蔡曼珊，王晨燕，陳銘怡，侯 博*，瞿 浩*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣東廣州 510640；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；3.廣東智威農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，廣東廣州 510640；4.豬禽種業(yè)全國重點實驗室，廣東廣州 510640）

滑液囊支原體（Mycoplasma synovia，MS）是感染雞和火雞的一種致病性病原體，目前已廣泛存在于我國不同品種雞群中。2010—2015 年我國21 個省份的44395 只非免疫雞MS 抗體總陽性率為41.19%，不同年份血清陽性率在24.70%～57.20%；在463 個商品雞群中，375 個（80.99%）雞群MS 血清抗體陽性[1]；同期，MS 病原調(diào)查表明MS 在我國多日齡混養(yǎng)的地方品種肉雞中廣泛流行，雞胚中的感染率已達16.29%[2]。福建地區(qū)2018—2020 年非免疫蛋雞群MS 抗體總陽性率為64.09%，非免疫肉雞群MS 病原總陽性率為49.62%，且MS 抗體陽性率和病原陽性率在肉雞和蛋雞中均表現(xiàn)為隨日齡增加而升高，各年齡段蛋雞MS 抗體均為陽性[3]。因此評價MS 疫苗在商品雞群中的免疫效果，對于開展MS 防控技術(shù)研究具有十分重要的意義，且可以為臨床生產(chǎn)實踐中MS 感染防控積累經(jīng)驗?；耗抑гw感染主要引起傳染性滑膜炎和腱鞘炎以及亞臨床的呼吸道癥狀，此外還具有較強的水平傳播和垂直傳播能力[4]。MS 以不同途徑感染SPF 雞后臨床表現(xiàn)和發(fā)病率差異較大，爪墊注射和胸部皮下注射可導(dǎo)致100%的雞發(fā)生爪墊腫大或胸部囊腫，而氣管注射可引起33%～50%的雞發(fā)生嚴(yán)重氣囊炎，點眼感染基本不能引起臨床病理變化，但點眼感染的氣管MS 病原再分離率可達100%[5]。在臨床上，MS 感染主要表現(xiàn)為上呼吸道亞臨床癥狀或無癥狀，通過點眼人工感染SPF 雞，很難表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但是支原體可以在氣管中長期存在[5]，在產(chǎn)蛋雞造成蛋重和產(chǎn)蛋數(shù)量下降[6,7]，并且引起產(chǎn)蛋雞的蛋殼頂端異常（Eggshell Abonormalities，EAA）[8,9]，造成蛋品質(zhì)下降和破損率增加，在種雞造成垂直傳播、雞胚孵化率下降[10]，在商品肉雞導(dǎo)致飼料報酬率和胴體品質(zhì)等級降低[10,11]。因此MS 的大范圍流行給家禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前，MS 的預(yù)防和治療多采用敏感性的抗生素來實現(xiàn)，但經(jīng)過短期抗生素的使用卻不能徹底根治MS 感染，抗生素治療僅能減輕感染和降低MS 傳播速度，不能從根本上解決問題[7,12]。本研究嘗試在黃羽肉種雞中免疫MS-H 株疫苗后，定期對雞群血清抗體和上顎裂拭子中的MS-H 疫苗菌株和野毒菌株進行監(jiān)測，對MS-H 株在雞群中的定殖能力和定殖維持時間進行評估，科學(xué)評估MS-H 疫苗使用后對于MS野毒菌株感染的預(yù)防效果，為有效防控MS 提供新的技術(shù)支持，為臨床科學(xué)防控雞群MS 的感染提供科學(xué)方法或理論依據(jù)，為后續(xù)開展滑液囊支原體病的綜合防控技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

MS-H 株疫苗購自青島信得藥業(yè)有限公司，其由澳大利亞生物資源公司生產(chǎn)；MS 抗體檢測試劑盒Mycoplasma Synoviae Antibody Test Kit 購自BioChek 公司；細菌DNA 提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；可鑒別疫苗株MS-H和野毒菌株的雞滑液囊支原體雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒購自山東信達基因科技有限公司。

1.2 動物試驗設(shè)計

選取一個黃羽肉種雞父母代場，同一個品種共6 個批次雞群。每個批次在1～14 日齡使用兩輪支原體敏感抗生素進行藥物預(yù)防，21、90 日齡各免疫MS-H 活疫苗1 羽份，全程不免疫MS 滅活疫苗，14 日齡后不使用支原體敏感抗生素。從1 日齡開始以大約2 周的間隔定期跟蹤采樣，每批雞每次隨機采集24 份血液樣品和24 份上顎裂拭子，其中每3 份上顎裂拭子合并為1 個混合樣品，實行3 合一檢測。將采集的上顎裂拭子置于3mL 的PBS 緩沖液中，-20℃保存用于MS 病原熒光定量PCR 檢測。

1.3 血清抗體的檢測

將采集的血液37℃放置4h，2～8℃放置6h后，1000r/min 離心10min 后分離血清，-20℃保存用于MS 抗體檢測。采用BioChek 公司MS 抗體檢測試劑盒，按照試劑盒說明書對血清中的MS 抗體進行檢測，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)S/P值≥0.500 或效價范圍≥594，判為MS 抗體陽性，否則判為MS 抗體陰性。

1.4 MS-H 株和MS 野毒菌株的熒光定量PCR 檢測

樣品前處理參照中華人民共和國國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 《禽支原體PCR 檢測方法》（NYT 553—2015）進行，取上顎裂拭子樣品2000r/min，離心5min；取上清液1mL 置于1.5mL 離心管中，12000r/min，4℃離心10min，仔細吸取所有上清液，將沉淀采用細菌DNA 提取試劑盒提取MS基因組DNA 作為模板進行雙重?zé)晒舛縋CR 擴增檢測。

采用山東信達基因科技有限公司雞滑液囊支原體雙重?zé)晒舛縋CR 檢測試劑盒，按照說明書進行MS-H 疫苗株和野毒菌株的檢測。檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)陽性對照FAM、VIC/HEX 通道Ct 值≤32，陰性對照FAM、VIC/HEX 通道無擴增曲線，或者擴增曲線為直線或輕微斜線時，則陰陽性對照成立即試驗成立，其中FAM 通道對應(yīng)MS-H 疫苗株，VIC/HEX 通道對應(yīng)MS 野毒菌株；待測樣品結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)待測樣品有指數(shù)增長期擴增曲線且Ct 值≤36 判定為陽性，無擴增曲線判定為陰性；當(dāng)待測樣品36＜Ct 值＜40 時，判定為結(jié)果可疑，需重測，當(dāng)重測結(jié)果仍為可疑時，判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 MS 抗體檢測結(jié)果

由圖1 可知，所有雞群的雞在1 日齡采樣檢測MS 抗體均呈現(xiàn)陽性，平均滴度在3000～5000，隨著日齡的增加母源抗體水平逐漸降低，在14、28、42 日齡時MS 抗體基本呈現(xiàn)陰性，且陽性率較低。在21 日齡進行MS-H 疫苗免疫后，所有雞群在56 日齡陸續(xù)出現(xiàn)MS 抗體轉(zhuǎn)陽。

圖1 MS-H 株疫苗免疫的6 批次父母代黃羽肉種雞MS 抗體檢測

在6 批雞群中有4 批雞群在56 日齡前沒有檢測到野毒（圖2），說明56 日齡檢測到的抗體主要來源于疫苗免疫，即活苗免疫后28d 可以陸續(xù)產(chǎn)生抗體，逐漸出現(xiàn)MS 抗體轉(zhuǎn)陽，但此時的平均抗體滴度較低，一般在2000 以下。雞群20211112 批在56 日齡的MS 抗體陽性程度較高，其平均滴度接近5000（圖1），結(jié)合病原監(jiān)測數(shù)據(jù)，該批雞在42 日齡發(fā)生了較嚴(yán)重的MS 野毒感染。MS 抗體轉(zhuǎn)陽后滴度水平較少升高至5000，這與MS 野毒感染的滴度抗體水平達到10000，甚至30000 相比，疫苗免疫的MS 抗體水平較低，且MS 抗體水平起伏較小。在140 日齡雞群準(zhǔn)備開產(chǎn)時，6 批雞抗體陽性率在56%～95%，此時抗體滴度處于養(yǎng)殖全期高峰，后續(xù)沒有野毒持續(xù)刺激的情況下，在200 日齡前后抗體滴度下降到2000 左右（圖1）。

圖2 MS-H 株疫苗免疫的6 批次父母代黃羽肉種雞MS 野毒感染檢測

2.2 MS 病原的熒光定量PCR 檢測結(jié)果

6 批次雞群中，2 批次在42 日齡首次檢出野毒菌株，陽性率分別為100%、37.5%。另外4 批次群分別在70、70、84、112 日齡檢出野毒菌株，且陽性率均在25%以下（圖2）。

MS-H 疫苗菌株定殖和維持方面：6 批雞群在疫苗免疫后1 周均檢出了MS-H 株，大部分雞群在免疫后3～5 周定殖率達到了最高，均超過了80%，部分雞群的定殖率可達100%（圖3）；維持方面，檢測結(jié)果顯示直到52 周齡，MS-H 株的檢出率仍維持在62.5%～87.5%（圖3），說明雞群在90 日齡前進行兩次MS-H 株活苗免疫，在雞群中定殖率較高，且維持時間較長。通過對整個飼養(yǎng)周期野毒菌株和MS-H 疫苗株的檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)期間即使出現(xiàn)多批次野毒菌株反復(fù)感染的情況，但除了2 批雞在42 日齡出現(xiàn)一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株陽性率均未超過25%，未出現(xiàn)大范圍的MS 野毒感染（圖2 和圖3），說明即便試驗周期內(nèi)存在早期MS 野毒菌株的感染，但并未在雞群中大范圍的蔓延和擴散。

圖3 MS-H 株疫苗免疫的6 批次父母代黃羽肉種雞MS-H 株疫苗定植檢測

3 討論

從2010 年至今，滑液囊支原體感染給我國養(yǎng)雞行業(yè)造成了嚴(yán)重的危害和損失，MS 可以水平傳播和垂直傳播，一旦感染就會在雞體內(nèi)終生定殖。雖然各大養(yǎng)殖企業(yè)都采取了加強生物安全措施、支原體敏感抗生素使用、支原體滅活疫苗免疫等手段，但MS 在中國仍然廣泛流行。因此，目前的防控方法都無法阻止MS 野毒在雞群中的水平傳播，尤其是在多日齡混養(yǎng)的雞場，MS 野毒在雞場循環(huán)感染，造成雞群生產(chǎn)性能受到嚴(yán)重影響。

本研究旨在評估MS-H 株疫苗在黃羽肉種雞父母代雞群中的定殖效果和定殖時間，評價MS-H 株預(yù)防和阻止MS 野毒菌株感染的能力，給養(yǎng)殖企業(yè)提供一個有效控制MS 野毒菌株感染的方案。有研究表明在SPF 雞當(dāng)MS-H 株免疫劑量等于或大于4.8×105CCU 時，免疫后6 周進行攻毒，免疫雞的氣囊損傷程度、氣囊損傷發(fā)生率顯著降低，MS 攻毒毒株在氣管和氣囊的定殖率均顯著下降[13]，且MS-H 株誘導(dǎo)的保護性免疫在疫苗接種后至少可維持40 周[14]。本研究通過在規(guī)?；B(yǎng)殖場連續(xù)對6 批次雞群免疫后，定期跟蹤MS 抗體水平以及對MS-H 株疫苗菌株和MS 野毒菌株的檢測來看，通過滑液囊支原體活疫苗MS-H 的2 次免疫，疫苗株可以在雞體內(nèi)終生定殖，且MS 野毒菌株的感染率較低。MS-H 株活疫苗免疫可以降低MS 野毒菌株攻毒的氣管中的載量和在雞群中的水平傳播，可以使MS 陽性的多日齡農(nóng)場轉(zhuǎn)為MS 感染陰性[15]。本研究通過對6 批次雞群采用MS-H 株疫苗兩次免疫后，大部分雞群在免疫后3～5 周MS-H 株定殖率達到了最高，均超過了80%，部分雞群的定殖率可達100%，直到52 周齡MS-H 株的檢出率仍維持在62.5%～87.5%，在野毒菌株檢測方面發(fā)現(xiàn)除了2批雞在42 日齡出現(xiàn)一次100%、37.5%野毒菌株感染外，其他的野毒菌株陽性率均未超過25%，未出現(xiàn)大范圍的MS 野毒感染。有研究表明MS-H 株的免疫可以成功的替換雞群中的MS 野毒菌株[15]，而MS 滅活疫苗免疫卻不能阻止MS的感染[16]，本研究中的6 批次雞群MS 野毒菌株未發(fā)生嚴(yán)重感染可能與MS-H 株免疫阻斷MS 野毒菌株的水平傳播和替換雞群中已感染的MS 野毒菌株相關(guān)。因此從本研究中的6 批雞免疫后的抗體水平監(jiān)測、疫苗菌株在雞群的定殖和野毒在雞群的感染情況監(jiān)測，生產(chǎn)上可以通過定期監(jiān)測疫苗定殖率、野毒率、以及抗體滴度、抗體離散度來判斷雞群免疫是否成功以及野毒感染情況。由于種雞感染MS 后，可造成蛋殼質(zhì)量變差、孵化率下降以及引起垂直傳播，因此在種雞中的支原體疫苗免疫的最主要目的是避免中大雞或產(chǎn)蛋雞的MS 野毒菌株感染。在本研究的20211112 批的雞群中，雞群在42 日齡已經(jīng)監(jiān)測到100%野毒感染，56 日齡抗體滴度接近5000，即使雞群已經(jīng)進行了活疫苗免疫，且活疫苗定殖率最高時達到100%，仍然出現(xiàn)了早期嚴(yán)重的野毒感染和不同日齡野毒的多次檢出，提示在生產(chǎn)上，除了做好疫苗免疫外，要抓好飼養(yǎng)管理，包括雞群健康、生物安全、環(huán)境消毒等，采取綜合措施以減少野毒菌株在雞群的水平感染。本研究結(jié)果顯示MS-H 株疫苗的使用以及在雞群的定殖可能會阻止MS 野毒菌株的感染，控制MS 感染在雞群的水平擴散和傳播，這將為控制和根除MS 感染具有重要作用。

4 結(jié)論

商品化的MS-H 株疫苗黃羽肉種雞群中，進行2 次免疫，可以成功的阻止MS 野毒株在雞群中的水平傳播能力，降低MS 野毒株的感染率。