王俊杰，牛 蓓，2，時小東，胡凱丹，徐 鶯

（1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都大學 基礎醫(yī)學院，四川 成都 610106；3.四川大學生命科學學院，四川 成都 610065）

0 引言

黑牛肝菌（Boletus aereus Fr.ex Bull），牛肝菌屬大型可食用真菌，在我國主要分布于云南、四川、貴州等地區(qū)［1］。其子實體“低脂、低熱、高蛋白”，富含多種礦物質元素以及人體必需氨基酸，是一種食藥兩用的野生真菌［2－6］。當前，黑牛肝菌多數(shù)以鮮品或干品的形式直接售賣，功能挖掘和產(chǎn)品開發(fā)工作缺乏，導致相關產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益較低，尋找并開發(fā)其中的生物活性物質是提升黑牛肝菌附加值，促進產(chǎn)業(yè)開發(fā)和利用的途徑之一［3］。

多糖是屬于黑牛肝菌的重要生物活性成分之一，其具有降糖、降脂、抗氧化、增強機體免疫功能等出色的保健功效［1］。黑牛肝菌多糖高效提取方法的建立是其開發(fā)利用的前提。已報道的方法有超聲輔助萃取、水提醇沉法等［7］，但關于超聲輔助復合酶法提取黑牛肝菌多糖的報道未見描述。本研究開展3 種提取黑牛肝菌多糖方法效率的比較研究，并采用單因素試驗結合響應面法優(yōu)化超聲輔助復合酶提取法條件，最后采用不同的方法測試所獲得的不同醇沉組分多糖的體外抗氧化活性，以期為黑牛肝菌多糖資源產(chǎn)業(yè)化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮黑牛肝菌子實體樣品購自云南省西雙版納州景洪市牛夫人鮮黑牛肝菌栽培基地，洗凈除雜后，50℃烘干打粉，過60 目篩后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖提取單因素優(yōu)化實驗

熱水提取法。精確稱取黑牛肝菌子實體干粉5 g于錐形瓶中，以料液比（1 ∶ 20、1 ∶ 40、1 ∶ 60、1∶ 80、1∶ 100 g／mL）與蒸餾水混合后進行水?。?0、60、70、80、90℃），水浴時間為（1、2、3、4、5 h）。5 000 r／min離心10 min 并過濾后收集上清。保持條件不變復提2 次，第2 次和第3 次所用溶劑體積均為第1 次的50%。合并上清，真空濃縮至原體積的1／4 左右，加入無水乙醇至終濃度為80%。4℃靜置過夜后離心（6 000r／min，10min），沉淀復溶于水后加入1／5 體積的Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶ 1），劇烈震蕩30min 后離心，除去中間變形蛋白層和下層有機試劑層，重復該過程直至蛋白層稀薄為止。將獲得的上清液在3 500Da透析袋中透析48h后，冷凍干燥，獲得黑牛肝菌多糖。

超聲提取法。精確稱取黑牛肝菌子實體干粉5 g于錐形瓶中，以料液比（1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1∶ 50、1∶ 60g／mL）和蒸餾水混合后水浴，水浴初始設定溫度為30℃，在不同水浴功率（200、240、280、320、360 W）和不同超聲時間（10、20、30、40、50 min）的條件下進行處理。其余步驟同1.2.1.1 熱水提取法。

超聲輔助復合酶提取法。精確稱取黑牛肝菌子實體干粉5 g 于錐形瓶中，加入不同濃度（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）的復合酶溶液（纖維素酶：木瓜蛋白酶＝2∶ 1），在不同酶解溫度（30、40、50、60、70℃）、酶解時間（30、60、90、120、150 min）和超聲時間（10、20、30、40、50 min）下進行單因素實驗，之后在100℃水浴鍋中加熱10 min滅活。其余步驟與熱水提取法相同。

1.2.2 響應面優(yōu)化實驗

選擇黑牛肝菌多糖最終得率最高的提取方法，選擇酶添加量、處理溫度和時間為自變量，以提取率為響應值，依據(jù)Box－Behnken原理進行設計進行行因素三水平的響應面優(yōu)化實驗，結果如表1 所示。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.3 多糖分級醇沉組分的制備

向超聲輔助復合酶提取法獲得的提取上清液中緩慢添加無水乙醇至乙醇體積比達到20%，4 ℃靜置12 h，離心（5 000 r／min，15 min），沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到20%醇沉多糖組分BAP－20。在上清液中繼續(xù)添加無水乙醇至體積比為40%、60%、80%，重復以上操作，得到40%醇沉多糖組分BAP－40、60%醇沉多糖BAP－60 和80%醇沉多糖BAP－80。

1.2.4 多糖測定

依照鐘方曉等報道的苯酚—硫酸法［8］進行多糖含量測定。取2.0mL 不同濃度葡萄糖溶液和1.0mL6%苯酚、5.0mL濃硫酸搖勻靜置，30min后測量490nm吸光值繪制標準曲線。然后將經(jīng)同樣處理的多糖樣品的光吸收值代入標準曲線換算出多糖濃度。

1.2.5 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力測定。參考王宏亮等報道的方法［9］進行。吸取不同濃度的多糖溶液1 mL與2 mL 的含1 mmol／L DPPH 的乙醇溶液充分混勻，黑暗下靜置30 min，離心10 min 取上清液測量520 nm處吸光值（A1）。相同濃度的Vc溶液為正對照。無水乙醇為樣品對照組（A2）、純水為空白對照組（A0）。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

羥自由基清除能力測定。參考Zhang 等方法［10］進行。吸取不同濃度的多糖溶液1 mL 與1 mL ABTS工作液混勻，黑暗下靜置6 min后測量734 nm 處吸光值。以相同濃度的Vc 溶液為正對照。ABTS自由基清除率的計算公式如下：

式中：A1為樣品組吸光值；A2為對照組吸光值；A0為空白對照組吸光值。

還原力測定。參照馬麗媛等研究所提出的鐵氰化鉀還原法［11］并略作改動。取0.5 mL多糖溶液加入10 mL具塞試管中，與2.5 mL0.2 mol／L 磷酸緩沖液（pH 6.6）混勻，加入鐵氰化鉀溶液至終濃度為1%，于 50℃水 浴 20 min 后 與 2.5 mL10%CCl3COOH溶液混勻，3 000 r／min 離心10 min。取2.5 mL上清液、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液和2.5 mL蒸餾水混勻，充分反應10 min 后，于700 nm 處測定吸光值［12］。

1.2.6 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計方法

所有試驗均重復3 次，獲得數(shù)據(jù)使用Excel 2010、SPSS Statistics 24、Origin 2022 以及方差分析（ANOVA）進行處理和顯著性分析。響應面試驗采用Design－Expert 12 進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果及分析

2.1 三種黑牛肝菌多糖提取方法的單因素實驗

2.1.1 熱水提取法的單因素實驗

采用熱水提取法測定不同液料比、提取時間和溫度參數(shù)下黑牛肝菌多糖的提取率（圖1A）。當固定提取溫度和液料比為70℃和1：60g／mL 時，多糖得率隨提取時間增加而逐漸升高，在4h 時達到最高。但當提取時間增至5 h 時后，多糖得率反而略有下降，這可能是因為水浴時間過長，導致部分多糖發(fā)生水解所致［13］。將提取時間和液料比設定為4h和1：60g／mL 時，測試的提取溫度范圍從50℃到90℃，多糖得率同樣表現(xiàn)為先升高后下降，最佳溫度為70℃。設定提取溫度和時間分別為70℃和4h，液料比在1：20g／mL到1∶ 100g／mL范圍內(nèi)變化，當料液比為1∶ 80 g／mL時得率最高。

圖1 單因素試驗結果Figure 1 Single－factor experiments

綜上可得，熱水提取法提取黑牛肝菌多糖的最佳條件為：水浴時間4 h，水浴溫度70 ℃，料液比為1∶ 80 g／mL。

2.1.2 超聲提取法的單因素實驗

采用超聲提取法測定不同料液比、超聲時間和功率參數(shù)對黑牛肝菌多糖提取效率的影響（圖1B）。在料液比為1∶ 40g／mL、超聲功率為280W 的條件下，超聲時間為20 min 時得率最高，之后隨著時間增加得率逐漸降低。這可能是因為超聲會促使多糖從組織中溶出，但隨著超聲時間延長會導致多糖的降解，提取率降低［14］。在超聲時間為20min，超聲功率為280W 的條件下，料液比為1∶ 30 g／mL 時，多糖得率達到6.74%。但當料液比繼續(xù)增加后，多糖得率反而呈下降趨勢。這可能是由于增大溶劑量雖然可以使溶出更充分，而溶劑量過大會影響后續(xù)的濃縮沉淀工藝，導致得率降低［15］。在超聲時間為20min、料液比為1∶ 30g／mL時，多糖得率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在280 W時達到最高。這可能是由于超聲功率過小使得系統(tǒng)接收的能量小，分子運動速度相對偏慢，破碎效率低，而過大的功率又會影響多糖結構，從而導致得率變低所致［16］。

綜上可得，超聲提取法提取黑牛肝菌的最佳條件為：超聲時間20 min，超聲功率280W，料液比為1∶ 30g／mL。

2.1.3 超聲輔助復合酶提取法的單因素實驗

采用超聲輔助復合酶提取法測定不同酶添加量、酶解時間和溫度、超聲時間對多糖得率的影響（圖1C）。在酶解溫度為50℃、酶添加量為2.50%、超聲時間為30min的條件下，在30—60 min 的時間內(nèi)，多糖提取率呈上升趨勢，60—150 min 則呈下降趨勢。這可能是因為在酶量充足的情況下，隨著酶解時間的增加，不僅底物被不斷消耗，溶出的黑牛肝菌多糖也會被酶水解而減少所致［11］。在酶解時間為60min、酶添加量為2.50%、超聲時間為30min的條件下，隨著酶解溫度的不斷升高，多糖得率呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢，在40℃時達到最高。出現(xiàn)這種趨勢是由于溫度太低或太高都會影響酶的活性，導致其分解速率下降，從而影響多糖得率。在酶解時間為60min、酶解溫度為40℃、超聲時間為30min的條件下，多糖得率在酶添加量從1.5 %到2.00%呈現(xiàn)快速上升趨勢，達到最高點，然后隨著酶添加量的繼續(xù)增加開始緩慢下降。出現(xiàn)該趨勢可能是當酶的添加量偏低時，底物充分，得率由酶的數(shù)量驅動，而當酶添加量高于2.0 0%時，由于酶分子處于飽和狀態(tài)，反應變?yōu)榈孜矧寗有?，在底物濃度不變的情況下，底物水解速度不再增加，同時未參與纖維素降解的酶以多糖為底物將之水解，進而影響多糖含量［17］。在酶添加量為2.00%、酶解時間60min、溫度為40℃的條件下，超聲時間對提取率的影響為先上升再下降，最佳超聲時間為20 min。

綜上可得，超聲輔助復合酶提取的最佳條件為：酶解時間60 min，酶解溫度40℃，酶添加量2.00%，超聲時間20 min。

2.2 響應面試驗

根據(jù)單因素優(yōu)化實驗結果，超聲輔助復合酶提取法的得率最高。選擇該方法中對多糖得率影響較大的3 個因素（酶解溫度、酶添加量和酶解時間）為變量，以多糖得率為響應值，采用Box－Behnken 組合設計法設計，開展包括12 個析因點及5 個中心點組成的共17 組實驗，具體實驗設計及結果如表2 所示，方差分析結果如表3 所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 方差分析結果Table 3 Results of ANOVA analysis

利用Design－Expert軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進行擬合，得到多糖提取率的多元二次回歸模型：Y ＝18.33 ＋0.2875A－0.125B ＋0.8025C－0.4750AB ＋0.6AC－0.225BC－1.61A2－0.802B2－1.68C2。

由表3 可知，超聲輔助復合酶提取法的多糖得率回歸模型的p值小于0.000 1，達到極顯著水平，說明模型擬合精度良好，可用于后續(xù)提取工藝的優(yōu)化設計。失擬項p ＝0.507 1 ＞0.05，模型總決定系數(shù)R2＝0.998 4，adj＿R2＝0.996 4，說明模型擬合優(yōu)度較好，試驗誤差小，可用于響應值的預測［18－20］。

根據(jù)響應面的陡峭程度、等高線形狀分析各因素變化對多糖得率的影響以及因素間交互作用的強弱及影響作用的大?。?0］結果如圖2 所示。由圖2可知，酶添加量、酶解時間和溫度3 個因素兩兩之間的交互作用對黑牛肝菌多糖提取率的影響都非常顯著，并且該結果與回歸分析保持一致。當固定酶解時間時，酶解溫度曲線的陡峭程度大于酶添加量的曲線，表明酶解溫度對實驗結果的影響大于酶添加量（圖2A）。在固定酶添加量時，響應曲面圖開口向下，兩個方向的響應面均呈現(xiàn)出先上升后下降的陡峭變化曲線，即酶解溫度和酶解時間的增加對多糖得率的影響都是先促進后抑制，這與單因素結果保持一致（圖2B）。從圖2C 可見，當固定酶解溫度時，酶添加量和水浴時間對多糖得率的影響均是先增加再降低的趨勢。

圖2 因素間交互作用對黑牛肝菌多糖提取的影響Figure 2 Influence of response surface plots of variable parameters on the B.aereus polysaccharide yield

綜上，優(yōu)化結果為：酶解溫度42.7 ℃，酶解時間67 min，酶添加量為1.92 %，超聲時間為20 min。此方案下的預期黑牛肝菌多糖得率為18.867%。

2.3 黑牛肝菌多糖的體外抗氧化活性研究

對獲取的黑牛肝菌多糖水溶液進行逐級醇沉，獲得不同分子量的4 種組分：BAP20、BAP40、BAP60和BAP80，4 種組分的多糖含量分別為86.01%、69.55%、75.95%、65.61%。以Vc 為對照，分別采用DPPH、ABTS、羥自由基清除能力和還原力測定4種方法測定4 種組分的體外抗氧化活性，結果如圖3 所示。

圖3 黑牛肝菌多糖的體外抗氧化活性Figure 3 The in vitro antioxidant activity of B.aereus polysaccharides

結果顯示，各醇沉組分均展示出了劑量依賴性的抗氧化能力，其中BAP－80 的各項抗氧化活性均最高。當濃度為5mg／mL 時，對DPPH 自由基的清除率達到68.03%，在此濃度下的維生素C 清除率為72.37%，兩者無顯著性差異（p ＞0.05）；ABTS自由基清除率為94.65%，同濃度維生素C 清除率為89.83%，黑牛肝菌多糖對于ABTS 自由基的清除能力略高于維生素C；羥自由基清除率為62.85%，同等濃度的維生素C 清除率達到85.62%，黑牛肝菌多糖的羥自由基清除能力遠低于維生素C。黑牛肝菌多糖同樣具有良好的還原能力，BAP－80 依然為最高活性組分。分析不同醇沉組分的組內(nèi)關系，基本呈現(xiàn)出醇沉濃度越高，得到的多糖組分抗氧化活性越高的趨勢。

3 討論

高得率的多糖提取方法是黑牛肝菌多糖開發(fā)利用的前提，本研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助復合酶提取法的多糖得率遠高于其它兩種方法，通過響應面法優(yōu)化后的平均得率為18.47%，并且獲得的黑牛肝菌多糖表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性，說明黑牛肝菌多糖具有深度開發(fā)的潛力。

在黑牛肝菌多糖提取中，熱水提取法的得率在5%左右，提取時間在4h 左右［21］，超聲輔助提取法的得率約為 10%，提取時間僅需 30min 左右［12，22－24］。兩相比較可以看出后者不僅在得率上達到提高，在時間效率方面也有很大優(yōu)勢，可以降低提取能耗。超聲輔助復合酶提取法則在保持超聲輔助提取法的優(yōu)勢上，進一步將多糖得率提高了80%，這無疑會大大降低原料成本。從原理上來說，真菌的多糖組要存在于其細胞壁，后者包括纖維素、殼多糖、蛋白質以及其他次生代謝產(chǎn)物。超聲處理和酶解處理都能促進細胞壁的破碎，釋放出其中的多糖分子。不僅如此，超聲還可形成微流，使溶劑更易進入，使得酶與細胞壁接觸更充分。有文獻研究表明纖維素酶對纖維素的可及性是制約酶解效率的重要參數(shù)，貢獻度達到90%以上［26］，因此超聲和酶解共同處理的效果不是單純的數(shù)量相加關系。

抗氧化活性是多糖的主要生物活性之一。影響多糖抗氧化活性高低的因素很多，如分子量、糖基組成、鏈結構等，一般而言，高分子量、復雜的多糖結構可能表現(xiàn)出更強的抗氧化活性。然而有意思的是，本研究中分子量最低的BAP—80 組分體外抗氧化活性表現(xiàn)最為突出。已有文獻報道云南大理黑牛肝菌同樣在醇沉濃度為80%時得到的多糖提取物抗氧化活性最強［7］?？紤]到BAP—80 組分的多糖含量在4 種組分中最低，因此不能排除其中可能含有其他成分如多酚、糖醛酸、蛋白類物質參與了氧化還原反應［27－29］，因此在后續(xù)的研究中非常有必要開展進一步的純化工作。