李曉宇, 張永詠, 秦 娟, 楊忠信

(河南大學第一附屬醫(yī)院, 1. 心血管內(nèi)科, 2. 胸外科, 河南 開封, 475000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性血管性疾病[1]。內(nèi)皮細胞損傷是AS發(fā)生發(fā)展的主要誘因[2]。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)是AS的危險因素,其參與內(nèi)皮功能障礙和泡沫細胞形成,可引起血管內(nèi)皮損傷[3]。研究[4]表明,微小RNA(miRNA)參與內(nèi)皮細胞的損傷,例如miR-129-5p介導的Beclin-1可抑制AS中的內(nèi)皮細胞自噬[5]。circ_0000345通過靶向miR-129-5p軸減輕人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)中ox-LDL介導的損傷[6]。miR-129-5p還可減輕脂多糖(LPS)誘導的急性腎損傷[7]。但miR-129-5p影響oxLDL誘導血管內(nèi)皮細胞損傷的機制尚不清楚。研究[8]報道,敲低長鏈非編碼RNA(lncRNA)NUTM2A-AS1通過靶向let-7c-5p/HMGB1軸減輕LPS誘導的人牙髓細胞損傷。經(jīng)預測, miR-129-5p與lncRNA NUTM2A-AS1存在互補序列,但lncRNA NUTM2A-AS1對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷及機制是否與miR-129-5p有關(guān)尚未完全闡明。本研究探討lncRNA NUTM2A-AS1靶向miR-129-5p調(diào)控oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的機制研究,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HUVEC,DMEM培養(yǎng)基(上海雅吉生物科技有限公司); oxLDL(上海高創(chuàng)化學科技有限公司); Trizol試劑(南京森貝伽生物科技有限公司); 丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒(上海吉至生化科技有限公司); 熒光定量試劑盒(上海研卉生物科技有限公司); 細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液(北京百奧萊博科技有限公司); 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)。

1.2 細胞處理與分組

將HUVEC培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基,將lncRNA NUTM2A-AS1過表達載體和小干擾RNA以及相應對照(pcDNA和si-NC)分別轉(zhuǎn)染至細胞,分別記為pcDNA-NUTM2A-AS1組、pcDNA組、si-NUTM2A-AS1組、si-NC組;用100 μg/mL的oxLDL處理細胞,設為oxLDL組,另將常規(guī)培養(yǎng)的細胞設為Con組。將lncRNA NUTM2A-AS1干擾表達載體及陰性對照、miR-129-5p模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染至HUVEC后,用100 μg/mL的oxLDL處理,分別記為oxLDL+si-NUTM2A-AS1組、oxLDL+si-NC組、oxLDL+miR-129-5p組、oxLDL+miR-NC組;將NUTM2A-AS1干擾表達載體與miR-129-5p抑制劑或陰性對照共轉(zhuǎn)染至HUVEC后,用100 μg/mL的oxLDL處理,分別記為oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-129-5p組、oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-NC組。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)

用Trizol試劑提取各組HUVEC的總RNA, 合成cDNA后按熒光定量試劑盒說明進行PCR, 以GAPDH和U6為內(nèi)參,相對表達量用2-△△Ct法計算。lncRNA NUTM2A-AS1上游引物5′-ATAGCTCACTGTAGCCTCG-3′, 下游引物5′-TTTGTTGTATGTAGACCCATC-3′; miR-129-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGCTTTTTGCGGTCTGG-3′, 下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;GAPDH上游引物 5′-GGTCACCAGGGCTGCTTT-3′, 下游引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 下游引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 氧化應激分析

采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗各組細胞,隨后采用超聲方法裂解細胞,離心,取上清,按試劑盒說明書檢測MDA含量和SOD、GSH-Px活性。

1.5 流式細胞儀檢測

采用1×結(jié)合緩沖液重懸各組細胞,隨后與5 μL Annexin V-FITC和PI避光染色5 min,最后流式檢測。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法

使用RIPA提取細胞裂解物,定量后, 30 μg蛋白質(zhì)樣品與5×緩沖液混合, 95 ℃下煮沸20 min, 15% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),隨后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后,與相應一抗于4 ℃孵育過夜,清洗后,加入二抗室溫孵育2 h, 然后用化學發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白條帶。

1.7 雙熒光素酶報告實驗

將預測的含有miR-129-5p序列的片段克隆并插入psiCHECK-2質(zhì)粒構(gòu)建野生型熒光素酶載體,隨后將片段序列點突變,插入載體構(gòu)建突變型熒光素酶載體。在六孔板中,當細胞培養(yǎng)至約70%融合,將構(gòu)建的載體和miR-NC或miR-129-5p共轉(zhuǎn)染至細胞中,依次將細胞分為miR-NC和WT-NUTM2A-AS1共轉(zhuǎn)染組、miR-129-5p和WT-NUTM2A-AS1共轉(zhuǎn)染組、miR-NC和MUT-NUTM2A-AS1共轉(zhuǎn)染組、miR-129-5p和MUT-NUTM2A-AS1共轉(zhuǎn)染組。48 h后,檢測熒光素酶活性。

1.8 RNA下拉實驗

構(gòu)建生物素標記miR-129-5p和miR-NC探針,并將其轉(zhuǎn)染入HUVEC細胞,分別設為bio-miR-129-5p組和bio-miR-NC組。隨后收集細胞裂解液,與鏈霉親和素包被的磁珠孵育。采用qRT-PCR檢測lncRNA NUTM2A-AS1的富集量。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 Con組與oxLDL組lncRNA NUTM2A-AS1、miR-129-5p表達比較

相較于Con組,oxLDL組lncRNA NUTM2A-AS1表達水平升高, miR-129-5p表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 Con組與oxLDL組lncRNA NUTM2A-AS1、miR-129-5p表達比較

2.2 干擾lncRNA NUTM2A-AS1表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

與Con組比較, oxLDL組lncRNA NUTM2A-AS1表達水平、MDA含量升高, SOD、GSH-Px活性降低,血管內(nèi)皮細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與oxLDL+si-NC組比較, oxLDL+si-NUTM2A-AS1組lncRNA NUTM2A-AS1表達水平、MDA含量降低,SOD、GSH-Px活性升高,血管內(nèi)皮細胞凋亡率和cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1、表2。

A: 凋亡相關(guān)蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。

表2 干擾lncRNA NUTM2A-AS1表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

2.3 miR-129-5p是lncRNA NUTM2A-AS1的功能靶標

StarBase預測結(jié)果顯示, miR-129-5p與lncRNA NUTM2A-AS1存在互補序列,見圖2。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,上調(diào)miR-129-5p降低了WT-NUTM2A-AS1細胞熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表3。RNA下拉實驗結(jié)果顯示,在bio-miR-129-5p探針下拉的復合物中, NUTM2A-AS1的豐度更高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表4。過表達lncRNA NUTM2A-AS1可抑制miR-129-5p的表達,敲低lncRNA NUTM2A-AS1可上調(diào)miR-129-5p的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表5。

圖2 miR-129-5p與lncRNA NUTM2A-AS1互補序列的StarBase預測結(jié)果

表3 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

表4 RNA下拉實驗結(jié)果

表5 lncRNA NUTM2A-AS1調(diào)控miR-129-5p的表達

2.4 過表達miR-129-5p對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

與oxLDL+miR-NC組比較, oxLDL+miR-129-5p組miR-129-5p表達水平升高, MDA含量降低, SOD、GSH-Px活性升高,血管內(nèi)皮細胞凋亡率和cleaved-caspase9、cleaved-caspase3表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表6、圖3。

A: 凋亡相關(guān)蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。

表6 miR-129-5p過表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

2.5 下調(diào)miR-129-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNANUTM2A-AS1表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用

與oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-NC組比較, oxLDL+si-NUTM2A-AS1+anti-miR-129-5p組miR-129-5p表達水平降低,MDA含量升高, SOD、GSH-Px活性降低,血管內(nèi)皮細胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4、表7。

A: 凋亡相關(guān)蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。

表7 下調(diào)miR-129-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA NUTM2A-AS1表達對oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用

3 討 論

AS是一種與氧化應激和內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的慢性血管炎癥性疾病,而炎癥反應、氧化應激等是引起內(nèi)皮細胞損傷的重要因素[9-11]。oxLDL介導的血管內(nèi)皮細胞損傷是AS的早期行為和主要信號[12]。因此,本研究采用oxLDL處理血管內(nèi)皮細胞構(gòu)建損傷模型。結(jié)果顯示, oxLDL作用的血管內(nèi)皮細胞中MDA含量升高, SOD、GSH-Px活性降低,血管內(nèi)皮細胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達水平升高,證實oxLDL誘導了血管內(nèi)皮細胞氧化損傷。miRNA參與調(diào)控細胞損傷過程,研究[13]顯示,慢性心力衰竭患者血清中miR-129-5p下調(diào), miR-129-5p上調(diào)則可減輕慢性心力衰竭大鼠的氧化應激和炎癥反應。miR-129-5p可防止心肌缺血再灌注損傷[14], 并可有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大和氧化應激[15]。miR-129-5p通過下調(diào)SOX6減輕阿爾茨海默病的炎癥反應和神經(jīng)損傷[16]。隨后,本研究同樣觀察到miR-129-5p在oxLDL處理的血管內(nèi)皮細胞中水平下調(diào),上調(diào)其表達后MDA含量降低, SOD、GSH-Px活性升高,血管內(nèi)皮細胞凋亡得到抑制,表明過表達miR-129-5p抑制了oxLDL作用后的血管內(nèi)皮細胞氧化應激及細胞凋亡,說明miR-129-5p對內(nèi)皮細胞同樣具有抑制損傷的作用,與既往研究結(jié)果相符。

生物學軟件預測發(fā)現(xiàn), lncRNA NUTM2A-AS1與miR-129-5p有結(jié)合位點。oxLDL處理的血管內(nèi)皮細胞中l(wèi)ncRNA NUTM2A-AS1表達水平升高,提示lncRNA NUTM2A-AS1可能與血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)。干擾lncRNA NUTM2A-AS1表達后, MDA含量降低, SOD、GSH-Px活性升高,血管內(nèi)皮細胞凋亡抑制,表明干擾lncRNA NUTM2A-AS1表達可抑制oxLDL作用的血管內(nèi)皮細胞氧化應激和細胞凋亡。此外, lncRNA NUTM2A-AS1能夠靶向調(diào)控miR-129-5p, 而敲低miR-129-5p表達能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA NUTM2A-AS1下調(diào)介導的血管內(nèi)皮細胞損傷抑制。

綜上所述,敲低lncRNA NUTM2A-AS1可以破壞oxLDL誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化及凋亡損傷,主要通過lncRNA NUTM2A-AS1/miR-129-5p軸介導,這些發(fā)現(xiàn)可能對AS未來治療方法的設計具有指導意義。