胡舒嘯 陳惠香 胡 勝 趙一霞 季安全 李 洋 廉 潔 孫啟凡**

（1）中國人民公安大學偵查學院，北京 100038；2）公安部鑒定中心，現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室，法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038；3）山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，太原 030001）

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，具有高度穩(wěn)定性及組織特異性等優(yōu)點［1］。自2009年Hanson及其團隊首次揭示了miRNA應用于法醫(yī)體液鑒別的潛力以來，越來越多的體液特異性miRNA被篩選和驗證［2-5］。體液鑒別是法醫(yī)學中的一個重要課題，它可以為犯罪現(xiàn)場重建、嫌疑人排除、受害者辨認等提供重要的線索和證據(jù)。目前法醫(yī)學借助特異性miRNA 對未知樣本進行體液鑒別主要依靠的是實時熒光定量PCR （red time fluorogenic quantitative PCR）檢測技術(shù)。該方法可以高效靈敏地定量檢測低豐度表達的miRNA分子，也被稱為法醫(yī)學定量檢測miRNA的金標準［6-7］。但目前使用該技術(shù)的相關(guān)研究大多采用單獨逆轉(zhuǎn)單重擴增的檢測方式，當實驗中需要對多個miRNA 標記進行同時檢測時，就不可避免地需要進行多個單重檢測反應［8-11］。同時犯罪現(xiàn)場中提取到的檢材往往是微量的，此時往往需要對其等分或者進行稀釋，而這兩種策略都是以降低靈敏度為代價。此外，并行多個單重分析會成倍地增加工作量、各項成本以及錯誤風險，不利于將相應的研究成果真正意義的應用到法醫(yī)實踐中?；谝陨显?，建立起miRNA 多重實時熒光定量PCR 檢測體系可以使其在兼顧準確的同時更高效地對miRNA進行檢測。

血液（血痕）是犯罪現(xiàn)場中最為常見的檢材，在一些性侵案中確定血痕是暴力損傷性出血還是女性正常的生理性出血造成的對于確定案件性質(zhì)以及犯罪現(xiàn)場重建都有著十分重要的意義［12］。本實驗室前期基于miR-451a/miR-21-5p的表達量關(guān)系鑒別月經(jīng)血（menstrual blood， MB） 與外周血（peripheral blood，PB）的方法以及單重實時熒光定量PCR 檢測技術(shù)，成功實現(xiàn)了對PB 和MB 的100%鑒別［10-11］，但該檢測方法需要分別對兩種miRNA 進行定量檢測。本文在此基礎(chǔ)上，進一步建立了可同時定量miR-451a和miR-21-5p的雙重檢測體系，并對其鑒別能力和實際應用能力進行了驗證。結(jié)果表明，該檢測體系具有良好的特異性、重復性和準確度，同樣可以100%區(qū)分PB和MB，同時還大大節(jié)省了實驗時間和樣本消耗，為建立更多重miRNA 的實時熒光定量PCR 檢測體系提供了思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本采集

依據(jù)知情同意原則，本實驗共采集國內(nèi)北方地區(qū)25~35 歲志愿者樣本64 份，其中PB 樣本和MB樣本各23 份，唾液（saliva，SA） 樣本、精液（semen， SE） 樣本和陰道分泌物（vaginal secretion，VA）樣本各6份。58份用作構(gòu)建鑒別方法，剩余6份（3PB，3MB）被制作成模擬案件樣本驗證58份樣本數(shù)據(jù)所得到的鑒別方法的準確性。樣本采集已通過公安部物證鑒定中心倫理委員會審查批準。樣本的采集均符合研究要求和操作規(guī)范，制備處理后置于-80℃冰箱中備用［11］。

1.1.2制備標準品及引物探針

從miRBase 數(shù)據(jù)庫中查詢并下載miR-451a 與miR-21-5p 的序列信息，結(jié)合引物探針設(shè)計原則和miRNA 的自身特殊屬性［13-17］，使用在線軟件OligoAnalyzer? Tool 和軟件Primer Express 3.0 自行設(shè)計適用于雙重檢測的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、實時熒光定量PCR引物（通用正向引物、特異性反向引物）以及TaqMan-MGB 探針（表1）。以上材料委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-451a、 miR-21-5p、 miR-891a-5p、 miR-144-5p、miR-203a-3p和miR-320a-3p標準品由本實驗室前期委托寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司合成并于-80℃冰箱中儲存［18-19］。

Table 1 Sequences of miR-451a and miR-21-5p themselves and their primers/probes

1.2 方法

1.2.1RNA提取與定量

選用miRNeasy mini 試劑盒（Qiagen，德國）提取樣本的總RNA［20］， 震蕩離心后通過NanoDrop 2000c 分光光度計（Thermo Fisher，美國）測定其濃度并通過純度（A260/A280）判斷提取的RNA質(zhì)量。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄

選用TaqMan ? MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher，美國）進行復合逆轉(zhuǎn)錄實驗合成cDNA。15 μl 反應體系包括：10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 μl、MultiscribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μl）1.00 μl、RNase 抑制劑 （20 U/μl） 0.19 μl、 dNTP mix（100 mmol/L）0.15 μl、miR-451a-RT 與miR-21-5p-RT（1 μmol/L）各0.75 μl、無核酸酶水5.66 μl、樣本5 μl（總RNA 含量為10 ng）。程序運行條件為：16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min。運行完成后置于4℃保存。將樣本替換為無核酸酶水，設(shè)置無模板陰性對照（no template control，NTC）。

1.2.3雙重qPCR反應體系的建立和優(yōu)化

對miR-451a和miR-21-5p的混合標準品（各含5 ng）進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，接著使用QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR 儀運行該實時熒光定量PCR反應，反應體系包括：TaqManTMUniversal Master Mix ⅠⅠ（no UNG）5 μl、miR-451a 正反向引物各0.4 μl（終濃度均為400 nmol/L）、miR-21-5p 正反向引物各0.4 μl（終濃度均為400 nmol/L）、miR-451a-P 與miR-21-5p-P 各0.3 μl （終濃度均為300 nmol/L）、cDNA 模板0.67 μl、無核酸酶水2.13 μl。擴增反應程序為：50℃ 2min，95℃10 min；95℃ 15 s，57℃ 1 min，72℃ 30 s，循環(huán)40次。

在保證以上雙重實時熒光定量PCR 反應體系中其他條件不變的情況下重點優(yōu)化引物終濃度（100、200、300、400、500 nmol/L）和探針終濃度（100、200、300、400 nmol/L），并設(shè)置陰性對照組（將cDNA替換為NTC組產(chǎn)物）。以上所有檢測均重復3次，盡可能減少操作誤差。

1.2.4構(gòu)建標準曲線

使用miR-451a和miR-21-5p的混合標準品（各含5 ng）先進行8 個梯度的5 倍連續(xù)稀釋，再繼續(xù)后續(xù)的雙重實時熒光定量PCR 擴增實驗，最終根據(jù)中間6 個梯度的實驗數(shù)據(jù)制作miRNA 定量循環(huán)（quantification cycle，Cq）均值和起始拷貝數(shù)對數(shù)值（lg（copies/μl））間的標準曲線（所有梯度均重復3 次實驗），其中各梯度下標準品起始拷貝數(shù)根據(jù)公式Copies/μl=NA×C/MW計算得到。NA是阿伏伽德羅常數(shù)，計算時取6.02×1023；C為標準品稀釋后的濃度（g/μl）；MW為分子質(zhì)量（g/mol）。

1.2.5驗證擴增效率

對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用無核酸酶水進行連續(xù)5倍梯度稀釋進行后續(xù)雙重擴增實驗并制作qPCR擴增效率曲線（所有梯度均重復3 次實驗），并根據(jù)公式E=（101/k-1）×100%計算各自的擴增效率。E代表效率（efficiency），k是斜率。

1.2.6特異性分析

分別以miR-891a-5p、miR-144-5p、miR-203a-3p、miR-320a-3p 標記的標準品作為反應模板，miR-451a和miR-21-5p標準品作為陽性對照，無核酸酶水作為陰性對照進行雙重實時熒光定量PCR檢測，檢驗其特異性。

1.2.7重復性分析

選取用于建立標準曲線的6個梯度濃度混合標準品為陽性模板，以無核酸酶水為陰性對照模板，進行同一批次和不同批次的雙重實時熒光定量PCR 擴增（均重復3 次實驗），計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.2.8樣本數(shù)據(jù)處理

對40份血液樣本和18份非血液樣本進行miR-451a 和miR-21-5p 的雙重實時熒光定量PCR 檢測，實驗數(shù)據(jù)通過QuantStudio Real-Time PCR系統(tǒng)配套軟件收集。使用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U 檢驗）進行外周血與月經(jīng)血、血與非血的差異性的分析，P<0.05 說明兩者差異具有統(tǒng)計學意義。同時通過受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線的曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve，AUC）評估該檢測體系的體液鑒別能力以及確定最佳截斷值。

1.2.9靈敏度檢測

取15 份樣本（PB、MB、SA、SE、VA 各3份），對其從10 ng 開始進行10 倍梯度稀釋（10、1、0.1、0.01、0.001 ng）來進行后續(xù)靈敏度檢測。目的是確定在miR-451a/miR-21-5p 拷貝數(shù)之比（451/21Ratio）結(jié)果符合判別標準的前提下雙重qPCR檢測體系在每種體液中的檢測極限。

1.2.10準確性驗證

隨機選擇20 份血樣（PB 和MB 各10 份），分別使用單重和雙重檢測體系進行miR-451a 和miR-21-5p的檢測，并對451/21Ratio進行比較。

1.2.11模擬案件樣本檢測

為進一步驗證雙重實時熒光定量PCR 檢測體系的實際應用能力，分別制備PB 與MB 模擬案件樣本各3份（吸取50 μl PB制成血卡，剪取2 cm2的帶血衛(wèi)生棉），并將其放置在室外自然條件下1、4、8 d 后提取RNA，然后按照優(yōu)化好的雙重體系進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 雙重qPCR反應體系優(yōu)化

通過對雙重實時熒光定量PCR 反應體系中的引物探針濃度的重點優(yōu)化，最終確定了適用于檢測miR-451a和miR-21-5p的雙重實時熒光定量PCR反應體系（表2）。

Table 2 Components of duplex real time fluorogenic quantitative PCR assay system

擴增反應程序為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；40 次熱循環(huán)（95℃ 15 s，57℃ 1 min，72℃ 30 s）。同時，在該反應條件下陰性對照組沒有出現(xiàn)擴增曲線。

2.2 建立標準曲線

miR-451a與miR-21-5p的標準曲線計算公式分別為y=-4.869x+63.73 和y=-4.719x+61.14，R2均超過0.99（圖1a，b）。兩條標準曲線均具有良好且較大的線性動態(tài)范圍。

Fig. 1 Standard curve of duplex real time fluorogenic quantitative PCR assay

2.3 驗證擴增效率

對稀釋好的標準品產(chǎn)物進行優(yōu)化好的雙重qPCR 反應并制作miR-451a 與miR-21-5p 的擴增效率曲線（圖2a，b）。兩曲線的擴增效率分別為71.77%和74.81%，且R2均達到了0.998。

Fig. 2 Amplification efficiency diagram of duplex real time fluorogenic quantitative PCR assay

2.4 特異性分析

使用優(yōu)化好的雙重實時熒光定量PCR 檢測體系對miR-451a、miR-21-5p、miR-891a-5p、miR-144-5p、miR-203a-3p、miR-320a-3p 標記的標準品進行特異性檢測，結(jié)果顯示只有miR-451a 和miR-21-5p 兩標記出現(xiàn)擴增曲線，其余標記和陰性對照沒有出現(xiàn)擴增，說明該雙重檢測體系具有良好的特異性（圖3）。

2.5 重復性驗證

使用已經(jīng)優(yōu)化的雙重實時熒光定量PCR 方法對選取的各濃度梯度混合標準品進行批內(nèi)和批間重復實驗。結(jié)果顯示兩組實驗變異系數(shù)均在8%以下，說明實驗結(jié)果可重復性高［21-22］，所建立的雙重實時熒光定量PCR 方法具有良好的重復性（表3）。

2.6 樣本鑒別能力分析

將451/21 Ratio定義為成miR-451a和miR-21-5p的拷貝數(shù)之比，其中miR-451a和miR-21-5p的含量可分別通過其標準曲線得到［10］，451/21 Ratio計算公式如下所示：

Fig. 3 Specificity test results of duplex real time fluorogenic quantitative PCR assay

Table 3 Repeatability test results

對提取的58份樣本進行miR-451a與miR-21-5p的雙重擴增并對得到的數(shù)據(jù)進行比值計算以評估其應用效果。其中40份血液樣本與18份非血液樣本的451/21 Ratio 比較結(jié)果顯示血液樣本的比值顯著大于非血液樣本，且兩者具有顯著性差異（P<0.000 1）（圖4a）。20 份月經(jīng)血樣本與20 份外周血樣本的451/21 Ratio 比較結(jié)果顯示外周血樣本比值整體大于月經(jīng)血樣本的比值，兩者同樣具有顯著性差異（P<0.000 1）（圖4b）。

對實驗數(shù)據(jù)進行ROC 分析，血與非血、月經(jīng)血與外周血的ROC 曲線的AUC均為1。這表明基于miRNA 雙重實時熒光定量PCR 檢測體系得到的數(shù)據(jù)在采用該鑒別方法后對血與非血、月經(jīng)血與外周血同樣有100%的鑒別效果（圖5a，b）。同時，血與非血、月經(jīng)血與外周血的最佳截斷值分別為2.989 和16.240，即該雙重實時熒光定量PCR 檢測體系的體液判別標準如下所示：當0<451/21 Ratio<2.989時，判別為非血液樣本，2.989<451/21 Ratio<16.24 時，判別為月經(jīng)血，當16.24<451/21 Ratio時，判別為外周血。

Fig. 4 Sample detection results

2.7 靈敏度檢測

由于該實驗為同時檢測兩個標記，所以檢材不僅需要滿足該樣本類型下靈敏度偏低的單個標記所需的總RNA用量，同時451/21 Ratio結(jié)果還需要符合該雙重實時熒光定量PCR 檢測體系的判別標準（表4），即外周血和月經(jīng)血至少需要0.1 ng 總RNA，唾液、精液和陰道分泌液至少需要1 ng 總RNA。

Table 4 The sensitivity of miR-451a，miR-21-5p and 451/21 Ratio in 5 body fluid

2.8 準確性驗證

對經(jīng)過雙重和單重檢測的20 個血液樣本的451/21 Ratio結(jié)果進行配對t檢驗，兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表5），說明該雙重實時熒光定量PCR 檢測體系所得結(jié)果與單重檢測的結(jié)果準確性一致。

2.9 模擬案件樣本檢測

對模擬放置在室外自然條件下1、4、8 d 的血液樣本進行雙重實時熒光定量PCR 檢測（表6）。結(jié)果顯示3個時間梯度下的模擬樣本均能夠根據(jù)該體系的判別標準進行體液的準確判別，表明該雙重檢測體系具有應用于法醫(yī)實踐的潛力。

Table 5 451/21 Ratio detection results in different systems

Table 6 451/21 Ratio detection results of simulated samples under different placement times

3 討論

近年來伴隨分子生物學的快速發(fā)展，實時熒光定量PCR 已經(jīng)逐漸成為核酸定量檢測中至關(guān)重要的技術(shù)。傳統(tǒng)意義上的多重實時熒光定量PCR 技術(shù)是在同一反應體系內(nèi)使用多組特異性引物和探針，并利用多熒光通道的實時熒光定量PCR 儀同時檢測兩個或兩個以上分子標記。多重實時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)和應用顯著的降低了實驗成本，并大大提高檢測效率。相較于單重實時熒光定量PCR 擴增，多重實時熒光定量PCR 技術(shù)面臨的最大挑戰(zhàn)是避免多組引物之間形成二聚體或探針錯配，從而導致非特異性擴增、擴增效率降低、檢測靈敏度和特異性下降。為解決此問題，一方面需優(yōu)化各引物序列以減少二聚體的形成，另一方面需優(yōu)化反應體系中各組分的用量及反應條件，以盡可能提高擴增效率并保持一致性。

盡管在長鏈RNA或DNA分子上多重實時熒光定量PCR 技術(shù)已經(jīng)有了較多應用［23-25］，但是目前國內(nèi)外有關(guān)miRNA 的多重實時熒光定量PCR 檢測方法卻較為稀少［26］。犯罪現(xiàn)場所遺留的體液斑跡往往是微量的，借助實時熒光定量PCR 技術(shù)進行體液鑒別往往需要對檢材中多個特異性miRNA 標記以及內(nèi)參基因進行檢測分析。多重實時熒光定量PCR 技術(shù)能夠有效解決傳統(tǒng)單重實時熒光定量PCR 同時定量多種miRNA 時檢材不足和消耗成倍試劑的問題，實現(xiàn)等量檢材和試劑對多個標記進行檢測，在法醫(yī)學方向的應用前景十分廣闊。本實驗室前期利用SYBR Green 染料法和單重TaqMan 探針法開創(chuàng)性的建立了一種基于兩種miRNAs表達量比值的月經(jīng)血與外周血鑒別方法［10-11］。為進一步探索miRNA 多重實時熒光定量PCR 擴增的適用性以及優(yōu)化該實驗方法，本文在之前的基礎(chǔ)上建立了一種miRNA 雙重實時熒光定量PCR 檢測體系。本研究首先根據(jù)miR-451a和miR-21-5p的序列特點及相關(guān)設(shè)計原則自主設(shè)計了更適合于雙重實時熒光定量PCR 的引物以及探針。隨后重點對引物和探針濃度進行了優(yōu)化，優(yōu)化首先要保證陰性對照無擴增，同時在該條件下熒光曲線擁有良好的擴增效果以及較低的Cq值。在出現(xiàn)熒光強度和Cq值接近的條件時，優(yōu)先考慮低濃度條件，這樣一方面是節(jié)省耗材，一方面也能將雙重擴增中引物探針間可能存在的競爭抑制和相互干擾降到最低。優(yōu)化完成的雙重檢測體系具有較強的特異性和可重復性，檢測得到的樣本數(shù)據(jù)與單重檢測體系之間沒有顯著性差異。從鑒別能力來看，該雙重檢測體系依舊能夠?qū)崿F(xiàn)對血液與非血液、月經(jīng)血與外周血樣本的100%正確區(qū)分，且雙重檢測體系用于區(qū)分外周血與月經(jīng)血的最佳截斷值16.24與單重檢測體系的16.57基本一致［11］，同時其靈敏度相較于前期的單重體系也提高了一倍［10］。除此之外，本文還模擬了在室外自然條件下不同放置時間的血液檢材，結(jié)果顯示18 個樣本均能夠精確鑒別，進一步驗證了該檢測體系的鑒別能力和應用潛力。

4 結(jié)論

本文成功建立了miRNA 雙重實時熒光定量PCR 檢測體系。使用該體系對樣本進行檢測時，相同樣本所需的實驗時間以及實驗耗材縮減至原來的一半，這使得樣本的檢測既快速又節(jié)省，實現(xiàn)了實驗效率與經(jīng)濟性的雙重提升，為法醫(yī)體液鑒別提供了一種更高效、可靠的工具，也為后續(xù)建立更多重的qPCR檢測體系并應用于法醫(yī)體液分析打下了基礎(chǔ)。