胡小慧，鄧瑞雪，潘玉平，賈懷杰，安芳蘭，劉學榮

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）在臨床上引起牛結(jié)節(jié)性皮膚?。↙umpy skin disease，LSD），該病主要侵害?？苿游?，以消瘦、皮膚水腫、淋巴結(jié)腫大、皮膚形成結(jié)節(jié)或潰瘍、發(fā)熱等癥狀為主[1]。LSD 潛伏期為28d，發(fā)病率2%～45%，感染牛死亡率可達20%[2]。健康牛群皮膚黏膜若有破損，在直接接觸病牛破潰的皮膚后感染，LSD 也可通過媒介如被污染的飼養(yǎng)場所、節(jié)肢動物、鳥類，甚至飼養(yǎng)人員等進行機械傳播[3]。目前研究顯示LSDV 不感染人，但除?？苿游锿猓芯咳藛T在長頸鹿、大羚羊等野生反芻動物體內(nèi)也檢出了LSDV 抗體，但并未進一步確診它們是否感染[4]。發(fā)病動物出現(xiàn)的皮膚破損、母畜流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降等情況會給養(yǎng)殖戶帶來重大損失，已有研究表明，感染LSD 后造成的經(jīng)濟損失奶牛約為886.34 美元/頭，而肉牛則更多，為1066.61 美元/ 頭[5]。近年來，除LSD 的原始暴發(fā)地非洲大陸之外，LSD 在歐洲和亞洲也呈流行趨勢，發(fā)病具有明顯的季節(jié)性。2019 年8 月，第一例LSD 在我國新疆伊犁哈薩克自治州確診，此后疫情迅速蔓延至國內(nèi)其他多個省份。LSD 是世界動物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health，OIE）法定報告的動物疫病之一，也是我國 《一、二、三類動物疫病病種名錄》 中的二類傳染病，目前國內(nèi)尚無特效藥物進行治療，因此快速準確的診斷方法和疫苗免疫是防控LSD 的關(guān)鍵，本文對現(xiàn)有LSD 應用較為廣泛的診斷方法及防控措施的研究進展進行闡述，為LSD 疫情的防控提供理論參考。

1 臨床綜合診斷

2019 年8 月我國首例LSD 病例在新疆確診后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部工作組在當?shù)亻_展流行病學調(diào)查、臨床診斷和病理解剖等工作。通過現(xiàn)場和問卷調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2019 年6 月至8 月，中哈邊境牧民發(fā)現(xiàn)部分牛體型消瘦、皮膚出現(xiàn)疙瘩等類似LSD的癥狀。現(xiàn)場檢查疑似病例，除LSD 特征癥狀外，病牛出現(xiàn)口鼻潰瘍、食欲減退、不善活動等現(xiàn)象。剖檢發(fā)現(xiàn)病牛內(nèi)臟（心肝脾肺腎小腸等）及淋巴結(jié)普遍腫大、出血及膠凍樣浸潤[6]。臨床綜合診斷可初步確診為LSD 疑似病例，王圖雅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過熒光PCR 和競爭ELISA 方法檢測1 例表現(xiàn)臨床癥狀的牛，但2 種方法檢測結(jié)果均為陰性，因此不能將臨床癥狀作為撲殺的唯一依據(jù)，應同時綜合考慮其他檢測結(jié)果。

2 實驗室診斷

2.1 病毒分離鑒定

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒分離鑒定可以采用細胞株或雞胚進行，OIE 推薦使用羔羊睪丸細胞（lamb testis，LT）或羔羊腎細胞（lamb kidney，LK）進行病毒分離。除此之外，目前報道的能夠增殖LSDV 的細胞主要有牛腎細胞（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）、非洲綠猴腎細胞（African green monkey kidney，Vero）、原代綿羊睪丸細胞（Primary sheep testis cells，Primary ST）、綿羊睪丸細胞（Ovine testis cells，OA3.Ts）、綿羊胚胎皮膚細胞（Embryonic Skin of Sheep，Esh-l）等[8]。張敏敏等[9]采集了新疆伊犁地區(qū)發(fā)病牛的病變皮膚組織，通過組織研磨、PBS 洗滌、離心沉淀等操作后，取上清液接種LT細胞，對典型病變細胞培養(yǎng)物進行鑒定，透射電鏡觀察到大于200nm 的磚型粒子，與Moss 等[10]鑒定的LSDV 粒子大小（約290nm×240nm）基本一致。電鏡觀察病毒粒子大小只能初步判斷為羊痘病毒屬病毒，若想要確診還需結(jié)合臨床癥狀和其他檢測方法進行。使用雞胚接種病毒時，可采集絨毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane，CAM）上的痘樣病變組織進行PCR 檢測[11]。

通過動物接種試驗也可確定臨床疫病是否由LSDV 引起，但所需時間較長，一般為4～7d，將病牛的新鮮結(jié)節(jié)制成乳劑[12,13]，皮下或皮內(nèi)接種易感牛，待接種部位出現(xiàn)堅硬的疼痛性腫脹后，采集腫塊和下層肌肉組織、脾臟、血液或唾液等進行病毒分離或核酸檢測試驗，若結(jié)果為陽性即可確診。

生物安全是進行LSDV 病原分離試驗和動物接種試驗的前提，病毒分離必須在生物安全三級實驗室（Animal Biosafety Level -3，ABSL-3）中進行，因此限制了該方法在臨床中的應用推廣。目前確診大多采用免疫學或分子生物學診斷方法對抗體或病毒核酸進行檢測。

2.2 免疫學檢測

常規(guī)血清學方法主要用于檢測患病動物體內(nèi)的特異性抗體和感染性抗原，因此可用于檢測LSD 流行地區(qū)的樣品。

2.2.1 病毒中和試驗

病毒中和試驗（Virus neutralization test，VNT）是OIE 推薦的LSDV 檢測方法之一。Samojlovic[14]開發(fā)的VNT 方法包含疫苗免疫后的血清抗體和MDBK 細胞培養(yǎng)的LSDV 毒株兩部分，使用該方法和ELISA 方法同時檢測200 份臨床采集的奶牛血清和125 份已知的LSDV 陰性牛血清，結(jié)果顯示：臨床血清中VNT 法抗體陽性率為34%（68/200），ELISA 法抗體陽性率為30%（60/200）；已知血清中VNT 法抗體陽性率為0%（0/125），ELISA 法抗體陽性率為0.8%（1/125），說明該方法可用于臨床血清樣品LSDV抗體檢測。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

Carn 等[15]建立的捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法，包被綿羊痘KS-1 株P(guān)32 重組抗原與LSDV 抗體反應后能夠檢測到患病動物活組織中以及組織培養(yǎng)上清液中的山羊痘病毒（Capripoxvirus，CaPV），活組織抗原最早測得時間為感染后7d。Bowden 等[16]以羊痘病毒屬的核心蛋白ORF095 和ORF103 為重組抗原構(gòu)建的間接ELISA 方法能夠檢測到CaPV 感染后的血清抗體，人工感染條件下該方法敏感性和特異性分別為95%、97%，但疫苗免疫后敏感性僅為30%。Babiuk 等[17]共檢測231 份山羊、綿羊和牛血清中的CaPV 抗體，發(fā)現(xiàn)間接ELISA 方法特異性和敏感性分別為95%和96%。Heine 等[18]基于痘苗病毒H3L 基因的同源基因P32 構(gòu)建的間接ELISA 方法雖然有較高的特異性，但全長P32 基因的表達量較低，限制了該方法的使用。

2.2.3 免疫過氧化物酶單層分析法

Haegeman 等[19]建立的免疫過氧化物酶單層分析法（Immunoperoxidase monolayer analysis，IPMA）可用于檢測牛血清中的LSDV 抗體。對LSDV 實驗感染和自然感染的144 份牛血清樣品進行檢測，均檢出陽性抗體，檢測結(jié)果與病毒中和試驗和商品化ELISA 試劑盒相一致，并且與BTV 和FMDV 感染的樣品不發(fā)生交叉反應，可與稀釋度1∶50 的牛血清發(fā)生反應，特異性和敏感性良好。

通過比較檢測LSDV 的各種免疫學方法，主要不足之處如下：①VNT 法需要保證生物安全，對低抗體水平的動物檢出率低，且該方法需要進行細胞培養(yǎng)，對操作人員和細胞要求較高。②各種ELISA 法雖然能夠同時檢出GTPV、SPPV 和LSDV 三種抗體，但無法進行具體細化鑒別。③蛋白質(zhì)免疫印跡法操作復雜，不適用于田間推廣應用。④間接免疫熒光抗體試驗由于操作中對背景和細胞質(zhì)的非特異性染色，會使判定結(jié)果受到主觀性的影響。⑤瓊脂凝膠免疫擴散試驗敏感度較低，與副痘病毒存在交叉反應。

2.3 分子生物學檢測

基于抗原抗體反應的免疫學診斷方法在調(diào)查群體感染情況時有一定的優(yōu)勢，但不能快速準確地確定個體是否感染。細胞免疫是機體應對痘病毒屬病毒感染的主要形式，在感染或疫苗接種初期等抗體水平較低時抗體檢測方法還有一定的局限性，鑒于傳統(tǒng)的血清學試驗敏感性較低、操作繁瑣、耗費巨大、不能鑒別診斷CaPV 等各種限制，研究人員開發(fā)了具有更高特異性和敏感性的核酸檢測技術(shù)。常用的基于分子生物學診斷的核酸檢測技術(shù)主要有以下3 種。

2.3.1 聚合酶鏈式反應技術(shù)

聚合酶鏈式反應技術(shù)（PCR）是OIE 推薦的檢測LSDV 的方法之一，一般發(fā)病后7～19d 可檢測到LSDV 核酸片段，最長161d[20]。張敏敏等[9]對病變細胞液中提取的DNA 進行擴增，發(fā)現(xiàn)PCR 擴增所得的毒株LSDV/China/Xinjiang/2019與NCBI 中LSDV 相應片段的相似度為99.98%。羊痘病毒屬病毒基因同源性高，可基于高保守核酸序列設計引物，建立CaPV 的通用檢測方法。如Ireland 等[21]、Kitching 等[22]建立的通用型方法特異型好，與羊口瘡和牛痘病毒均無交叉反應。

2.3.2 實時熒光定量PCR

除可以檢測CaPV 的不同病毒外，實時熒光定量PCR（qPCR）的優(yōu)勢主要在于更早更快地檢出拷貝數(shù)更低的核酸，并且可以鑒別診斷LSDV 野毒株和疫苗株，這對疫情防控有幫助。qPCR 包含染料法和探針法。原耀賢等[23]建立了基于染料法的qPCR，在檢測重組質(zhì)粒pMD19T-LSDV 時其敏感性比普通PCR 高100 倍，最低檢測濃度為7.11x102copies/μL。與染料法相比探針法需要合成探針，較為昂貴，但特異性高于前者?？子穹降萚24]選取LSDV 的保守基因ORF71，設計的探針法qPCR 檢出限為1.16 copies/μL，而聶福平等[25]、Eirini 等[26]、Das 等[27]基于不同的序列設計的探針法最低檢出限分別為1.48、8 和10copies/μL。

2.3.3 其他方法

環(huán)介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）可以在60～65℃下擴增病毒核酸，關(guān)于它在臨床上的使用有兩種看法。一種認為LAMP 的試驗結(jié)果由是否觀察到染料顏色變化來確定，具有一定的主觀性[28]，另一種認為正是目測的便捷性使得該方法可以在基層推廣使用[29]。重組酶聚合酶擴增法（RPA）可在45℃時對樣品進行等溫快速擴增，已用于臨床檢測SPPV 和GTPV[30]。高分辨率熔解曲線分析法依據(jù)4 種熔解曲線峰來鑒別診斷LSDV、GTPV以及SPPV 的野毒株和疫苗株[31]。

3 防控難點與建議

3.1 防控現(xiàn)狀

依據(jù)相關(guān)規(guī)定，我國對LSD 疫情實行快報制度，相關(guān)單位接到疑似癥狀報告后，按照“可疑疫情—疑似疫情—確診疫情”的程序，最終由省級人民政府畜牧獸醫(yī)主管部門或農(nóng)業(yè)農(nóng)村部按照確診結(jié)果和流行病學調(diào)查信息認定疫情。防控傳染性疾病的三大有效措施為控制傳染源、切斷傳播途徑和保護易感動物。目前發(fā)生LSD 疫情后采取的主要措施如下：首先，對疫點內(nèi)所有病牛、病原學陽性牛及其產(chǎn)品進行撲殺銷毀并無害化處理，在疫區(qū)和受威脅區(qū)禁止牛只出入，并禁止未經(jīng)檢疫合格的牛皮張、精液等產(chǎn)品調(diào)出。其次，滅殺飼養(yǎng)場所內(nèi)的蟲媒等生物，清除滋生環(huán)境，對牛只排泄物、被病原污染的飼料和墊料、污水等物品進行無害化處理，對養(yǎng)殖場所、出入人員、車輛等設施設備進行消毒。最后可以使用山羊痘疫苗對疫情所在縣和相鄰縣的全部牛只進行緊急免疫接種。由于LSD 主要發(fā)生于吸血蟲媒活躍季節(jié)，給疫病的防控和凈化增加了難度，鑒于LSD 疫情已經(jīng)在我國多個省份發(fā)生，在繼續(xù)維持邊境防控和出入境檢疫的基礎上，需同時加強國內(nèi)動物跨省調(diào)運監(jiān)管。

3.2 病原方面

由于LSD 潛伏期長，疫情初期除有明顯臨床癥狀的牛之外，同群動物感染后不易被發(fā)現(xiàn)，如若漏診，則存在疫情擴散的風險。LSD可以通過蟲媒和非蟲媒等多種途徑傳播，使得切斷傳播途徑這一措施難以達到預期效果。因此，為提高LSD 防控技術(shù)水平，除常規(guī)的驅(qū)蚊滅蠅措施外，建議完善現(xiàn)有的疫病確診技術(shù)，開發(fā)可以早期監(jiān)測牛群群體水平LSDV 的工具，加快推進疫苗和養(yǎng)殖場滅蜱蟲藥物的研發(fā)[32]，以此來提高LSD 防控效率。雖然弱毒活疫苗的免疫保護效果比滅活疫苗好，但目前對于LSDV 的致病機制和疫苗免疫機制尚不清楚，進而導致了疫苗株和野毒株重組病毒的出現(xiàn)，這使得活疫苗免疫在臨床應用時存在隱患。袁歆瑋[33]等提出，應加強LSDV 致病機制和免疫機制研究，這對于研發(fā)新的抗病毒疫苗和藥物以及鑒別診斷試劑的靶標等工作都有重要意義。

3.3 人員方面

牛結(jié)節(jié)性皮膚病的易感動物牛類既存在于規(guī)?；B(yǎng)殖場，也存在于農(nóng)村散養(yǎng)。規(guī)?；B(yǎng)殖場具有較為完善的養(yǎng)殖模式和生物安全體系，而農(nóng)村散養(yǎng)存在防疫意識薄弱、專業(yè)技術(shù)人員欠缺、交易頻繁多樣以及病牛撲殺補償較低等諸多問題。鑒于以上情況，一是要提高養(yǎng)殖戶和基層防疫人員對LSD 疫情的認知，有關(guān)部門要加大宣傳力度，組織知識科普和法律法規(guī)培訓，提升從業(yè)人員的群防群控意識和法律意識，嚴厲打擊販賣病死牛等行為[34]，對病牛要嚴格實行無害化處理措施。二是要加強對各動物疫病預防控制機構(gòu)和動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)工作人員的技術(shù)培訓，使其能夠快速準確處置臨床病例，提升工作效率。三是要加強活牛的調(diào)運管理，經(jīng)過嚴格的風險評估后進行引種或購入新牛，定期排查疫情隱患，做好疫情監(jiān)測工作。四是明確病牛無害化處理補償標準，為在疫情最早期撲殺動物的養(yǎng)殖戶適當提高補償金額，強化疫情報告制度，讓養(yǎng)殖戶在發(fā)現(xiàn)疫病后按真實情況及時上報，在一定程度上降低防控難度[35]。

4 小結(jié)

疫情發(fā)展初期，牛對LSDV 敏感，可采用特征性臨床癥狀進行初步診斷，同時結(jié)合各種PCR技術(shù)檢測核酸進行確診。疫情發(fā)展中期，可采用多種免疫學方法檢測LSDV 抗體進行診斷。疫情發(fā)展后期，可能存在隱性感染或感染免疫情況，病牛體表皮膚癥狀不明顯，且由于抗體存在，機體病原含量下降，此時PCR 技術(shù)有可能無法擴增出LSDV 核酸片段，為避免漏診造成疫情擴散等情況，應聯(lián)合使用血清學方法和分子生物學方法，并開發(fā)新的診斷技術(shù)。對于LSD，應遵循預防為主，防治結(jié)合原則，在準確診斷、防止疫區(qū)動物轉(zhuǎn)移的同時，應積極開發(fā)殺蜱藥物，切斷傳播途徑，同時加強易感動物疫苗接種，積極預防，保障人和動物健康。