樊軍武 朱曉梅 范志遠(yuǎn) 劉炳亞 敖 平 陳永聰**

（1）上海大學(xué)物理系，上海 200444；2）上?，F(xiàn)代光學(xué)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海理工大學(xué)光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093；3）同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院乳腺外科，上海 200092；4）上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海消化外科研究所，上海市胃腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025；5）四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，成都 610065）

20 世紀(jì)20 年代，奧托·瓦伯格（Otto Warburg）開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了癌細(xì)胞的特殊代謝行為，即使在充足氧氣供給的情況下，癌細(xì)胞仍然將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸而不是進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），該現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)［1］。Warburg 效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)后近100年間，代謝與癌癥的關(guān)系得到了廣泛的研究。近十多年來(lái)，代謝改變已經(jīng)被視為癌癥的重要特征之一［2-3］。代謝改變可以提供大量的能量和代謝轉(zhuǎn)換所需要的大分子物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核苷酸、脂類以及重要的輔助因子，癌細(xì)胞通過(guò)代謝改變來(lái)維持生存和快速增殖。這也意味著，針對(duì)癌細(xì)胞所表現(xiàn)出的異常代謝途徑可能是治療癌癥的有效手段，靶向癌癥代謝的抗癌療法是癌癥治療的重點(diǎn)研究之一［4］。

癌細(xì)胞通常通過(guò)糖酵解（glycolysis）來(lái)維持能量供應(yīng)和物質(zhì)需求，而絲氨酸/甘氨酸的生物合成是糖酵解的重要分支。糖酵解中間代謝產(chǎn)物3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate，3PG）經(jīng)三步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為絲氨酸（serine），絲氨酸在絲氨酸羥甲基 轉(zhuǎn) 移 酶 （serine hydroxymethyltransferase，SHMT）作用下可逆轉(zhuǎn)化為甘氨酸（glycine）并提供一個(gè)一碳單位參與一碳代謝。一碳代謝由葉酸循環(huán)（folate cycle） 和甲硫氨酸循環(huán)（methionine cycle）耦合形成，能為腫瘤生長(zhǎng)提供必要的蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子。此外，一碳代謝還能夠維持腫瘤微環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)并為甲基化反應(yīng)提供底物［5］。上述一系列相互關(guān)聯(lián)的代謝途徑的中心是由SHMT催化的絲氨酸到甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化，該反應(yīng)是一碳池（one-carbon pool）甲基的主要來(lái)源，也是細(xì)胞內(nèi)核苷酸從頭合成及DNA 甲基化所必需的。絲氨酸/甘氨酸的轉(zhuǎn)化涉及一碳單位的供給和消耗，是影響癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素［6-7］。

癌癥代謝的多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)了絲氨酸/甘氨酸代謝對(duì)維持癌細(xì)胞存活和快速增殖具有重要意義。功能基因組學(xué)證據(jù)表明，絲氨酸/甘氨酸生物合成途徑的過(guò)度激活在乳腺癌和黑色素瘤中推動(dòng)了腫瘤的發(fā)生［8-9］。癌細(xì)胞系的初步分析描述了甘氨酸的消耗以及線粒體絲氨酸/甘氨酸生物合成途徑中酶的表達(dá)都與癌細(xì)胞的增殖速率相關(guān)［10］。之后的相關(guān)研究表明，癌細(xì)胞增殖優(yōu)先消耗絲氨酸而非甘氨酸，高水平的甘氨酸甚至可能會(huì)損害細(xì)胞增殖［11］。癌細(xì)胞優(yōu)先消耗絲氨酸生成甘氨酸表明其用于增殖的一碳單位需求可能推動(dòng)了絲氨酸到甘氨酸的轉(zhuǎn)化。

胃癌（gastric cancer，GC）是世界范圍內(nèi)一種嚴(yán)重的消化道惡性腫瘤，2020 年全球新發(fā)胃癌病例超過(guò)100 萬(wàn)例，死亡病例達(dá)76.9 萬(wàn)例。在我國(guó)，胃癌發(fā)病率和死亡率均處于第3 位，造成沉重的疾病負(fù)擔(dān)。胃癌的發(fā)生和發(fā)展是涉及多因素和多步驟的復(fù)雜病理過(guò)程，其發(fā)病和分子機(jī)制仍不明確［12-13］。胃癌代謝研究的最新進(jìn)展突出了胃癌與絲氨酸/甘氨酸代謝的相關(guān)性。在胃癌組織中，絲氨酸和甘氨酸的總體水平較正常組織顯著增高［14］。絲氨酸/甘氨酸生物合成途徑中的磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase， PHGDH）、磷酸絲氨酸磷酸酶（phosphoserine phosphatase，PSPH） 和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2 （serine hydroxymethyltransferase 2，SHMT2）均與胃癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)［15-17］。癌癥細(xì)胞增殖對(duì)于絲氨酸/甘氨酸的需求是明確的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床現(xiàn)象都表明了絲氨酸/甘氨酸代謝與胃癌有著緊密的聯(lián)系。然而，胃癌細(xì)胞如何攝取和合成絲氨酸/甘氨酸以及其影響胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制仍不清晰［18-19］。

本研究采用一種基于隨機(jī)和非梯度系統(tǒng)的勢(shì)能景觀所建立的自我調(diào)節(jié)算法，在代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)不足的情況下，構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)定的胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型。本文的研究方法由生物學(xué)驅(qū)動(dòng)，目的是找到活細(xì)胞能夠在代謝物和酶均處于不斷變化的情況下仍能保持代謝穩(wěn)定的方法。模型的構(gòu)建過(guò)程通過(guò)減少與隨機(jī)波動(dòng)相關(guān)的李雅普諾夫（Lyapunov）函數(shù)的變化，將酶參數(shù)引向能夠使代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的空間。選擇不同的反應(yīng)初始值，對(duì)模型包含的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行多次模擬計(jì)算，將計(jì)算結(jié)果與胃癌組織基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證了本文所構(gòu)建的胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型的可靠性。在此基礎(chǔ)上，改變模型中代謝網(wǎng)絡(luò)的邊界條件，模擬胃癌細(xì)胞對(duì)絲氨酸和甘氨酸的不同攝取情況進(jìn)而調(diào)控絲氨酸/甘氨酸的轉(zhuǎn)換方向。通過(guò)對(duì)比處于不同絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化速率下的模型代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)通量，發(fā)現(xiàn)絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化對(duì)S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM） 和S- 腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH）的生成具有重要影響，為靶向絲氨酸/甘氨酸的胃癌治療提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 絲氨酸/甘氨酸的生物合成

絲氨酸/甘氨酸的生物合成途徑是糖酵解過(guò)程的一個(gè)重要代謝分支。同時(shí)，其也與三羧酸循環(huán)以及一碳代謝（one-carbon metabolism）具有密切聯(lián)系（圖1）。絲氨酸和甘氨酸的生物合成包括兩個(gè)過(guò)程：由葡萄糖從頭合成絲氨酸以及絲氨酸和甘氨酸的可逆轉(zhuǎn)化。在第一步中，葡萄糖（glucose）經(jīng)多步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為糖酵解的中間產(chǎn)物3PG，其在PHGDH 和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的共同作用下被氧化為3- 磷酸羥基丙酮酸（3-phosphate hydroxypyruvate，3PHP）。其次，磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶（phosphoserine aminotransferase1，PSAT1）利用谷氨酸（glutamate，Glu）為氮供體，轉(zhuǎn)氨生成3-磷酸絲氨酸（3-phosphoserine，3PSer）和α 酮戊二酸（alpha-ketoglutarate，α-KG），α-KG也是參與三羧酸循環(huán)的重要代謝物。最后，通過(guò)PSPH 去磷酸化生成絲氨酸。絲氨酸生成后，在SHMT 作用下實(shí)現(xiàn)絲氨酸和甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化。SHMT的兩種同工酶SHMT1（細(xì)胞質(zhì)）和SHMT2（線粒體）催化相同的反應(yīng)。

1.2 一碳代謝

Fig. 1 An important branch of glycolysis：biosynthesis pathways of serine and glycine

Fig. 2 Overview of one-carbon metabolic pathway formed by the coupling of folate cycle and methionine cycle

一碳代謝是指葉酸循環(huán)和蛋氨酸循環(huán)耦合形成的雙環(huán)途徑（圖2）。在葉酸循環(huán)中，葉酸（folic acid）被二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 還原兩次， 最終生成四氫葉酸（tetrahydrofolate，THF）。THF 接受來(lái)自絲氨酸生成甘氨酸時(shí)提供的一碳單位形成5,10-亞甲基四氫葉酸（5,10-methylene-THF，me-THF）。此外，甘氨酸在甘氨酸脫氫酶（glycine dehydrogenase，GLDC）作用下也可生成me-THF。me-THF既可被5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylene-THF reductase，MTHFR） 還原生成5-甲基四氫葉酸（5-methyl-THF，mTHF），也可被亞甲基四氫葉酸脫 氫 酶 1/2/2L （methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase1/2/2L，MTHFD1/2/2L）進(jìn)一步氧化為10-甲酰四氫葉酸（10-formyl-THF，F(xiàn)-THF）。最后，mTHF 在甲硫氨酸合成酶（methionine synthase，MS）作用下去甲基化形成THF，同時(shí)將一碳單位轉(zhuǎn)移至同型半胱氨酸（homocysteine）進(jìn)而生成甲硫氨酸（methionine）。

mTHF的去甲基化標(biāo)志著葉酸循環(huán)的完成和甲硫氨酸循環(huán)的開始。甲硫氨酸在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine adenosyltransferase，MAT）作用下生成SAM。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyl transferase，HMT）進(jìn)一步將SAM 去甲基化生成SAH。最后，SAH 被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAH hydrolase，SAHH）催化生成同型半胱氨酸，從而完成甲硫氨酸循環(huán)。

1.3 研究方法

本文通過(guò)將新陳代謝置于一個(gè)適應(yīng)性過(guò)程中來(lái)研究代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)［20］。本方法參數(shù)空間中存在一種通用的“調(diào)節(jié)”動(dòng)力學(xué)，其作用是提高代謝網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。關(guān)鍵思想是采用動(dòng)態(tài)景觀及其相關(guān)的勢(shì)函數(shù)來(lái)描述隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。通過(guò)隨機(jī)動(dòng)力學(xué)分解，建立了非梯度系統(tǒng)中勢(shì)函數(shù)的存在性和構(gòu)造［21］?！罢{(diào)節(jié)”動(dòng)力學(xué)能夠?qū)⒚竻?shù)引向能夠使代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的空間。此外，考慮到化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)約束，進(jìn)一步約束了酶參數(shù)空間的范圍，從而提供一個(gè)真實(shí)的代謝模型。下面是本文研究方法的具體內(nèi)容。

對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)，可表示為：

其中，S是反應(yīng)的底物，P是反應(yīng)的產(chǎn)物。m和n分別是底物和產(chǎn)物的數(shù)量。VF和VB分別為反應(yīng)的正向和反向最大反應(yīng)速率。

反應(yīng)的通用速率方程［22］可寫為：

其中，xi和yj分別是底物和產(chǎn)物的濃度。Ki和Kj'是每個(gè)底物的和產(chǎn)物的米氏常數(shù)（Michaelis-Menten constant）。f1和f2是由和給出的歸一化因子，用來(lái)表示產(chǎn)物抑制作用。f1和f2滿足如下關(guān)系：

方程（2）同時(shí)描述正向反應(yīng)和逆向反應(yīng)，表面上看與簡(jiǎn)單的米氏方程形式不同。在前期工作中［22-23］，本課題組詳細(xì)推導(dǎo)了對(duì)于典型的酶反應(yīng)過(guò)程，包括單一底物Uni-Uni 機(jī)制、單一底物Uni-Bi機(jī)制、雙底物隨機(jī)序列Bi-Uni機(jī)制、雙底物隨機(jī)序列Bi-Bi機(jī)制、雙底物順規(guī)序列Bi-Bi機(jī)制以及雙底物乒乓序列Bi-Bi 機(jī)制，通過(guò)適當(dāng)?shù)膮?shù)變換，其反應(yīng)方程都能放到方程（2）的框架中。因此，該方程具有普適性。同時(shí)，對(duì)于大規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)建模，采用普適形象的酶反應(yīng)速率形式能夠處理任意數(shù)量的底物和產(chǎn)物，特別有利于大規(guī)模的計(jì)算。

對(duì)于方程（3），其表示酶反應(yīng)可逆進(jìn)行。當(dāng)?shù)孜餄舛葂i和產(chǎn)物濃度yj很小時(shí)，方程（2）的分母可被歸一化。對(duì)于方程（4），其表示酶反應(yīng)逆向進(jìn)行，此時(shí)VF= 0，反應(yīng)速率和xi無(wú)關(guān)，方程（2）的分子和分母中的第一項(xiàng)可被消除。類似地，方程（5）表示酶反正向進(jìn)行，此時(shí)VB= 0，方程（2）中的分子和分母等于零。

本文考慮一個(gè)由N個(gè)代謝物構(gòu)成的代謝網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)代謝物濃度可表示為：

其中，T表示轉(zhuǎn)置。對(duì)于這樣的一個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)，關(guān)于網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)方程可寫為：

其中，S是(N×M)的化學(xué)計(jì)量矩陣，連接化學(xué)反應(yīng)和代謝物，M是代謝網(wǎng)絡(luò)包含的化學(xué)反應(yīng)總數(shù)。v(x)是(M× 1)的速度矩陣，其每個(gè)分量以式（2）形式表示。b(x，t)是(N× 1)的向量，表示進(jìn)出代謝網(wǎng)絡(luò)的通量，也是模型中代謝網(wǎng)絡(luò)的邊界條件。V為參數(shù)空間中覆蓋網(wǎng)絡(luò)上所有化學(xué)反應(yīng)的向量，即所有反應(yīng)的VF和VB。如果b(x，t)不是t的顯函數(shù)，那么b(x，t)可以并入式（7）的第一項(xiàng)中。此后，假設(shè)b(x，t) =b(x)，式（7）變?yōu)椋?/p>

處于式（8）下的動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)通常是不穩(wěn)定的，一些代謝物會(huì)迅速積累而另一些會(huì)快速消耗。在這里，相關(guān)的一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題是：活細(xì)胞如何在代謝物和酶濃度處于波動(dòng)下調(diào)整其參數(shù)并保持代謝穩(wěn)定性。為了找到在式（8）下調(diào)整參數(shù)以實(shí)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的方法，本文對(duì)式（8） 添加隨機(jī)噪聲ξ(x，V，t)，其表示代謝網(wǎng)絡(luò)上的隨機(jī)波動(dòng)，得到：

其中，D為隨機(jī)噪聲ξ的擴(kuò)散矩陣，δ為隨機(jī)噪聲ξ的方差，T表示矩陣的轉(zhuǎn)置。ξ的均值為0，方差如式（10）所示。值得注意的是，本方法中，系統(tǒng)的穩(wěn)定性是指穩(wěn)態(tài)解可以在隨機(jī)擾動(dòng)下保持穩(wěn)定，而隨機(jī)擾動(dòng)存在于任何生物系統(tǒng)中。因此，讓其參與“調(diào)節(jié)”的構(gòu)建是合理的。

通過(guò)上文提及的隨機(jī)動(dòng)力學(xué)分解［21］，識(shí)別出系統(tǒng)的勢(shì)函數(shù)?(x，V)，即式（9）的Lyapunov 函數(shù)，其滿足如下關(guān)系：

其中，∑(X，V)是一個(gè)非負(fù)對(duì)稱矩陣，Ω(x，V)是一個(gè)反對(duì)稱矩陣?！?X，V)和Ω(x，V)均由擴(kuò)散矩陣D決定。在本文的定義中，穩(wěn)定的代謝網(wǎng)絡(luò)解對(duì)應(yīng)勢(shì)?(x，V)中的局部最小值。

進(jìn)一步將一個(gè)非負(fù)代價(jià)函數(shù)ψ(x，V) 與Lyapunov 函數(shù)?(x，V)的變化聯(lián)系起來(lái)。ψ(x，V)為每個(gè)代謝物的變化速率F與∑的乘積，表示代謝網(wǎng)絡(luò)的整體通量（flux）。

當(dāng)V不變時(shí)，ψ(x，V)與?(x，V)有如下關(guān)系：

由上式可知，當(dāng)V不變時(shí)，?(x，V)實(shí)際上是原始網(wǎng)絡(luò)的Lyapunov 函數(shù)。在x(t)的軌跡上，作為L(zhǎng)yapunov 函數(shù)的一個(gè)性質(zhì)，?(x，V)隨時(shí)間單調(diào)遞減，這也被式（13）所證示。如果x接近穩(wěn)態(tài)，則因此，“調(diào)節(jié)”的目的是改變V，使d?(x，V)/dt趨近0-。為此，本文對(duì)V加入了如下調(diào)節(jié)：

其中，W(x，V)是對(duì)稱部分有正特征值的矩陣。我們考慮真實(shí)的代謝過(guò)程，確定了W(x，V)的具體形式，“調(diào)節(jié)”的最終形式為：

其中，τ是調(diào)節(jié)過(guò)程的特征時(shí)間尺度，NK是指受VK影響的代謝物總數(shù)，VK∈{VF，VB}，cn是第n個(gè)代謝物的碳數(shù)。當(dāng)給出VF和VB的初始值后，如果代謝網(wǎng)絡(luò)不能達(dá)到穩(wěn)定，則初始值能夠在式（15）的作用下逐步增大并最終使代謝網(wǎng)絡(luò)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。通過(guò)式（15）得到了一組可以滿足系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定的{VF，VB}。注意，任何通量平衡解F(x，V) = 0 都是式（15）的解。因此，式（15）可以被視為是一種增強(qiáng)的通量平衡分析，其優(yōu)勢(shì)是可排除代謝網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定解。對(duì)于式（14）能夠提高代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的證明以及W(x，V)具體形式的確定，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［20］。

本文進(jìn)一步考慮熱力學(xué)定律對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，化學(xué)反應(yīng)的平衡由生成物和反應(yīng)物之間的吉布斯自由能差決定，這反過(guò)來(lái)又決定了每個(gè)反應(yīng)的平衡常數(shù)Keq。因此，每個(gè)化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)約束如下所示：

其中，ΔG是吉布斯自由能差，R為普適氣體常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度。 式 （16） 在準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)（quasistationary）下成立，對(duì)于每組{VF，VB}，式（16）給出了米氏常數(shù){K，K'}的一組優(yōu)化條件。對(duì)于滿足式（16）的{K，K'}，保持和的比值不變從而確定代謝物的最佳濃度。對(duì)于真實(shí)的代謝過(guò)程，{K，K'}的變化可能是代謝物抑制或激活的結(jié)果。

作為方法的一個(gè)應(yīng)用，還可以計(jì)算出代謝網(wǎng)絡(luò)的弛豫時(shí)間（relaxation time），即代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝物濃度由偏離穩(wěn)態(tài)恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)所用的時(shí)間，其可以用來(lái)評(píng)估代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)解的穩(wěn)定性以及代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)特性。為了量化分析，將式（7）線性化。當(dāng)式（7）處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，計(jì)算其雅可比矩陣（Jacobian matrix）的特征值λi。本文將弛豫時(shí)間定義為：

其中，N是非零特征值的個(gè)數(shù)。零特征值對(duì)應(yīng)于線性化方程中的冗余自由度，因此它們被排除在計(jì)算之外。非零值的數(shù)量由式（7）中化學(xué)計(jì)量矩陣S的秩決定，當(dāng)不存在負(fù)實(shí)部特征值時(shí)，證明了解的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型

本研究構(gòu)建的胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型所包含的代謝途徑包括糖酵解（glycolysis）、糖異生（gluconeogenesis）、絲氨酸和甘氨酸的生物合成（serine and glycine biosynthesis）、一碳代謝以及TCA 循環(huán)（圖3）。模型代謝網(wǎng)絡(luò)由61 個(gè)代謝物和50個(gè)化學(xué)反應(yīng)構(gòu)成，表1列出了代謝網(wǎng)絡(luò)所包含的代謝物及相關(guān)參數(shù)信息。

Table 1 Metabolites and related parameters contained in the metabolic kinetics model of gastric cancer cell

Continued to Table 1

Continued to Table 1

由式（15）可知，模型代謝網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)通量與VF和VB的初始值有關(guān)。根據(jù)這一特點(diǎn)，我們可以通過(guò)改變VF和VB的初始值來(lái)對(duì)模型進(jìn)行多次計(jì)算，從而得到具有一定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的模型穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)通量，這有助于對(duì)模型可靠性和真實(shí)性的判斷。因此，我們從小的初始值開始，逐步增大VF和VB的值（0.01~1，增幅0.01），對(duì)模型進(jìn)行了100次模擬計(jì)算并得到其對(duì)應(yīng)初始值的代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)通量（模型100次模擬計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表S1）。

對(duì)100 次代謝網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)通量進(jìn)行聚類分析，其穩(wěn)態(tài)通量的整體水平如圖4a 所示。之后，使用來(lái)自上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院的胃癌組織RNA-seq數(shù)據(jù)，從中提取出圖3所包含的酶基因數(shù)據(jù)并按照?qǐng)D4a 排序，接著采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)其進(jìn)行降維處理（圖4b）。圖4a 中43 個(gè)化學(xué)反應(yīng)（總數(shù)為45）的穩(wěn)態(tài)通量水平與圖4b 中對(duì)應(yīng)的酶基因表達(dá)水平一致，匹配率為95.6%。上述結(jié)果表明，模型計(jì)算結(jié)果與其對(duì)應(yīng)的胃癌組織RNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)良好，證明了本文所構(gòu)建的胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型的可靠性。關(guān)于模型構(gòu)建及驗(yàn)證的更多細(xì)節(jié)見(jiàn)3.1。

2.2 絲氨酸/甘氨酸代謝轉(zhuǎn)換的可控調(diào)節(jié)

為確定胃癌細(xì)胞對(duì)絲氨酸/甘氨酸的利用情況以及絲氨酸/甘氨酸攝入對(duì)胃癌細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，本文通過(guò)改變胃癌細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的邊界條件，即式（8）中的b(x)，模擬了胃癌細(xì)胞的4 種攝入狀態(tài)：不攝入絲氨酸和甘氨酸；只攝入絲氨酸；只攝入甘氨酸；絲氨酸和甘氨酸均攝入。絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化的穩(wěn)態(tài)通量計(jì)算結(jié)果與絲氨酸/甘氨酸攝入的對(duì)應(yīng)情況如表2所示。

由表2可知，絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換的穩(wěn)態(tài)通量隨著絲氨酸/甘氨酸攝入情況的不同，其計(jì)算結(jié)果存在符號(hào)的改變，表明絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化的方向發(fā)生了相應(yīng)的變化。在胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型中，胞外絲氨酸的可用性決定了胞內(nèi)絲氨酸/甘氨酸的轉(zhuǎn)換方向。當(dāng)胞外絲氨酸可用時(shí)，胞內(nèi)由絲氨酸生成甘氨酸；當(dāng)胞外絲氨酸不可用時(shí)，胞內(nèi)由甘氨酸生成絲氨酸。這也意味著，通過(guò)改變模型的邊界條件能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換的可控調(diào)節(jié)。

2.3 模型代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)通量變化

絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換提供的一碳單位能夠參與多種可能的代謝途徑影響細(xì)胞的增殖能力，包括核苷酸的生物合成、蛋白質(zhì)的生物合成以及DNA 的甲基化［5］（圖5）。為確定絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化對(duì)胃癌細(xì)胞一碳代謝的動(dòng)態(tài)影響，本文計(jì)算了不同絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換速率下胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型的代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)通量。

當(dāng)模型不能從胞外攝取絲氨酸和甘氨酸時(shí)，細(xì)胞內(nèi)由甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸（表2）。在這種情況下，上調(diào)甘氨酸生成絲氨酸的VF和VB，來(lái)模擬增加其對(duì)應(yīng)的酶（SHMT）活性。此時(shí)一碳單位的消耗速度增加，其能夠影響一碳代謝中多個(gè)調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵代謝物（mTHF，SAM 等）的生成水平。這也意味著，通過(guò)計(jì)算模型處于不同SHMT活性下的一碳代謝穩(wěn)態(tài)通量，能夠確定一碳代謝中受絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化速率影響最顯著的代謝反應(yīng)。圖6 展示了模型絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換處于VF,VB=1（圖6a）和VF,VB=10（圖6b）時(shí)一碳代謝途徑的穩(wěn)態(tài)通量計(jì)算結(jié)果（其他反應(yīng)速率不變）。

Fig. 5 One-carbon unit from the serine/glycine conversion can be involved in several possible metabolic pathways to influence cell proliferation

Fig. 6 Steady-state flux of one-carbon metabolism pathways in kinetics model of gastric cancer cells at conversion rate is equal to 1（a）and 10（b）

表3列出了一碳代謝中各個(gè)化學(xué)反應(yīng)在甘氨酸生成絲氨酸的VF和VB由1 變?yōu)?0 后的穩(wěn)態(tài)通量增幅。由表3可知，當(dāng)甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸的速率提高時(shí)，胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型顯著增加生成SAM、SAH 和同型半胱氨酸的穩(wěn)態(tài)通量，分別增加了231.58%、213.57%和212.23%。表明在胃癌細(xì)胞中，絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)化速率顯著影響一碳代謝中SAM、SAH和同型半胱氨酸的生成水平。

Table 3 The percentage increase of steady-state flux of one-carbon metabolism after VF and VB change from 1 to 10

3 討論

3.1 胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

3.1.1邊界條件

在胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建過(guò)程中，除了確定模型所包含的代謝途徑（圖3），還需要考慮代謝網(wǎng)絡(luò)的邊界條件。當(dāng)只選擇細(xì)胞中完整代謝反應(yīng)的一個(gè)子集進(jìn)行研究時(shí)，需要處理所選部分與細(xì)胞其余部分以及細(xì)胞環(huán)境之間的通量。本文采用3 種處理方式的耦合來(lái)模擬式（7）中的外部相互作用。

第一種處理方法是讓代謝物如CO2或磷酸鹽（phosphate）保持恒定的濃度。這適用于代謝物參與大量反應(yīng)，或者代謝物可以自由地進(jìn)出細(xì)胞。第二種處理是對(duì)于某些特定的代謝物對(duì)（通常是輔酶），例如三磷酸腺苷（ATP） 和二磷酸腺苷（ADP）。其中，一對(duì)代謝物中的某一個(gè)代謝物總是出現(xiàn)在另一個(gè)代謝物所參與反應(yīng)的不同側(cè)。因此，這些特定代謝物對(duì)的總濃度在代謝網(wǎng)絡(luò)上保持守恒。本文通過(guò)為每對(duì)代謝物添加虛擬循環(huán)反應(yīng)（virtual recycling reaction）來(lái)模擬邊界通量去處理這種類型。第三種也是最常見(jiàn)的一種邊界條件，涉及代謝網(wǎng)絡(luò)的養(yǎng)分?jǐn)z?。╪utrient intake）和生物量生產(chǎn)（biomass production）。在代謝動(dòng)力學(xué)模型中，除了代謝網(wǎng)絡(luò)所包含的代謝物（表1），還添加了一種虛擬的“外部”代謝物（external metabolite），它能夠和代謝網(wǎng)絡(luò)中的某些代謝物進(jìn)行反應(yīng)，以此代表這些代謝物和模型中未包括的代謝部分之間的可調(diào)節(jié)交換。在2.2中，正是通過(guò)調(diào)節(jié)這種“外部”代謝物與絲氨酸/甘氨酸的通量交換實(shí)現(xiàn)了絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換的可控調(diào)節(jié)。

3.1.2初始值

對(duì)于大規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)建模，獲得足夠多的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)參數(shù)一直是一個(gè)主要的障礙［26］。在沒(méi)有可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)情況下，本文將代謝物的初始濃度設(shè)為1 mmol/L。同理，將式（2）中的初始米氏常數(shù)Ki和Kj'分別設(shè)為其對(duì)應(yīng)底物和產(chǎn)物的初始濃度，即xi/Ki=xj/Kj'= 1。這樣的設(shè)定來(lái)自對(duì)生理?xiàng)l件下細(xì)胞中化學(xué)反應(yīng)的觀察，當(dāng)反應(yīng)物濃度與酶的親和力相匹配時(shí)，酶是最有效的［27］。對(duì)于生理?xiàng)l件下已知可逆的所有化學(xué)反應(yīng)，其熱力學(xué)平衡常數(shù)（thermodynamic equilibrium constants）Keq設(shè)為1。對(duì)于模型中所有化學(xué)反應(yīng)的VF和VB，不同的初始值會(huì)得到不同的代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)通量。本文對(duì)VF和VB選擇了較小的初始值。如果初始值能夠使代謝網(wǎng)絡(luò)達(dá)到穩(wěn)定，則不對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。如果初始值不能使代謝網(wǎng)絡(luò)達(dá)到穩(wěn)定，則其在方程（15）的調(diào)控作用下，逐步增大并最終能夠使代謝網(wǎng)絡(luò)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。對(duì)于胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型所包含的61 個(gè)代謝物，30 個(gè)由胃癌組織代謝組學(xué)數(shù)據(jù)確定［24-25］，其余濃度均設(shè)為1 mmol/L（表1）。當(dāng)?shù)玫轿赴┘?xì)胞更多精確的動(dòng)力學(xué)參數(shù)信息時(shí)，模型可以得到進(jìn)一步優(yōu)化。

3.1.3模型計(jì)算結(jié)果與對(duì)應(yīng)RNA-seq數(shù)據(jù)的對(duì)比

在2.1中，為驗(yàn)證本文所構(gòu)建的胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型的可靠性，將不同初始值下的模型代謝網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)通量與上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院的胃癌組織RNA-seq 數(shù)據(jù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GSE54129）進(jìn)行了對(duì)比（圖4）。在對(duì)生物學(xué)信息進(jìn)行分析時(shí)，通常會(huì)面臨大量的高維數(shù)據(jù)，如基因表達(dá)數(shù)據(jù)（圖4b）和蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)等。這些數(shù)據(jù)可能包含大量的變量，而且這些變量之間可能存在復(fù)雜的相互關(guān)系。為了更好地理解和解釋這些數(shù)據(jù)，需要將這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為更低維度的表示形式。PCA 就是一種常用的降維方法，它可以將高維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為低維數(shù)據(jù)，同時(shí)保留原始數(shù)據(jù)中的主要變化信息［28］。換句話說(shuō)，通過(guò)PCA 降維，能將生物學(xué)信息中的“噪聲”信息去除。

在圖4a 中，根據(jù)聚類分析結(jié)果將模型計(jì)算結(jié)果分為3 組（A1、A2、A3），其分別與圖4b 中根據(jù)基因表達(dá)情況和聚類分析結(jié)果（PCA 降維后）所劃分的3 組胃癌組織樣本（B1、B2、B3）相對(duì)應(yīng)。在對(duì)比過(guò)程中，優(yōu)先考慮A1-B1和A3-B3。除去電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）部分（原因見(jiàn)3.1.1），選擇45個(gè)化學(xué)反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)通量與其對(duì)應(yīng)的酶基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比。其中，43 個(gè)化學(xué)反應(yīng)對(duì)比良好。需要特別說(shuō)明的是，與3.2相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)被包含在內(nèi)。

3.2 絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換影響胃癌細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)機(jī)制

在2.2中，通過(guò)改變胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型攝取絲氨酸/甘氨酸的能力，模擬胃癌細(xì)胞不同的營(yíng)養(yǎng)攝取模式。當(dāng)絲氨酸可用時(shí)，模型優(yōu)先消耗絲氨酸生成甘氨酸，表明胃癌細(xì)胞與其他多種癌癥細(xì)胞一樣優(yōu)先攝取絲氨酸以滿足其增殖需求［11］。由表2可知，模型胞外絲氨酸的可用性還能夠決定胞內(nèi)絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換的方向，這與多種腫瘤的生長(zhǎng)和增殖都依賴于細(xì)胞外絲氨酸的可用性一致［29］。當(dāng)小鼠被限制了絲氨酸和甘氨酸的攝入時(shí)，HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞的異種移植生長(zhǎng)速度大約是正常飲食的一半［30］。在人類結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞系中，細(xì)胞在含有絲氨酸而不含甘氨酸的培養(yǎng)基中的增殖程度，與在含有這兩種氨基酸的培養(yǎng)基中的增殖程度難以區(qū)分，而單獨(dú)切斷絲氨酸與耗盡這兩種氨基酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響程度相同［11］。結(jié)合上述研究及本文的模擬結(jié)果，表明絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換的方向改變可能是絲氨酸影響癌癥細(xì)胞增殖的關(guān)鍵原因。

絲氨酸到甘氨酸的轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)一碳單位，而甘氨酸到絲氨酸的轉(zhuǎn)化需要一個(gè)一碳單位（圖5）。胃癌細(xì)胞優(yōu)先消耗絲氨酸生成甘氨酸表明其對(duì)于一碳單位的需求可能推動(dòng)了絲氨酸到甘氨酸的轉(zhuǎn)化。在2.3中，通過(guò)增加胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型中甘氨酸轉(zhuǎn)換成絲氨酸的反應(yīng)速率，模擬胃癌細(xì)胞快速消耗一碳單位，這會(huì)導(dǎo)致其用于細(xì)胞增殖的一碳單位不足。通過(guò)觀察模型在一碳單位不足應(yīng)激下的自主調(diào)控發(fā)現(xiàn)，其顯著上調(diào)了生成SAM 和SAH的穩(wěn)態(tài)通量（分別增加231.58%和213.57%），而其他代謝途徑如mTHF 生成的穩(wěn)態(tài)通量變化則較小（增加23.97%）。在多種類型的癌細(xì)胞中，葉酸代謝所提供的一碳單位參與SAM 生成的反應(yīng)似乎具有較低的活性，這與本文2.3中SAM的生成通量水平較低一致（圖4）。但最近的研究表明，絲氨酸的可用性能夠影響ATP 的從頭合成從而間接支持SAM 的生成［31］，本文的結(jié)果進(jìn)一步支持了該結(jié)論。

SAM 是DNA 和RNA 甲基化以及組蛋白甲基化反應(yīng)的主要甲基供體，DNA 序列特定位點(diǎn)和組蛋白尾部的甲基化是人體基因組中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要表觀遺傳特征之一。SAM 及其衍生物SAH 可以通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵表觀遺傳酶的活性，直接影響腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳景觀（epigenetic landscape），最終決定癌癥細(xì)胞的命運(yùn)［32-33］。最近的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明，SAM對(duì)于胃癌細(xì)胞的增殖能力具有重要影響。高水平的SAM 顯著抑制了胃癌細(xì)胞的增殖能力，而低水平的SAM 則能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖［34］。此外，SAM 也被證明能夠顯著影響體外乳腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力［35-36］。胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型在甘氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸的速率提高時(shí)，顯著提升了SAM的生成通量，而SAM又與胃癌細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)。這表明可以通過(guò)改變胃癌細(xì)胞中絲氨酸/甘氨酸的轉(zhuǎn)化速率來(lái)調(diào)控SAM 的生成，其可能通過(guò)改變細(xì)胞甲基化水平進(jìn)而影響其增殖能力。

綜上所述，本文的研究結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞中由絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換所提供的一碳單位對(duì)SAM和SAH 的生成具有重要影響，而SAM 作為細(xì)胞內(nèi)重要的甲基供體，其水平能夠直接調(diào)控細(xì)胞的增殖能力。這表明在胃癌細(xì)胞中，絲氨酸/甘氨酸代謝很有可能是通過(guò)改變SAM 水平進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞甲基化來(lái)影響其增殖能力。這可能是絲氨酸/甘氨酸代謝能夠影響胃癌細(xì)胞增殖的一種潛在動(dòng)力學(xué)機(jī)制。

4 結(jié)論

胃癌是世界范圍內(nèi)惡性程度最高的腫瘤之一，也是中國(guó)重大的健康威脅。癌癥代謝的相關(guān)研究表明，絲氨酸/甘氨酸代謝對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力具有重要影響。本研究通過(guò)構(gòu)建胃癌細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)模型并對(duì)其進(jìn)行調(diào)控分析，證明了胃癌細(xì)胞對(duì)于絲氨酸的優(yōu)先攝取以及絲氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)換速率對(duì)SAM 和SAH 生成的重要影響，其很有可能是絲氨酸/甘氨酸代謝能夠影響胃癌細(xì)胞增殖的一種潛在動(dòng)力學(xué)機(jī)制。本文的研究結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了癌癥細(xì)胞絲氨酸/甘氨酸代謝與SAM的聯(lián)系，這為靶向絲氨酸/甘氨酸代謝的抗癌療法提供了新的思路和方向。

利用本研究所采用的大型代謝動(dòng)力學(xué)建模方法，能夠在動(dòng)力學(xué)參數(shù)不足的情況下構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的代謝動(dòng)力學(xué)模型。當(dāng)獲得更多可靠的生物學(xué)信息時(shí)，模型可以被進(jìn)一步優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)改變癌癥細(xì)胞動(dòng)力學(xué)模型的邊界條件或者特定代謝途徑的反應(yīng)速率，能夠模擬癌癥細(xì)胞在不同應(yīng)激生理?xiàng)l件下的自主反應(yīng)，為探索癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了一種新的視角。

致謝感謝上海納諾巴伯納米科技有限公司對(duì)本研究的幫助和支持，感謝實(shí)驗(yàn)室成員姚夢(mèng)超、熊瑞琪、蘇洋、楊旭云的討論。

附件見(jiàn)本文網(wǎng)絡(luò)版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）：

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