的損傷、凋亡[1]?;A(chǔ)免疫球蛋白(basigin,BSG)是一種線粒體損傷蛋白,屬于免疫球蛋白超家族,參與許多生理過程。研究表明,BSG可以通過激活細(xì)胞漿內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路增強(qiáng)激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的表達(dá)[2]。在細(xì)胞膜上,BSG是促進(jìn)細(xì)胞單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的協(xié)同分子。而單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)將胞內(nèi)糖酵解過程生成的乳酸快速轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,從而保持糖酵解的持續(xù)進(jìn)行以及維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。由于單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增加,細(xì)胞外的微環(huán)境中乳酸含量明顯增高,進(jìn)而刺激了透明質(zhì)酸的合成。而透明質(zhì)酸的增加也會(huì)激活MAPK信號通路和PI-3K/AKT信號通路等,進(jìn)而在缺血缺氧狀態(tài)及治療腫瘤疾病中充分發(fā)揮作用[3]。

        BSG蛋白通過幾種不同的信號通路發(fā)揮作用,這些信號通路往往具有細(xì)胞特異性,其中包括MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,RAF蛋白、RAS蛋白、ERK蛋白都是該通路中的關(guān)鍵因子。Boulos等[4]研究發(fā)現(xiàn),BSG通過MAPK途徑發(fā)揮作用,激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2信號。BSG激活了子宮成纖維細(xì)胞中的ERK1/2信號通路,致使MMPs的相對表達(dá)量增加;使用siRNA敲除BSG表達(dá)可顯著降低ERK信號傳導(dǎo)[5]。衣霉素作為N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可通過作用于BSG的N端結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)去糖基化。通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊使其生物學(xué)活性降低,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

        盡管BSG基因在一些實(shí)體腫瘤中調(diào)控細(xì)胞生長和凋亡的作用已受到人們關(guān)注,但其在宰后貯藏過程肌細(xì)胞凋亡中的作用鮮見研究。因此本研究以秦川牛背上的最長肌為研究對象,采用4D-非標(biāo)記定量(4D-label free quantification,4D-LFQ)組學(xué)方法分析在4 ℃條件下不同貯藏期秦川牛肉蛋白質(zhì)水平的變化,結(jié)合京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析明確BSG所參與的通路,另外通過BSG抑制劑衣霉素作用于秦川牛背最長肌,評估衣霉素對MAPK信號通路及細(xì)胞凋亡的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        選用發(fā)育良好、體態(tài)健康的24 月齡秦川公牛。對樣品采集所用到的刀具、鑷子以及其他工具進(jìn)行高壓滅菌。按照商業(yè)化屠宰法對秦川黃牛進(jìn)行宰殺,取其背最長肌,將每頭牛的背最長肌平均分成3 份,總共9 個(gè)肉樣,每個(gè)肉樣切分成約120 g。將其用聚乙烯膜密封,并在4 ℃條件下冷藏不同時(shí)間。

        BCA蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)R-250、衣霉素 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ARAF兔克隆抗體北京索萊寶科技有限公司;ERK1兔克隆抗體、KRAS+HRAS+NRAS兔克隆抗體、MEK1/2兔隆抗體、GAPDH鼠克隆抗體、生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(H+L)美國Abclonal公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        -80 ℃冰箱、MK3型酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國Scan Speed公司;高速冷凍研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司;5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品制備

        將樣品分成空白組和衣霉素組。對衣霉素組注射濃度為20 μmol/L的衣霉素溶液,同時(shí)對空白組注射等劑量的生理鹽水。用鋁箔包裹后放入4 ℃條件下的冰箱中冷藏。貯藏0、2、4、6、8 d后,將空白組和衣霉素組的樣品取出置于液氮2 h,取出將其放入-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存,作為測定MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)含量與細(xì)胞凋亡率的樣品。

        1.3.2 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測蛋白質(zhì)含量

        參照張杏亞等[6]的方法提取蛋白質(zhì)、篩選空白組0、4、8 d的BSG并測定其相對表達(dá)量。參照羅輝等[7]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索、生物信息學(xué)分析、篩選差異蛋白質(zhì)。并利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對BSG及相關(guān)差異蛋白作KEGG分析。

        1.3.3 Western Blotting法檢測MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的含量

        1.3.3.1 總蛋白提取

        取出制備好的組織樣品放入2 mL研磨管中,向每管中倒入勻漿液(樣品與裂解液質(zhì)量比1∶10)和3 mm鋼珠,于高速冷凍研磨儀內(nèi)勻漿,其中溫度設(shè)置為-20 ℃,時(shí)間設(shè)置為60 s,重復(fù)研磨4 次,使組織碾碎。將研磨好的樣品取出來,4 ℃的冰箱里裂解30 min,在12 000 r/min條件下離心10 min,離心結(jié)束后將上清液倒出,移到新的離心管內(nèi),貯存于-20 ℃。

        1.3.3.2 樣品測定

        使用BCA蛋白定量試劑盒測定所提取的牛背最長肌總蛋白濃度。取出2 μL待測蛋白樣品,添加裂解液至16 μL,取2 μL稀釋后的蛋白溶液于孔中,并補(bǔ)充裂解液至20 μL,再加入200 μL BCA工作液混合,在37 ℃放置30 min,以0號孔為對照,測定樣品在562 nm波長處的OD值;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量(μg),并計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度。

        各樣品組取50 μL,以體積比4∶1添加5×Loading buffer,于熱循環(huán)儀中95 ℃、15 min混勻,-80 ℃保存。待積層膠凝固后,用清水洗凈待測樣品組的積層膠,進(jìn)行電泳。上樣量30 μL(5 μg/μL),電壓調(diào)至100 V,電泳約0.5 h,待指示條帶接觸到分離膠界面后,再將電壓調(diào)至180 V,繼續(xù)電泳,約90 min后,待指示條帶到達(dá)膠的底部,電泳結(jié)束。在100 V、200 mA條件下電泳,轉(zhuǎn)膜1~2 h。將PVDF膜取出,置于孵育盒內(nèi),在室溫條件下振蕩封閉2 h。去除封閉液,用含吐溫-20的Tris緩沖液(Tris buffered saline with Tween-20,TBST)略微清洗,將其擦干并剪切出所需的PVDF薄膜。

        加入相應(yīng)的一抗于密封盒內(nèi),于4 ℃進(jìn)行一夜的孵育培養(yǎng);用TBST將PVDF膜洗滌5 min,共洗滌3 次。加入相應(yīng)的二抗,置于搖床在室溫下培育2~3 h。將PVDF膜用TBST清洗3 次,每次10 min左右。

        將PVDF膜平鋪在曝光板上,滴加顯影液,反應(yīng)1 min,在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀下進(jìn)行顯影,并依據(jù)信號的強(qiáng)弱,對曝光程度以及曝光時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。采用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描,分別測定牛背最長肌ARAF、ERK1、KRAS+HRAS+NRAS、MEK1/2蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

        1.3.4 秦川牛肉貯藏過程中caspase-3活力的測定

        取200 mg的冷凍肉樣,在冷凍條件下,加入0.5 mL 100 mol/L Hepes(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% NP-40、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖、10 mol/L mDTT,pH 7.5)裂解液破碎勻漿,在-20 ℃條件下反復(fù)凍融3 次,再18 000×g離心30 min,取其上清液,在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩7磻?yīng)液則由20 μL裂解物的上清液、0.2 mL反應(yīng)緩沖液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% CHAPS、100 mmol/L Hepes,pH 7.5)以及5 μL重建的熒光底物組成。caspase-3作用的底物為Ac-DEVD-AMC。將反應(yīng)溶液放入酶標(biāo)儀96 孔板中,37 ℃孵育1 h,激發(fā)波長為360 nm,發(fā)射波長為460 nm,測其熒光強(qiáng)度。酶活性以1 min時(shí)1 mg肉樣品的相對熒光強(qiáng)度表示。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        運(yùn)用SPSS 28統(tǒng)計(jì)軟件,通過ANOVA單因素方差分析法、Duncan多重比較對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,明確數(shù)據(jù)之間的差異顯著性(P<0.05)。并采用Origin 2021軟件對所得數(shù)據(jù)作圖。結(jié)果以表示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

        2.1.1 BSG的篩選及表達(dá)量的變化

        利用4D-LFQ組學(xué)方法對宰后牛肉蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化進(jìn)行了研究和分析,并利用MaxQuant軟件對獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢索,共得1 149 個(gè)蛋白質(zhì),從中篩選出BSG,其表達(dá)變化見表1。BSG表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在0~4 d,BSG表達(dá)量呈顯著上升趨勢(P<0.05)。宰后0 d的BSG表達(dá)量為0.824,宰后4 d的BSG表達(dá)量為1.146。此時(shí),隨著成熟時(shí)間的延長,牛肌細(xì)胞的線粒體損傷水平也逐漸提升,肉嫩度得到改善。宰后8 d的BSG表達(dá)量為0.971,與第4天相比,BSG表達(dá)量降低;此時(shí)隨著肉質(zhì)的進(jìn)一步成熟,牛的肌細(xì)胞線粒體損傷水平也降低,使得嫩度下降。結(jié)果表明,BSG作為一種線粒體損傷蛋白,其表達(dá)量與細(xì)胞損傷程度成正比,對肌肉結(jié)構(gòu)蛋白降解程度起到正向調(diào)控作用。

        表1 秦川牛宰后貯藏期間BSG表達(dá)量的變化Table 1 Change in BSG concentration of Qinchuan cattle muscle during storage

        2.1.2 差異蛋白質(zhì)的篩選

        設(shè)置差異倍數(shù)為1.2且P<0.05,共篩選鑒定出120 個(gè)差異豐富的蛋白質(zhì)。其中4 d與0 d鑒定出38 個(gè)差異表達(dá)蛋白,8 d與0 d鑒定出73 個(gè)差異表達(dá)蛋白,8 d與4 d鑒定出42 個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過UniProt軟件對所篩差異蛋白進(jìn)行檢索,利用功能特性篩出與BSG相關(guān)的差異蛋白,將此類蛋白質(zhì)與BSG表達(dá)量作相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示。這些蛋白質(zhì)與BSG的表達(dá)均顯著相關(guān)。

        表2 秦川牛背最長肌貯藏0、4、8 d與BSG相關(guān)差異蛋白對比Table 2 Comparison of BSG-related differentially expressed proteins in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle stored for 0,4,and 8 days

        2.1.3 KEGG分析

        對BSG及其差異蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG分析,結(jié)果如表3所示。顯著注釋于氧化磷酸化通路、鈣信號通路、MAPK信號通路。其中,在呼吸鏈電子傳遞復(fù)合物產(chǎn)生質(zhì)子梯度的情況下線粒體ATP合酶復(fù)合體亞基δ(ATP5F1D)使ADP生成ATP。NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物亞基6(NDUFA6)是線粒體膜呼吸鏈NADH脫氫酶復(fù)合物I的輔助亞基,一般不參加催化作用,復(fù)合物I在將電子從NADH轉(zhuǎn)移到呼吸鏈過程中起一定效果。ATP5F1A、ATP5F1B則位于線粒體內(nèi)膜上,是氧化磷酸化結(jié)構(gòu)蛋白的核心[8]。NDUFA6主要是參與線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的組裝和氧化還原過程。肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶3(ATP2A3)是一種鎂依賴性酶,催化ATP的水解與鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)。線粒體內(nèi)膜的氧化磷酸化是ATP的主要來源[9]。以上結(jié)果表明,BSG參與了秦川牛肉宰后貯藏期間能量物質(zhì)代謝與線粒體損傷,并對MAPK信號通路調(diào)節(jié)起到重要作用[10]。

        表3 與BSG表達(dá)相關(guān)差異蛋白KEGG富集分析Table 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins related to BSG expression

        2.2 秦川牛背最長肌MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)情況

        2.2.1 秦川牛背最長肌ARAF蛋白表達(dá)情況

        采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測法比較秦川牛宰后貯藏過程中空白組和衣霉素組ARAF蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果見圖1。隨貯藏時(shí)間的延長,空白組與衣霉素組的ARAF蛋白相對表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在貯藏0~4 d時(shí),空白組與衣霉素組的ARAF蛋白表達(dá)水平顯著升高。在第4天時(shí),兩組肉樣的ARAF的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。在貯藏4~8 d時(shí),空白組與衣霉素組的ARAF表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢。另外,在貯藏第0、2、4、6、8天時(shí),衣霉素組的ARAF蛋白相對量均明顯降低(P<0.05)。說明在用衣霉素抑制BSG后,ARAF蛋白表達(dá)明顯減少。

        圖1 秦川牛背最長肌ARAF蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of ARAF protein in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

        2.2.2 秦川牛背最長肌ERK1蛋白表達(dá)情況

        如圖2所示,在貯藏期0~4 d時(shí),空白組與衣霉素組ERK1蛋白的表達(dá)水平顯著升高。而在貯藏期4~8 d,空白組ERK1蛋白的相對表達(dá)量呈先下降后升高的趨勢,在第8天,ERK1蛋白的相對表達(dá)量達(dá)到最大值。宰后秦川牛肉在貯藏第0、2、4、6、8天時(shí),衣霉素組ERK1的表達(dá)水平相較于空白組均明顯下降。說明在使用衣霉素抑制BSG后,ERK1蛋白表達(dá)明顯減少[11]。

        圖2 秦川牛背最長肌ERK1蛋白表達(dá)情況Fig.2 ERK1 protein expression in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

        2.2.3 秦川牛背最長肌KRAS+HRAS+NRAS蛋白表達(dá)情況

        RAS是一種GTP結(jié)合蛋白,具有激活MAPK信號通路的作用[12]。其主要包括KRAS、HRAS及NRAS 3 種亞型。如圖3所示,隨著貯藏時(shí)間的延長,空白組與衣霉素組的KRAS+HRAS+NRAS蛋白的相對表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢。在0~4 d時(shí),空白組與衣霉素組的KRAS+HRAS+NRAS蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯升高。在第4天時(shí),兩組的蛋白水平達(dá)到最高。在貯藏期4~8 d時(shí),空白組與衣霉素組的蛋白表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢。另外,在貯藏期間衣霉素組的KRAS+HRAS+NRAS相對表達(dá)量相較于空白組均明顯下降。說明在使用衣霉素抑制BSG后,KRAS+HRAS+NRAS蛋白表達(dá)明顯減少。

        圖3 秦川牛背最長肌KRAS+HRAS+NRAS蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of KRAS+HRAS+NRAS proteins in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

        2.3 秦川牛肉貯藏過程中caspase-3活力的變化情況

        細(xì)胞凋亡是一種通過激活依賴能量的細(xì)胞內(nèi)死亡程序而導(dǎo)致多基因協(xié)調(diào)控制細(xì)胞自發(fā)、有序的死亡方式[13]。細(xì)胞一般在缺氧缺血狀態(tài)時(shí)會(huì)誘發(fā)其凋亡,這與畜禽屠宰后肌細(xì)胞所處狀態(tài)類似[14]。caspase-3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡水平密切相關(guān),其在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[15-18]。凋亡因子Cyt-c的釋放最終影響caspase-3的活性,激活線粒體凋亡級聯(lián)反應(yīng)[19-20]。如圖4所示,隨著貯藏時(shí)間的延長,空白組與衣霉素組的caspase-3活力均呈先上升后下降的趨勢。衣霉素組的caspase-3活力相較于空白組均明顯上升,表明在使用衣霉素抑制BSG后,caspase-3活力明顯增加。由此說明通過沉默BSG基因的表達(dá)后,細(xì)胞的凋亡率顯著增高。Intasai等[21]通過封閉單核細(xì)胞系U937的BSG蛋白質(zhì)表達(dá)后,細(xì)胞凋亡增加,說明BSG參與部分細(xì)胞凋亡路徑的調(diào)節(jié),其凋亡機(jī)制與激活caspase相關(guān),與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。

        圖4 秦川牛宰后caspase-3活力變化Fig.4 Change of caspase-3 activity in Qinchuan cattle muscle after slaughter

        3 討論

        BSG是一種高度糖基化的跨膜蛋白,BSG通過MAPK途徑發(fā)揮作用,可以激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2信號。衣霉素則可通過作用于蛋白質(zhì)的N端結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)去糖基化。通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊使其生物學(xué)活性受到抑制,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[22-23]。動(dòng)物宰后肌細(xì)胞所處的缺氧缺血環(huán)境、肌肉pH值的變化、肌細(xì)胞內(nèi)外空間的變化都表明宰后肌細(xì)胞發(fā)生凋亡過程的理論可能性,也有相關(guān)研究表明宰后肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象確實(shí)存在[24-25]。動(dòng)物死后肉的嫩化是一個(gè)涉及多種蛋白水解酶的復(fù)雜生物化學(xué)過程,凋亡引起的細(xì)胞死亡是此過程的一種新機(jī)制。細(xì)胞凋亡是肌細(xì)胞損傷機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),它可以通過激活信號通路啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡蛋白系統(tǒng),從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序化死亡[26]。MAPK家族是一類重要的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng),當(dāng)細(xì)胞處于損傷狀態(tài)時(shí),p38 MAPK應(yīng)急信號途徑被快速啟動(dòng),進(jìn)而激活c-Jun氨基未端激酶信號通路,調(diào)控ERK信號通路水平,從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等一系列的生理過程[27]。在細(xì)胞損傷中ERK也起著較為重要的作用。

        在衣霉素組中,ARAF、ERK1、KRAS+HRAS+NRAS的相對表達(dá)量均顯著下調(diào),這與于甜樂[28]的研究結(jié)果一致,由此表明,這3 種蛋白質(zhì)相對水平的下降,阻礙了MAPK家族信號通路系統(tǒng)的激活,使信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的過程受阻,多種轉(zhuǎn)錄因子不表達(dá)或表達(dá)較少,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在宰后肌細(xì)胞損傷過程中,BSG通過失活MAPK信號通路引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng),從而致使細(xì)胞凋亡。在抑制BSG的表達(dá)后,相比于空白組,衣霉素組的caspase-3的相對表達(dá)量明顯上升,證明細(xì)胞凋亡是細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)。Baba等[29]發(fā)現(xiàn)BSG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與糖酵解代謝的不協(xié)調(diào)有關(guān),Kuang Yehong等[30]發(fā)現(xiàn)抑制耐藥性腫瘤細(xì)胞的BSG表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞的凋亡,這與X連鎖凋亡抑制蛋白密切相關(guān)。BSG抑制劑通過失活MAPK信號通路使BSG蛋白下調(diào),從而阻斷肌細(xì)胞的能量來源,誘導(dǎo)肌細(xì)胞凋亡。因此,BSG可能通過阻止肌細(xì)胞的能量供應(yīng)誘導(dǎo)活性氧生成,使線粒體外膜受損,導(dǎo)致Cyt-C釋放,從而啟動(dòng)caspase家族信號通路,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

        4 結(jié)論

        利用4D-LFQ組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)宰后隨貯藏時(shí)間的延長,秦川牛肉中BSG含量先上升后下降,BSG及其差異蛋白質(zhì)顯著注釋于氧化磷酸化通路、鈣信號通路、MAPK信號通路,說明BSG通過MAPK途徑發(fā)揮作用。通過向秦川牛肉的背最長肌中注射BSG抑制劑的方法,有效干擾了BSG蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外采用蛋白質(zhì)免疫印跡法測定秦川牛肉在貯藏過程中MAPK通路相關(guān)蛋白質(zhì)ARAF、ERK1以及KRAS+HRAS+NRAS的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)衣霉素組的MAPK通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量均顯著下調(diào),說明BSG抑制劑使MAPK信號通路失活。這為研究BSG對MAPK信號通路影響奠定了良好的基礎(chǔ)。另外,在抑制BSG表達(dá)后,相比于空白組,衣霉素組的caspase-3的活力明顯上升,說明細(xì)胞凋亡是細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié),BSG參與宰后肌細(xì)胞凋亡路徑的調(diào)節(jié),其凋亡機(jī)制與激活caspase相關(guān)。衣霉素通過作用于BSG的N端結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)發(fā)生去糖基化作用。通過細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的未折疊反應(yīng)使其生物活性受到抑制,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。即BSG可能通過阻斷肌細(xì)胞的能量來源,誘導(dǎo)活性氧生成,使得線粒體外膜受損,導(dǎo)致Cyt-C釋放,從而激活caspase家族級聯(lián)反應(yīng),最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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