馮安妮 孫任任 肖玉波 曾昭明 莫中成1， 謝遠(yuǎn)杰1，**

（1）桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，桂林 541199；2）湖南醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，懷化 418000；3）桂林醫(yī)學(xué)院-明舜制藥慢性病防治研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，邵東 422800）

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP），又名鄰苯二甲酸雙（2-乙基己基）酯，屬于鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物，其分子式為C24H38O4，是一種無(wú)色有輕微氣味的油狀液體，具有較強(qiáng)的疏水性和脂溶性。DEHP常作為聚氯乙烯等塑料制品的增塑劑，廣泛存在于各類(lèi)生活物品中，如兒童玩具、電子醫(yī)療設(shè)備、化妝品和食品包裝材料等，同時(shí)還被添加到瓷磚、墻紙、電纜保護(hù)劑等建筑裝修材料中，是常見(jiàn)的環(huán)境污染物之一［1］。DEHP與塑料基質(zhì)之間以不牢固的氫鍵和范德華力連接，在日常生活中，塑料制品常被反復(fù)使用、加熱和/或清洗，使得DEHP極易從產(chǎn)品滲出，從而暴露于環(huán)境中。除了生活接觸塑料制品外，自然環(huán)境中還存在著許多塑料垃圾，長(zhǎng)期污染著河流、海洋、土壤等，導(dǎo)致DEHP無(wú)處不在。

DEHP可通過(guò)呼吸道、消化道、皮膚接觸等多種方式被人體吸收，進(jìn)入機(jī)體后水解為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP），并在人體長(zhǎng)期積蓄，導(dǎo)致多系統(tǒng)性毒性效應(yīng)［2］。DEHP可作為內(nèi)分泌干擾物直接影響生殖系統(tǒng)，還可穿透胎盤(pán)屏障或進(jìn)入母乳，對(duì)子代生殖系統(tǒng)造成損傷，有毒理學(xué)研究表明，宮內(nèi)暴露DEHP可能導(dǎo)致男性后代生殖障礙，引起生殖系統(tǒng)畸形［3］。鑒于DEHP 對(duì)生殖功能和生殖發(fā)育的毒性，歐洲化學(xué)品管理局已將其歸類(lèi)為生殖毒性物質(zhì)。隨著塑料制品的廣泛使用，環(huán)境塑料垃圾的不斷增加，越來(lái)越多研究者開(kāi)始聚焦于DEHP對(duì)男性生殖毒性的研究，發(fā)現(xiàn)睪丸是DEHP產(chǎn)生生殖毒性作用的重要靶器官。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較多，但有關(guān)DEHP的睪丸毒性作用的分子機(jī)制仍未闡述清楚，本文從睪丸病理?yè)p傷、生殖細(xì)胞毒性以及表觀(guān)遺傳效應(yīng)三個(gè)方面，綜述目前DEHP對(duì)睪丸生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及支持細(xì)胞的損害及其分子機(jī)制的相關(guān)進(jìn)展，擬為男性生殖障礙的防治研究提供新思路。

1 DEHP對(duì)睪丸的病理?yè)p傷

DEHP暴露所引起的睪丸病理?yè)p傷，常表現(xiàn)為睪丸組織中凋亡標(biāo)志物和自噬蛋白增加、精子質(zhì)量下降以及睪丸結(jié)構(gòu)異常［4］，且受不同時(shí)期、不同濃度DEHP 暴露的影響。Yang 等［5］研究表明，在性成熟關(guān)鍵時(shí)期將雄性SD 大鼠連續(xù)暴露于不同劑量的DEHP，可引起睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂，且隨著DEHP暴露時(shí)間和劑量的增加而更加明顯。

妊娠期子宮內(nèi)暴露于DEHP可顯著增加子代雄性小鼠生精小管形態(tài)異常，延長(zhǎng)生精小管間距，并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)異常。Pan等［6］研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)暴露DEHP可以激活子代小鼠的未折疊蛋白反應(yīng)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，下調(diào)N鈣黏蛋白在睪丸中的表達(dá)，從而導(dǎo)致生精小管萎縮和生殖細(xì)胞脫落。青春期大鼠暴露于DEHP 可導(dǎo)致未成熟睪丸損傷，Han 等［7］通過(guò)體視學(xué)分析顯示，大部分睪丸體積縮小，特別是生精小管和生精上皮體積顯著減小，生精細(xì)胞大量減少，結(jié)構(gòu)損傷明顯，病理?yè)p傷表現(xiàn)為生殖細(xì)胞破裂、細(xì)胞質(zhì)空泡化、塌陷、多核巨細(xì)胞形成、染色質(zhì)溶解，細(xì)胞核固縮等。成年大鼠暴露于DEHP，對(duì)睪丸重量、生精小管管腔平均橫截面積、生精細(xì)胞數(shù)、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)、輸精管直徑、輸精管上皮細(xì)胞高度等均有顯著影響［8］。

DEHP對(duì)睪丸的病理?yè)p傷還表現(xiàn)在與不同增塑劑的聯(lián)合效應(yīng)，當(dāng)DEHP與雙酚A同時(shí)暴露，會(huì)引起雄性大鼠睪丸結(jié)構(gòu)病理?yè)p傷加重［9］。當(dāng)然DEHP還可以通過(guò)氧化應(yīng)激、增加氧自由基的形成等，導(dǎo)致雄性小鼠睪丸的嚴(yán)重組織病理?yè)p傷［10］。由此可見(jiàn)，DEHP誘導(dǎo)的睪丸病理?yè)p傷作用明顯，探究其毒性及作用機(jī)制已成為男性生殖障礙防治的關(guān)鍵。

2 DEHP對(duì)生精細(xì)胞的毒性與作用機(jī)制

根據(jù)毒理學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DEHP具有類(lèi)似雌激素作用［11］，在動(dòng)物體內(nèi)可充當(dāng)雌激素參與內(nèi)分泌代謝，導(dǎo)致生精障礙。精子發(fā)生是精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)增殖分化，最后形成精子的過(guò)程，包括精原細(xì)胞的更新分化、精母細(xì)胞的成熟分裂和精子形成三個(gè)階段。生精細(xì)胞包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。由DEHP暴露引起的生精細(xì)胞毒性作用，會(huì)伴隨暴露劑量的增加，毒性效應(yīng)也越強(qiáng)，常表現(xiàn)為生精細(xì)胞數(shù)量減少、精子活力和前向運(yùn)動(dòng)能力的降低以及精子DNA損傷等［12］。

2.1 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞自噬，促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡

氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)生精細(xì)胞損傷的核心機(jī)制，生精細(xì)胞與其他體細(xì)胞相比，由于特殊的結(jié)構(gòu)和組成成分更易受到氧化應(yīng)激的影響。在氧化應(yīng)激條件下，過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）會(huì)破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞損傷［13］。Bahrami 等［14］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DEHP 降低了精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞的數(shù)量以及精子活力和前向運(yùn)動(dòng)能力，并通過(guò)促進(jìn)雄性小鼠睪丸的氧化/亞硝化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致睪丸損傷。細(xì)胞凋亡也是誘導(dǎo)生精細(xì)胞損傷的重要機(jī)制，精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞增殖分化過(guò)程，有賴(lài)于細(xì)胞增殖、凋亡的平衡，而大量生精細(xì)胞凋亡阻止了精子的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)DEHP暴露導(dǎo)致小鼠睪丸增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)下降，并呈劑量依賴(lài)性抑制小鼠精原細(xì)胞系和小鼠精母細(xì)胞系的增殖［15］，這可能與以Bax/Bcl-2 和p53 上調(diào)為特征的細(xì)胞凋亡有關(guān)（圖1a）。

Gan 等［16］證實(shí)，DEHP 能顯著抑制小鼠精原細(xì)胞系存活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬蛋白LC3-ⅠⅠ、Beclin1 和ATG5 的水平及LC3-ⅠⅠ/Ⅰ的比值增加，經(jīng)抗氧化劑和自噬抑制劑處理后，可以提高細(xì)胞存活率，挽救DEHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這表明DEHP可以通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞的凋亡和自噬，而且自噬可能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。自噬在男性生殖過(guò)程中起重要作用，是維持生精細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、保障精子發(fā)生的關(guān)鍵，其主要功能是蛋白質(zhì)、細(xì)胞器的降解和再循環(huán)。Fu等［17］發(fā)現(xiàn)，低濃度DEHP 可通過(guò)抑制PⅠ3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路，激活自噬，保護(hù)青春期大鼠睪丸免受DEHP 的損傷，而高濃度DEHP 導(dǎo)致氧化應(yīng)激過(guò)度，誘導(dǎo)STAT3/p53調(diào)控線(xiàn)粒體凋亡，抑制自噬，從而導(dǎo)致睪丸損傷和生殖功能障礙。Hong 等［18］發(fā)現(xiàn)，DEHP不僅增強(qiáng)氧化應(yīng)激，還通過(guò)下調(diào)自噬，誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體的激活，在體內(nèi)和體外觸發(fā)細(xì)胞焦亡（圖1b）?？梢?jiàn)自噬是把雙刃劍，適度自噬促進(jìn)細(xì)胞生存，過(guò)度自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

此外，氧化應(yīng)激可以激活自噬，自噬可以清除氧化應(yīng)激造成的損傷，延緩細(xì)胞死亡，但是氧化應(yīng)激引起的過(guò)度自噬會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡。因此，在未來(lái)關(guān)于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引起男性生殖障礙的研究中，可以重點(diǎn)關(guān)注氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡和自噬，研究?jī)烧咧g的調(diào)控機(jī)制，以尋找可能的預(yù)防和治療方法。

2.2 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工的主要細(xì)胞器，環(huán)境毒物可以破壞細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的動(dòng)態(tài)平衡，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致生殖毒性。Zhu 等［19］研究報(bào)道，將青春期小鼠暴露于DEHP，出現(xiàn)睪丸重量下降，精子數(shù)量減少，生精管內(nèi)大量生精細(xì)胞凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78 表達(dá)下調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物p-ⅠRE1α、p-JNK和CHOP在睪丸組織中表達(dá)上調(diào)，這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與DEHP 誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡（圖1c）。

2.3 阻滯生精細(xì)胞的細(xì)胞周期

DEHP可導(dǎo)致生精細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期紊亂，研究發(fā)現(xiàn)，DEHP暴露可導(dǎo)致生精細(xì)胞的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1，Chk1）、細(xì)胞分裂周期基因2（cell division cycle gene 2，Cdc2）、周期蛋白依賴(lài)性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）表達(dá)水平下調(diào)［20］。Chk1 是調(diào)控細(xì)胞周期的重要激酶，抑制Chk1 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡，而抑制Cdc2、CDK2 也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯（圖1d）。

2.4 損傷精子活性

精子活力降低及DNA 損傷，也是影響雄性生殖的重要原因之一（圖1e）。Liu等［15］對(duì)雄性小鼠進(jìn)行DEHP灌胃35 d，發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量、運(yùn)動(dòng)參數(shù)下降，頂體反應(yīng)率、精子-卵子結(jié)合能力和囊胚形成減少，精子生育力下降，將DEHP與精子體外共孵育，發(fā)現(xiàn)獲能精子的酪氨酸磷酸化和前向運(yùn)動(dòng)能力降低，p-AKT表達(dá)降低。體外暴露DEHP，其代謝物MEHP 會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)精子細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高和酪氨酸磷酸化增加來(lái)影響精子功能［21］。Zhang 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 灌胃60 d 可引起雄性小鼠精子DNA損傷，精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，精子DNA斷裂指數(shù)顯著增加。

Fig. 1 Mechanism of spermatogenic cytotoxicity induced by DEHP/MEHP圖1 DEHP/MEHP誘導(dǎo)生精細(xì)胞毒性的相關(guān)機(jī)制

3 DEHP對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性與作用機(jī)制

男性體內(nèi)95%的雄激素來(lái)自睪丸間質(zhì)細(xì)胞（leydig cell）。雄激素可以促進(jìn)精子的發(fā)生和生殖器官的發(fā)育，并維持第二性征和雄性生殖功能。睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上有黃體生成素受體，與黃體生成素結(jié)合后可以促進(jìn)睪酮的合成和分泌。此外，睪丸間質(zhì)細(xì)胞還可分泌雌激素、非甾體類(lèi)激素和生長(zhǎng)因子，對(duì)精子發(fā)生起調(diào)節(jié)作用。DEHP可通過(guò)干擾睪丸間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇激素合成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡等產(chǎn)生生殖毒性。

3.1 干擾類(lèi)固醇激素合成阻礙精子發(fā)生

睪酮是男性生殖系統(tǒng)中最為重要的類(lèi)固醇激素，DEHP主要以干擾睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮的方式來(lái)阻礙精子發(fā)生。雄性大鼠出生后長(zhǎng)期暴露于DEHP可引起睪酮顯著降低［23］。Zhao等［24］通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，DEHP可導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮生物合成減少，干擾精子發(fā)生過(guò)程中的睪酮與雄激素受體通路，導(dǎo)致生精障礙。

睪酮的合成以膽固醇為原料，而膽固醇在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中需要跨線(xiàn)粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein， STAR）在調(diào)節(jié)膽固醇從線(xiàn)粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體內(nèi)膜的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Enangue Njembele 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，MEHP 抑制cAMP 誘導(dǎo)的STAR啟動(dòng)子活性，并降低類(lèi)固醇形成過(guò)程中電子傳遞所必需的鐵氧還蛋白還原酶水平，通過(guò)影響膽固醇的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)化來(lái)抑制類(lèi)固醇的生成（圖2a）。當(dāng)膽固醇進(jìn)入線(xiàn)粒體后，在類(lèi)固醇生成因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）的調(diào)節(jié)下，經(jīng)細(xì)胞色素P450 家族和羥基類(lèi)固醇脫氫酶逐步轉(zhuǎn)化為睪酮，但類(lèi)固醇生成酶的表達(dá)水平受DEHP影響。研究表明，DEHP 引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇生成酶（STAR、P450scc、P45017α、3β-HSD 和17β-HSD）和核受體（SF-1、DAX1、SHP、TR4 和NUR77）水平改變［24］。Sun 等［26］經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DEHP處理可以誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Cyp11a1 和Hsd3b蛋白表達(dá)水平的降低，從而影響睪酮的合成（圖2b）。

甲基化是維持正常生物功能的重要機(jī)制之一，DEHP可誘導(dǎo)類(lèi)固醇激素相關(guān)基因或調(diào)節(jié)因子的甲基化修飾，引起睪丸損傷。Yang 等［27］給予大鼠DEHP連續(xù)灌胃35 d，發(fā)現(xiàn)睪丸組織中Sod2、Gpx1和Igf-1的基因表達(dá)水平顯著降低，且甲基化水平變化與mRNA 水平變化相似。其中胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor-1，ⅠGF-1）是類(lèi)固醇激素的重要調(diào)節(jié)因子，睪丸間質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)高水平的ⅠGF-1 mRNA，而DEHP 通過(guò)基因甲基化修飾降低ⅠGF-1 mRNA 水平，導(dǎo)致生殖障礙?？梢?jiàn)，DEHP可經(jīng)多途徑干擾類(lèi)固醇激素的合成，引發(fā)生殖毒性。

Fig. 2 DEHP/MEHP interferes with testosterone synthesis in testicular Leydig cells圖2 DEHP/MEHP干擾睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮合成

3.2 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡

核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（nuclear factorerythroid 2 related factor 2，Nrf2）是外源性有毒有害物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)其下游血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)，以抵抗氧化應(yīng)激并恢復(fù)細(xì)胞氧化還原平衡。對(duì)出生22~35 d 的青春前期SD 大鼠進(jìn)行DEHP 灌胃處理，可顯著下調(diào)其睪丸組織中Nrf2、HO-1 的表達(dá)，導(dǎo)致睪丸氧化損傷［28］。眾所周知，Nrf2/HO-1信號(hào)通路是機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激的防御機(jī)制，當(dāng)Nrf2/HO-1表達(dá)被抑制，機(jī)體不能有效對(duì)抗氧化應(yīng)激，易引起氧化應(yīng)激相關(guān)損傷。但是Tang 等［29］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DEHP 引起睪丸氧化應(yīng)激損傷，出現(xiàn)Nrf2 表達(dá)上調(diào)，作者認(rèn)為氧化應(yīng)激可能是DEHP 引起睪丸毒性的始動(dòng)因素，在ROS 刺激下，Nrf2 從Keap1 中分離出來(lái)，釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而影響Nrf2 檢測(cè)。當(dāng)然，關(guān)于Nrf2/HO-1信號(hào)通路在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物誘導(dǎo)的男性生殖障礙中的作用機(jī)制還有待明確。

除了氧化應(yīng)激外，DEHP/MEHP在體內(nèi)、外都能誘導(dǎo)TM3 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，增加細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活p53 信號(hào)通路［30］。Yahyavy等［31］研究證實(shí)，DEHP 通過(guò)升高Bax/Bcl-2 比值，增強(qiáng)Caspase-3、Caspase-9活性，促進(jìn)TM3細(xì)胞凋亡，而且在增強(qiáng)其超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性的同時(shí)，還提高了丙二醛含量和ROS 水平。在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，自噬也發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用，Sun等［32］用DEHP處理TM3細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)DEHP可顯著抑制細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞凋亡和自噬。

4 DEHP對(duì)睪丸支持細(xì)胞的毒性與作用機(jī)制

睪丸支持細(xì)胞（sertoli cell）是生精小管內(nèi)唯一與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞，是各級(jí)生精細(xì)胞的支架。支持細(xì)胞的主要功能是參與血-睪屏障（blood-testis barrier，BTB）形成、提供生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)支持、供給生殖細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和吞噬作用，此外支持細(xì)胞還能合成和分泌多種物質(zhì)，如雄激素結(jié)合蛋白、抑制素等。DEHP可通過(guò)破壞BTB，誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞鐵死亡而產(chǎn)生生殖毒性。

4.1 破壞BTB

BTB 是精子發(fā)生正常進(jìn)行的物理保障，為生精細(xì)胞的發(fā)育提供一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境，以保證生精細(xì)胞減數(shù)分裂、變形分化過(guò)程的正常進(jìn)行，以及保持遺傳基因的穩(wěn)定；此外，BTB 可以選擇性透過(guò)生物分子，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的進(jìn)出，同時(shí)還參與構(gòu)造免疫屏障。睪丸支持細(xì)胞是DEHP致睪丸生殖損傷的靶細(xì)胞之一，通過(guò)抑制睪丸支持細(xì)胞增殖，破壞其結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞間的信息傳遞，導(dǎo)致生精細(xì)胞排列紊亂，進(jìn)而影響B(tài)TB 的完整性，最終導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。Zhao等［33］對(duì)小鼠DEHP灌胃4周，在BTB處可見(jiàn)囊泡形成，周?chē)?dòng)蛋白束崩解、斷裂、消失，且AJ 蛋白（整合素β1、N 鈣黏蛋白、E 鈣黏蛋白、α 連環(huán)素、β 連環(huán)素、γ 連環(huán)素）、GJ 蛋白（Cx43）、TJ 蛋白等水平均下降，睪丸支持細(xì)胞連接出現(xiàn)異常，BTB 完整性被破壞，進(jìn)而影響生精過(guò)程。

4.2 誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞鐵死亡

鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的、非細(xì)胞凋亡性的細(xì)胞程序性死亡方式，是由細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS 生成與降解的平衡失調(diào)所致，當(dāng)細(xì)胞抗氧化能力降低時(shí)，易引起脂質(zhì)ROS 堆積，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［34］。通過(guò)降低抗氧化能力來(lái)積累脂質(zhì)ROS，是細(xì)胞鐵死亡的經(jīng)典途徑，但是高水平ROS也可以通過(guò)p53介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡。Yang 等［35］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MEHP 上調(diào)了p38、p-p38α、p53、p-P53、SAT1、ALOX15 的表達(dá)，經(jīng)鐵死亡抑制劑處理TM4 支持細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)p53、p-p53、SAT1 和ALOX15 的表達(dá)均被抑制，這表明MEHP參與了p53 介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。MEHP 誘導(dǎo)p38 磷酸化，并促進(jìn)p53 磷酸化，進(jìn)而增強(qiáng)SAT1 的轉(zhuǎn)錄活性激活p53-SAT1-ALOX15 信號(hào)通路，最終通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡［35］，而脂質(zhì)ROS 的產(chǎn)生反過(guò)來(lái)又可促進(jìn)p38α 的表達(dá)，形成惡性循環(huán)（圖3a）。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPX4）能降解小分子過(guò)氧化物和某些脂質(zhì)過(guò)氧化物，是鐵死亡的核心調(diào)控蛋白，抑制GPX4的表達(dá)也是鐵死亡的經(jīng)典途徑之一。DEHP 可通過(guò)抑制GPX4途徑，導(dǎo)致妊娠小鼠肝功能紊亂和肝細(xì)胞鐵死亡［36］，因此我們推測(cè)DEHP暴露也可通過(guò)GPX4途徑，引起生殖細(xì)胞鐵死亡，誘導(dǎo)生精障礙。脂質(zhì)、ROS 和鐵是鐵死亡涉及的三種核心代謝物，鐵的代謝失調(diào)可誘發(fā)鐵死亡。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFRC）通過(guò)與轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用，將鐵從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，形成細(xì)胞鐵池，鐵池中的游離Fe2+參與Fenton 反應(yīng)，生成ROS，從而誘發(fā)鐵死亡［37］（圖3b）。DEHP可通過(guò)引起線(xiàn)粒體形態(tài)改變和脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞鐵死亡，當(dāng)TFRC基因敲除后可通過(guò)降低線(xiàn)粒體和細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平來(lái)阻斷鐵死亡［33］（圖3c）。Wu等［38］研究發(fā)現(xiàn)，MEHP 可引起睪丸支持細(xì)胞HⅠF-1α 的積聚，并破壞其穩(wěn)定性，導(dǎo)致HⅠF-1α 移位到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)HⅠF-1α/Hmox1 結(jié)合，通過(guò)HⅠF-1α/HO-1信號(hào)通路加劇氧化應(yīng)激，誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡（圖3d）。通過(guò)上調(diào)GPX4 或抑制TFRC 可阻止鐵死亡的發(fā)生，這為DEHP等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物誘導(dǎo)的男性生殖障礙提供了一種潛在的治療策略。

Fig. 3 Mechanism of DEHP/MEHP regulating iron metabolism and inducing ferroptosis in testicular Sertoli cells圖 3 DEHP/MEHP調(diào)控睪丸支持細(xì)胞鐵代謝誘導(dǎo)鐵死亡的作用機(jī)制

5 DEHP的毒性作用具有跨代表觀(guān)遺傳效應(yīng)

越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，環(huán)境暴露可以影響精子的表觀(guān)遺傳學(xué)，如DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和非編碼RNA 表達(dá)的變化，影響生殖和后代的健康［39］。Hsu 等［40］在孕鼠從妊娠第0 天至出生，給予不同劑量DEHP 灌胃，經(jīng)基因分析發(fā)現(xiàn)，DEHP （5 mg·kg-1·d-1） 組出現(xiàn)差異甲基化基因15 個(gè)、差異低甲基化基因130 個(gè)，DEHP（500 mg·kg-1·d-1）組出現(xiàn)差異甲基化基因45個(gè)、差異低甲基化基6個(gè)，這表明產(chǎn)前接觸DEHP會(huì)引起跨代表觀(guān)遺傳效應(yīng)。

妊娠期是精子發(fā)育的敏感窗口，此時(shí)環(huán)境毒物暴露對(duì)男性生殖細(xì)胞的表觀(guān)遺傳重新編程尤為敏感［39］。Oluwayiose等［41］將8周齡C57BL/6J雄性小鼠暴露于DEHP中67 d（約2個(gè)生精周期），并與未暴露的雌性小鼠交配，結(jié)果表明，暴露于DEHP的精子出現(xiàn)DNA甲基化，且改變了胚胎中的DNA甲基化和基因表達(dá)。DEHP毒性的表觀(guān)遺傳效應(yīng)與氧化應(yīng)激失衡有關(guān)，Zhao 等［42］研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 增強(qiáng)了氧化應(yīng)激，抑制Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化途徑，誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡，并增加m6A RNA 修飾水平，改變RNA甲基化調(diào)節(jié)基因FTO和YTHDC2的表達(dá)。

DEHP 還會(huì)引起尿道下裂、隱睪癥等發(fā)育問(wèn)題，這與孕期環(huán)境暴露所引起的胚胎期睪丸發(fā)育異常有關(guān)［43］?；虮磉_(dá)紊亂與尿道下裂的發(fā)生有關(guān)，根據(jù)基因表達(dá)譜分析，F(xiàn)os原癌基因、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位（c-Fos）在尿道下裂中表達(dá)上調(diào)，而這可能與DEHP 暴露有關(guān)。Xiang 等［43］在孕鼠12~19 d經(jīng)口給予DEHP后，發(fā)現(xiàn)雄性尿道下裂仔鼠中c-Fos 表達(dá)增加。這與Yu 等［44］在文獻(xiàn)分析中的結(jié)論一致，即接觸DEHP會(huì)增加隱睪癥和尿道下裂的風(fēng)險(xiǎn)。宮內(nèi)和哺乳期接觸DEHP可破壞睪酮和雌激素的平衡，增加前列腺癌的易感性，Xia 等［45］研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 暴露引起前列腺癌相關(guān)基因GSTP1、PSCA和PTGS2轉(zhuǎn)錄水平的改變。宮內(nèi)暴露于DEHP 也會(huì)擾亂雄性子代大鼠的下丘腦-垂體-睪丸軸功能，且會(huì)增加子代動(dòng)物在成年后患甲狀腺功能障礙的易感性［46］。

6 總結(jié)與展望

DEHP作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的雄性生殖系統(tǒng)造成不同程度的損傷，其中氧化應(yīng)激損傷是DEHP 導(dǎo)致生精障礙的核心機(jī)制，DEHP暴露可引起不同類(lèi)型生殖細(xì)胞的氧化應(yīng)激或ROS 增多，并在此基礎(chǔ)上促進(jìn)細(xì)胞凋亡或引起細(xì)胞過(guò)度自噬等。DEHP對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇激素合成的影響是其重要的生殖毒性作用機(jī)制之一，而鐵死亡是睪丸支持細(xì)胞中常見(jiàn)的作用機(jī)制。DEHP導(dǎo)致基因甲基化除了影響生精過(guò)程外，也會(huì)對(duì)后代產(chǎn)生表觀(guān)遺傳效應(yīng)?？傊?，DEHP 可通過(guò)氧化應(yīng)激、干擾睪酮合成及誘發(fā)鐵死亡等多種途徑分別對(duì)睪丸生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，最終導(dǎo)致雄性生殖障礙，并可通過(guò)表觀(guān)遺傳效應(yīng)影響子代生殖。

目前DEHP暴露對(duì)雄性生殖毒性的研究多局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，人群研究和流行病學(xué)調(diào)查相對(duì)較少，鑒于DEHP在生活中廣泛存在，尤其是在環(huán)境和食品中殘留嚴(yán)重，人群不可避免會(huì)暴露其中，因此在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展人群研究及流行病學(xué)調(diào)查很有必要，闡明DEHP對(duì)人類(lèi)睪丸的毒性作用及機(jī)制，可為避免長(zhǎng)期接觸塑料制品進(jìn)而預(yù)防和減少男性生殖障礙提供理論依據(jù)。此外，生物體在DEHP暴露后，其機(jī)體的清除機(jī)制和治療方案還有待研究，關(guān)于DEHP是否會(huì)損傷肌樣細(xì)胞的功能也尚未見(jiàn)報(bào)道，可作為今后的探討方向。