肖龍菲，王相國(guó)

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

乳腺炎是乳腺的一種炎癥性疾病，是奶牛的主要疾病之一，它通常是由乳房?jī)?nèi)細(xì)菌感染和化學(xué)、熱或機(jī)械損傷引起，金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性微生物）和大腸桿菌（革蘭氏陰性微生物）是主要的乳腺炎病原體，其次是酵母菌和真菌。乳腺炎的發(fā)生不僅導(dǎo)致牛奶質(zhì)量和數(shù)量的下降，還可引起泌乳持續(xù)性降低和奶牛過(guò)早淘汰，嚴(yán)重制約畜牧業(yè)的發(fā)展，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。一直以來(lái)主要依靠免疫接種或藥物治療等方法防治乳腺炎，但這沒(méi)有從根本上消滅和控制疾病的發(fā)生和流行，且易引發(fā)耐藥菌株和抗生素殘留等公共衛(wèi)生問(wèn)題。先天免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是保護(hù)宿主免受生物體入侵的第一道防線[1]。其中牛補(bǔ)體系統(tǒng)在乳腺的防御機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，有助于溶解入侵的病原體并調(diào)節(jié)炎癥。乳頭浸泡、干奶療法和疫苗接種可用于控制牛乳腺炎，但仍存在一定困難。研究證實(shí)，家畜對(duì)許多感染性疾病的抗性是由遺傳調(diào)控的[2]。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，采用遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高牛對(duì)病原的抗性，開(kāi)展抗病育種具有治本的功效。因此應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析抗性和易感群體中候選基因的標(biāo)記等位基因頻率差異，結(jié)合遺傳育種技術(shù)，從根本上提高家畜的抗病性與健康水平已成為當(dāng)今家畜抗病育種研究的熱點(diǎn)。

1 甘露糖結(jié)合凝集素與凝集素途徑

補(bǔ)體系統(tǒng)是體液免疫的效應(yīng)機(jī)制，包括30多種可溶性和膜結(jié)合蛋白，是動(dòng)物先天免疫的重要組成部分[3]。補(bǔ)體系統(tǒng)中的許多蛋白質(zhì)是由絲氨酸蛋白酶作為循環(huán)中的酶原，隨著時(shí)間的推移，一旦補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，就會(huì)發(fā)生一系列涉及蛋白水解和組裝的反應(yīng)，導(dǎo)致第三個(gè)補(bǔ)體成分C3裂解，從而誘導(dǎo)補(bǔ)體的活化。目前發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體的激活主要有3 種途徑：①經(jīng)典途徑；②替代途徑；③凝集素途徑。凝集素途徑由甘露糖結(jié)合凝集素（Mannose-binding lectin,MBL）激活，其一般是在與抗原抗體發(fā)生特異反應(yīng)之前，凝集素與細(xì)菌細(xì)胞表面的甘露糖相互作用，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)而發(fā)揮作用[4]。MBL 是一種鈣依賴(lài)性膠原C 型凝集素，參與對(duì)各種微生物病原體的先天免疫反應(yīng)。血漿MBL 與其他膠原凝集素相同，由多個(gè)三聚體組成，每個(gè)三聚體包含4 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)富含半胱氨酸的N 端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)頸部區(qū)域和一個(gè)C 端碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域[5]。它們通過(guò)二硫鍵和膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域的三螺旋締合朝向N 末端結(jié)合在一起。MBL 的識(shí)別結(jié)構(gòu)域通過(guò)與細(xì)胞表面上的甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖殘基結(jié)合，并隨后與3 種稱(chēng)為甘露糖結(jié)合相關(guān)蛋白酶的絲氨酸蛋白酶（MBL associated serine protease，MASP）形成復(fù)合物。MASP2 位于16 號(hào)染色體上，包含11 個(gè)外顯子，是裂解C4 和C2 以組裝C3 轉(zhuǎn)化酶（C4b2a）的關(guān)鍵蛋白酶。MASP2 與經(jīng)典補(bǔ)體途徑轉(zhuǎn)化酶共同作用，進(jìn)而激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)[6]，從而誘導(dǎo)吞噬和炎癥反應(yīng)[7]，發(fā)揮調(diào)理作用和中和作用，實(shí)現(xiàn)抗菌功能。而MASP-1 和MASP-3 似乎參與了凝集素和旁路途徑的激活。

MASP2 基因在先天免疫中發(fā)揮重要作用，并產(chǎn)生對(duì)乳腺感染的抵抗力。MASP2 中的多態(tài)性與奶牛較低的牛奶SCC 和乳腺炎抵抗力具有顯著相關(guān)性。此外，MBL 利用巨噬細(xì)胞上的C1q 受體調(diào)理細(xì)菌，而不涉及補(bǔ)體，調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞釋放的炎癥細(xì)胞因子，并抑制病毒感染性。

大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中都有2 種類(lèi)型的MBL，即MBL-A 和MBL-C，分別由MBL1 和MBL2 基因編碼。MBL1 和MBL2 突變已被證明會(huì)改變動(dòng)物對(duì)各種感染的易感性[5]。豬和牛中的MBL1 可被視為乳腺炎抗性和補(bǔ)體活性的功能和位置候選基因[8]。有研究表明MBL1 基因可能有助于提高針對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力，并且可以作為產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記來(lái)控制乳腺炎[9]。近年來(lái)，一種通過(guò)分子標(biāo)記選擇性育種提高宿主對(duì)乳腺炎遺傳抵抗力的方法已被廣泛接受。對(duì)疾病的抵抗力通常受宿主遺傳特性影響，因此識(shí)別所涉及的靶基因，并通過(guò)遺傳標(biāo)記輔助來(lái)增加所需基因的頻率，可有效控制病原體的感染傳播。

2 MBL 基因多態(tài)性與奶牛乳腺炎的關(guān)系

2.1 單核苷酸多態(tài)性選擇技術(shù)

近年來(lái)，隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)和統(tǒng)計(jì)分析方法的不斷進(jìn)步，動(dòng)物學(xué)家們提出了一種新的育種策略，即動(dòng)物分子育種。傳統(tǒng)的育種技術(shù)主要依靠對(duì)表型性狀的遺傳參數(shù)估計(jì)和育種值評(píng)估，以選擇出優(yōu)秀的種畜。而在奶牛分子育種方面，研究?jī)?nèi)容主要包括以下3 個(gè)方面：一是數(shù)量性狀基因座育種，即通過(guò)定位數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait locus，QTL）中的主效基因進(jìn)行品種改良，或是與其緊密關(guān)聯(lián)的DNA 標(biāo)記來(lái)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）；二是轉(zhuǎn)基因育種，該方法是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源性基因?qū)肽膛；蚪M中，以改良奶牛的重要生產(chǎn)性狀或非常規(guī)性育種性狀；三是單核苷酸多態(tài)性選擇技術(shù)（Single-nucleotide polymorphism，SNP），這是利用與性狀緊密相關(guān)的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行選擇。通過(guò)這些方法，研究人員逐漸從操縱數(shù)量性狀的表型過(guò)渡到操縱數(shù)量性狀的基因型，從依賴(lài)表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)镸AS，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的分子育種。

目前，關(guān)于調(diào)節(jié)乳腺先天免疫基因中SNP 的檢測(cè)，已在乳腺炎的防控中得到廣泛關(guān)注[9-13]。已有多種免疫和炎癥相關(guān)基因及其多態(tài)性研究已被發(fā)現(xiàn)與奶牛乳腺炎的易感性/ 耐藥性密切相關(guān)[14]。研究顯示，在中國(guó)荷斯坦奶牛MBL2 外顯子1 中發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)新的SNP，分別位于牛MBL-C 的膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和Gly-X-Y 重復(fù)結(jié)構(gòu)域的N 末端，可能通過(guò)影響蛋白質(zhì)功能的編碼區(qū)的非同義核苷酸多態(tài)性引發(fā)疾病[15]。該假設(shè)得到以下論證的支持：首先，哺乳動(dòng)物中MBL-C 的基本結(jié)構(gòu)是3 個(gè)相同單體的三聚體。N 末端的一個(gè)富含半胱氨酸的小結(jié)構(gòu)域在3 個(gè)單體之間形成二硫鍵，從而穩(wěn)定三聚體。這些半胱氨酰殘基對(duì)于高階寡聚體的形成和穩(wěn)定中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其次，MBL-C 蛋白缺陷主要是由氨基酸取代引起，即MBL2 外顯子1 中精氨酸被谷氨酰胺取代，導(dǎo)致二硫鍵排列異常，引發(fā)配體結(jié)合活性和補(bǔ)體激活降低[16]。最后，與N 末端結(jié)構(gòu)域相鄰的是一個(gè)大的膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域由大量Gly-X-Y 重復(fù)序列組成，形成卷曲螺旋，為三級(jí)結(jié)構(gòu)提供穩(wěn)定性，同時(shí)與凝集素補(bǔ)體途徑的激活和調(diào)理免疫有關(guān)。膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域的N 末端與調(diào)控細(xì)胞吞噬作用有關(guān)，包括與C1q受體相互作用的保守GEKGEP 基序。同時(shí)，在C末端內(nèi)有幾個(gè)保守的氨基酸殘基，這些殘基形成的MASP 結(jié)合基序[17]和MBL 三聚體的結(jié)合[16]，因此膠原結(jié)構(gòu)域中氨基酸的各種SNP 可能會(huì)導(dǎo)致MBL2 功能異常。

甘露糖結(jié)合凝集素是屬于集合素蛋白家族的關(guān)鍵參與者，它與多種微生物結(jié)合并調(diào)節(jié)先天免疫凝集素補(bǔ)體途徑[18]，有研究表明MBL 有助于清除體內(nèi)凋亡細(xì)胞[6]。牛MBL1 已被映射到BTA28。在這個(gè)區(qū)域，它包含影響體細(xì)胞評(píng)分（Somatic cell score，SCS）的數(shù)量性狀基因座。此外，其他研究也報(bào)道了MBL 中的SNP 與牛奶SCS 的顯著關(guān)聯(lián)[19]。

2.2 突變位點(diǎn)基因型鑒定

在研究MBL1 基因位點(diǎn)片段時(shí)，可以通過(guò)以長(zhǎng)片段PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行短片段的擴(kuò)增即巢式PCR 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。巢式PCR 也稱(chēng)套式PCR，是指利用兩套PCR 引物對(duì)進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。巢式PCR 技術(shù)，克服了單次擴(kuò)增“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR 的敏感性；由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性，從而確保整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。創(chuàng)造酶切位點(diǎn)技術(shù)（CRS-PCR）是根據(jù)引物堿基錯(cuò)配技術(shù)設(shè)計(jì)的檢測(cè)單堿基突變的簡(jiǎn)單易行的方法，其原理是：根據(jù)單堿基突變位點(diǎn)的堿基替代情況設(shè)計(jì)PCR 引物，其中一條引物包含錯(cuò)配堿基，使得引物3'端和單堿基突變的一種突變型在PCR 擴(kuò)增后形成一個(gè)酶切位點(diǎn)，其PCR 產(chǎn)物可用類(lèi)似PCR-RFLP 方法進(jìn)行分析。若無(wú)天然酶切位點(diǎn)，則可利用CRS-PCR 提高SNP 檢測(cè)的效率，降低試驗(yàn)成本，是一種良好的單堿基突變位點(diǎn)基因型鑒定方法。

2.3 MBL1 與牛奶SCS 的相關(guān)性分析

奶牛MBL1 基因SNP 與多種乳成分性狀密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，牛奶中低SCS 的GG 基因型有利于抵抗乳腺炎的發(fā)生，而高SCS 的AA 基因型則導(dǎo)致乳腺炎易感。增加MBL1 p.24Val 的頻率可反映奶牛乳腺炎的抵抗能力，因此研究MBL1 多態(tài)性似乎是改善奶牛乳腺炎抵抗性狀的重要的間接標(biāo)記[20]。

有研究發(fā)現(xiàn)，MBL1 基因中的SNP g.2651G＞A 與乳汁SCS 有強(qiáng)相關(guān)性，表明其可能在乳腺炎抵抗中發(fā)揮作用[21]。g.2651G＞A 位點(diǎn)的AA 基因型個(gè)體與SCS 有顯著相關(guān)性，說(shuō)明g.2651G＞A 位點(diǎn)當(dāng)DNA 兩條鏈上的G 都突變?yōu)锳的時(shí)候，血清MBL-A 水平過(guò)低可造成機(jī)體調(diào)理功能缺陷而易患多種感染性疾病，也可能是MBL1 突變體介導(dǎo)體內(nèi)某些細(xì)胞攝取某些胞內(nèi)微生物如金黃色葡萄球菌，從而使機(jī)體易患此類(lèi)感染，奶牛的乳腺炎抗性顯著減弱。因而在乳腺炎抗性牛群選育計(jì)劃中應(yīng)有意識(shí)地增加g.2651G＞A位點(diǎn)的G 等位基因頻率[22]。在分析的中國(guó)荷斯坦牛群體中，3 個(gè)SNP 與產(chǎn)奶性狀（脂肪含量、蛋白質(zhì)含量和305d 產(chǎn)奶量）之間未觀察到顯著相關(guān)性。然而，有趣的是，三個(gè)SNP 的組合基因型與產(chǎn)奶性狀之間發(fā)現(xiàn)了顯著差異，表明一種SNP的基因型效應(yīng)可能受到其他SNP 的影響并且這種效應(yīng)是多個(gè)SNP 相互作用的反映[21]。Liu 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，MBL1 基因與中國(guó)荷斯坦、魯西黃、渤海黑的牛奶SCS 呈正相關(guān)，可能在宿主對(duì)乳腺炎的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且g.2651G＞A 和g.-1330G＞A 可用于奶牛乳腺炎抗性育種。除此之外，Liu 等[23]認(rèn)為與SNP 相比，單倍型組合的分析可能對(duì)性狀產(chǎn)生更大的影響，標(biāo)記輔助選擇比單個(gè)SNP 的研究更有價(jià)值。在荷斯坦奶牛中的單倍型組合中，應(yīng)選擇H8H22、H5H1、H16H22、H15H1 和H5H1 作為單倍型組合的標(biāo)記，以分別獲得更高的產(chǎn)奶量、脂肪率、蛋白質(zhì)率以及乳腺炎抗性和CH50 值。此外，g.2651G＞A SNP 與血清MBL-A 水平呈顯著正相關(guān)，表明高M(jìn)BL 血清水平和低MBL 血清水平之間的比率取決于MBL編碼變體[24]。因此，血清溶血活性可以被認(rèn)為是抗病性的遺傳標(biāo)記和可以選擇用于近交計(jì)劃的性狀。此外，-1330 G＞A 和g.2651 G＞A 同樣與CH50 呈顯著正相關(guān)，證實(shí)MBL1 可被視為補(bǔ)充CH50 活性的功能和位置候選基因?？咕鷮?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，與來(lái)自易感奶牛的血清相比，抗病奶牛血清對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抗菌活性顯著升高[24]，該發(fā)現(xiàn)為H15H1 基因型對(duì)主要牛乳腺炎病原體感染的保護(hù)作用以及H16H8 基因型對(duì)此類(lèi)感染的誘發(fā)作用提供了生物學(xué)意義。

有研究表明，荷斯坦牛、三河牛和西門(mén)塔爾牛MBL 外顯子存在3 種不同的基因型，即AA（(217 bp）型、AG（217、194 和23bp）型和GG（194 和23bp）型[24]。c.2534G ＞A SNP 可能對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生負(fù)面影響，因?yàn)榫幋a區(qū)的突變可能會(huì)在很大程度上改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，或通過(guò)破壞殘基間相互作用來(lái)破壞活性位點(diǎn)部分的穩(wěn)定性。基因型與臨床型乳腺炎發(fā)病率的關(guān)聯(lián)顯示，AA 基因型更易患乳腺炎，其次是AG，而GG 基因型則不易患臨床型乳腺炎。

細(xì)菌感染是引起奶牛乳腺炎的最主要因素，因此對(duì)奶牛MBL2 基于SNP 分析可能有助于發(fā)現(xiàn)它們與乳腺炎抵抗力的關(guān)聯(lián)。Zhao 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，g.1164 G＞A-GG 和g.1197 C＞A-CC 基因型奶牛的SCS 顯著降低，表明這些基因型可能與群體乳腺炎抵抗力有關(guān)。因此，可選擇GG、CC 基因型牛進(jìn)行選育。突變位點(diǎn)（g.1198 G＞A 和g.1207 T＞C）的任何標(biāo)記基因型與產(chǎn)奶性狀或SCS 之間均未觀察到顯著相關(guān)性。4 個(gè)SNP（g.1164 G＞A、g.1197 C＞A、g.1198 G＞A 和g.1207 T＞C）的組合基因型與產(chǎn)奶性狀（蛋白質(zhì)率）密切相關(guān)。

Wang 等[8]研究表明，中國(guó)荷斯坦奶牛MBL2基因在誘導(dǎo)抗原特異性免疫之前激活免疫反應(yīng)，低表達(dá)MBL2 可使奶牛乳腺易感金黃色葡萄球菌。MBL2 基因外顯子1 存在多態(tài)性，單倍型組合H4H5 可用作乳腺炎抗病性單倍型組合的分子標(biāo)記。Wang 等[8]認(rèn)為MBL-A 和MBL-C 在牛體內(nèi)具有不同的糖結(jié)合特異性。動(dòng)物血清中總補(bǔ)體溶血活性的高低與機(jī)體的抗感染免疫能力相關(guān)，通過(guò)牛奶中的溶血活性來(lái)評(píng)估乳腺的局部免疫力比血清的溶血能力更合適。然而，牛奶的溶血活性較弱，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)其溶血活性接近檢測(cè)下限，因?yàn)榕Ｄ讨写嬖诘脑S多抑制劑掩蓋了其低溶血活性，因此使用血清的溶血活性作為代表值。人類(lèi)MBL2 基因外顯子1 在膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變被發(fā)現(xiàn)與MBL-C 血漿濃度相關(guān)，但奶牛突變位點(diǎn)的任何標(biāo)記基因型與溶血補(bǔ)體活性CH50 和ACH50 之間均未觀察到顯著相關(guān)性。

3 展望

識(shí)別遺傳抗性動(dòng)物的適當(dāng)方法是研究宿主遺傳學(xué)與乳腺炎易感性和抗性的關(guān)聯(lián)，因此，遺傳標(biāo)記選擇被確定為篩選遺傳性乳腺炎抗性牛的最佳方法。免疫和炎癥相關(guān)基因中突出的多態(tài)性可以被視為牛乳腺炎控制研究中的潛在生物標(biāo)志物?，F(xiàn)階段對(duì)牛主要抗病候選基因的研究取得了一定的進(jìn)展，但仍然存在具體遺傳機(jī)制不明確，各種疾病的分子標(biāo)記知之甚少的問(wèn)題[25]。在育種時(shí)，通過(guò)傳統(tǒng)的表型選擇和分子標(biāo)記輔助選擇聯(lián)合使用，兩者互補(bǔ)，使其在抗病育種上產(chǎn)生最大的效益同時(shí)提高動(dòng)物的抗病能力。

甘露糖結(jié)合凝集素是一類(lèi)可溶性調(diào)理素，能夠識(shí)別多種病原體，并在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外，MBL 通過(guò)其選擇經(jīng)典轉(zhuǎn)化酶的能力，也能夠激活補(bǔ)體。因此，結(jié)合遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的方法，進(jìn)一步明確MBL 的SNP 對(duì)奶牛乳腺炎的抗病作用，在提高奶牛育種及生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益等方面都具有重要意義。由于奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且致病因素多樣化，針對(duì)MBL 與乳腺炎發(fā)病關(guān)系的研究，目前采用補(bǔ)充外源性MBL 維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，已成為一種新的研究策略。