房燁虹,齊 川,周發(fā)亮,趙 鵬,張若儀,趙海莉,任麗莉,劉 超,肖建英,劉乙蒙*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧 錦州 121000;2.錦州市婦嬰醫(yī)院遺傳科,遼寧 錦州 121000;3.山東省濱州市中心醫(yī)院口腔科,山東 濱州 251700 4.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州 121000)

CLK基因編碼的雙特異性蛋白激酶CLK(CDK-like kinase)家族有四個成員:CLK1,CLK2,CLK3和CLK4。這四種激酶蛋白的C端均有一段高度保守的序列,對應(yīng)著一個相同的氨基酸基序EHLAMMERILG,因此這些蛋白激酶又被稱為LAMMER蛋白激酶[1]。其中,CLK2可使剪接體復(fù)合物的SR蛋白磷酸化從而調(diào)節(jié)RNA的選擇性剪接[2]。這種調(diào)節(jié)機(jī)制廣泛存在于生物體內(nèi),參與細(xì)胞周期進(jìn)程、基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、和端粒長度調(diào)節(jié)等生理過程。

CLK2在眾多真核生物都有表達(dá)[3],近年來被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、肝癌等腫瘤組織中呈高表達(dá),提示其可能是一種促癌激酶。除此之外,一些研究發(fā)現(xiàn)CLK2表達(dá)的抑制,可促使早期軟骨的形成[11];對CLK2的抑制同時能抑制Wnt通路,從而促進(jìn)細(xì)胞的分化,減輕炎癥反應(yīng),促使大鼠肌腱損傷的修復(fù)[12];而CLK2在早期胚胎中的表達(dá)及其對發(fā)育的影響還未見報道。前期研究表明,CLK家族的另一成員CLK1在早期雞胚發(fā)育過程中存在一定的表達(dá)特點[4]。為了進(jìn)一步研究CLK家族在早期胚胎中表達(dá)及其作用,本研究構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒及探針,利用qPCR和原位雜交檢測CLK2 mRNA在早期雞胚發(fā)育中的表達(dá)及定位,為進(jìn)一步研究CLK2及其整個家族在雞胚中的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供受精雞蛋;pMD18-T Cloning Kit試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind III 和Xba I購自Takera公司;從羅氏公司購得地高辛標(biāo)記試劑盒;從invitrogen公司購得Platinum實時定量PCR試劑盒;從TransGen公司購得感受態(tài)細(xì)胞DH5α菌株。

1.2 雞胚胎的制備

將受精雞蛋放于37 ℃孵育箱中孵育到相應(yīng)的階段,根據(jù)漢伯格及漢密爾頓[5](Hamburger V,Hamilton HL)分期,孵化時間:4期12～13 h,6期23～25 h,8期26～29 h,10期33～38 h。敲除小部分蛋殼并用無菌注射器抽出大部分蛋清,以干燥潔凈濾紙覆蓋雞的胚胎,隨后小心沿邊緣剪下胚胎并放入PBS緩沖液中,待用。

1.3 qPCR

qPCR結(jié)果利用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,以 qPCR結(jié)果的2-△△CT做柱狀圖。組間比較采用t檢驗,P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 CLK2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以早期雞胚cDNA為模板,在反應(yīng)體系中加入特異性引物,通過PCR實現(xiàn)目的片段擴(kuò)增,其長度為574 bp。PCR擴(kuò)增條件如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。上述步驟結(jié)束后進(jìn)行電泳,以鑒定PCR產(chǎn)物。收集產(chǎn)物并進(jìn)行純化。連接目的基因與載體、轉(zhuǎn)化、選取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),繼而提取質(zhì)粒,分別以HindIII和XbaI進(jìn)行雙酶切,隨后送測序分析以進(jìn)一步檢驗。

1.5 正、反義探針的合成

擴(kuò)增測序后正確的質(zhì)粒,采用XbaI和HindIII 進(jìn)行酶切,使其線性化。以上一步得到的酶切片段為模板,通過T7體外轉(zhuǎn)錄,合成正、反義探針,并用地高辛標(biāo)記探針;隨后進(jìn)行電泳,以明確反義探針的濃度及大小。若電泳條帶清晰,且與預(yù)期大小一致,則將被用于后續(xù)操作。

1.6 原位雜交

使用PBS緩沖液洗滌先前待用的雞胚胎2次,每5 min 1次;將蛋白酶K加入洗滌過的雞胚5 min,使之分解;隨后再次清洗1次,PBS 5 min;將雞胚放入4%多聚甲醛溶液中固定10 min;以含有0.25%乙酸酐的DPEC去離子水處理10 min;加入預(yù)雜交液反應(yīng)1 h,條件65 ℃,加入新雜交液過夜,反應(yīng)條件70 ℃。上述步驟結(jié)束后在65 ℃下使用Hyb wash清洗兩次以回收探針,每次5 min;洗滌后用含有2%的BBR和20%的FBS的MABT抗體稀釋液封閉液室溫封閉2 h,anti-DIG經(jīng)1∶2000稀釋,4 ℃搖床過夜;將處理好的雞胚用MABT充分洗滌兩次,每次各30 min;加入染料顯色,拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR檢測CLK2 mRNA的表達(dá)

根據(jù)Hamburger-Hamilton(HH)分期法[5]制備了4種發(fā)育階段的雞胚,分別為4期、6期、8期和10期,提取各早期雞胚總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄分別得到各個時期的cDNA,并進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示(見圖1),CLK2 mRNA在早期雞胚中的4、6、8、10期中均有表達(dá)且程度不同,其中在6、10期表達(dá)明顯高于4、8期(P<0.01)。

圖1 qPCR檢查CLK2 mRNA在早期雞胚中的表達(dá)

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

按預(yù)先設(shè)計的PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得大小為571 bp的CLK2片段(見圖2A)。收集此片段并克隆到PMD18-T Vector上,用XbaI 和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定(見圖2B),將酶切鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行DNA測序分析,經(jīng)比對后正確。

2.3 原位雜交檢測CLK2 mRNA的表達(dá)

為進(jìn)一步驗證CLK2 mRNA在早期雞胚中的表達(dá)定位,分別選取4、8、11期雞胚,利用原位雜交檢測CLK2 mRNA的表達(dá)定位。原位雜交結(jié)果表明,4期(原腸胚時期)雞胚的CLK2 mRNA在上胚層與下胚層均有不同程度表達(dá),其集中分布于亨氏節(jié)附近,此外,在原條等部位也有少量表達(dá)。8期時,CLK2 mRNA分布于內(nèi)、中、外三個胚層的不同部位,主要表達(dá)在頭部、神經(jīng)板和神經(jīng)褶處,而在亨氏節(jié)、脊索、原條、體節(jié)處表達(dá)不那么強(qiáng)烈(圖3B);在11期中,CLK2的mRNA主要表達(dá)于眼泡和頭部部位,其他的部位例如神經(jīng)管、脊索、體節(jié)處表達(dá)稍弱(圖3C)。

圖3 原位雜交檢測CLK2 mRNA在4、8、11期雞胚中的表達(dá)

3 討 論

CLK2在多種真核生物的組織中均有廣泛表達(dá),然而在雞胚中是否存在還未有定論。之前的研究證實了與CLK2同家族的另外一個成員CLK1的 mRNA在雞胚中存在且表達(dá)[4],本研究通過qPCR檢測到CLK2 mRNA在4期雞胚中就開始表達(dá),在6期表達(dá)上升(P<0.01),在8期較先前表達(dá)水平略有下降,到10期,其表達(dá)水平出現(xiàn)顯著增高(P<0.01)。10期時某些細(xì)胞增殖活躍,CLK2 mRNA表達(dá)水平的明顯升高有可能預(yù)示著其與這些細(xì)胞的發(fā)育有密切聯(lián)系。

研究發(fā)現(xiàn),在肝臟進(jìn)行糖異生與脂肪酸的氧化過程中,CLK2的參與是必不可少的[6-7]。對秀麗隱桿線蟲的研究表明,其CLK2基因突變會導(dǎo)致多種生理指標(biāo)的變化,包括胚胎生長發(fā)育與繁殖的速度改變等[8]。本試驗制備了CLK2 mRNA探針并以地高辛標(biāo)記,成功構(gòu)建CLK2/pMD18-T質(zhì)粒,并從雞早期胚胎發(fā)育的三個階段-原腸胚形成期(HH3-5),體節(jié)形成期(HH7-8)和神經(jīng)胚形成期(HH9+)中各挑選一個時期,通過原位雜交,檢測CLK2蛋白激酶在雞胚早期發(fā)育過程中的表達(dá)及定位。原位雜交結(jié)果顯示,CLK2 mRNA在4期(原腸胚時期)于亨氏節(jié)的表達(dá)最為明顯,之前的研究表明[4],此期CLK1 mRNA主要集中于原條周圍均勻表達(dá),而在8期(體節(jié)形成期)和11期(神經(jīng)胚形成期)時,二者的表達(dá)模式十分相似-都呈現(xiàn)一種頭尾豐富表達(dá)的模式,其中CLK1[9]和CLK2[9]在頭部的表達(dá)總是最為強(qiáng)烈,這也許預(yù)示著二者的表達(dá)與神經(jīng)上皮細(xì)胞的增殖有關(guān),比如眼等某些頭部器官;在胚胎中部,神經(jīng)管及周圍,二者含量稍少;另外,在胚胎尾部,神經(jīng)溝、神經(jīng)板等部位,CLK1與CLK2均呈現(xiàn)為高表達(dá)。DOA是CLK家族在果蠅中的同源蛋白[1],有研究結(jié)果顯示,缺乏DOA可以導(dǎo)致胚胎致死和分化缺陷,可造成果蠅眼部發(fā)育畸形和神經(jīng)元發(fā)育畸形。亦有研究發(fā)現(xiàn),下丘腦神經(jīng)元中CLK1和CLK2的表達(dá)活躍,且其在很大程度上影響著神經(jīng)元功能的發(fā)揮[10]。而本研究結(jié)果也提示,在雞胚早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,CLK1和CLK2也扮演著不可或缺的角色。

4 結(jié) 論

早期雞胚發(fā)育過程中,CLK2 mRNA存在且其表達(dá)呈現(xiàn)隨發(fā)育階段變化而改變的特點,其表達(dá)部位顯示CLK2可能是影響神經(jīng)系統(tǒng)及頭部發(fā)育的重要因素之一,但其在胚胎發(fā)育中的具體作用及作用機(jī)制仍需更深層次的探究。