王道宇 萬 群 莊 斌 趙麗健 韓俊萍 李彩霞

（1）中國(guó)人民公安大學(xué)偵查學(xué)院，北京 100038；2）山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250000；3）北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，北京 101111；4）北京市公安局朝陽分局刑事偵查支隊(duì)，北京 100025；5）公安部鑒定中心，現(xiàn)場(chǎng)物證溯源技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京市現(xiàn)場(chǎng)物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，北京 100038）

Y染色體作為男性所特有的染色體，其95%的區(qū)域?yàn)榉侵亟M區(qū)（non-recombining，NRY），該區(qū)域在減數(shù)分裂時(shí)不能與X染色體發(fā)生交換重組［1］。除發(fā)生突變外，該區(qū)域可完整從父親遺傳至兒子。由于Y染色體遺傳特殊性，其在與男性相關(guān)的法醫(yī)鑒定中具有重要作用，如性侵案件中男女混合斑鑒定［2-3］、父系親緣關(guān)系鑒定［4］、大規(guī)模災(zāi)難受害者身份識(shí)別［5］、家系排查［6］、族源推斷［7］等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。法醫(yī)學(xué)常用的Y染色體遺傳標(biāo)記為Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（Y-chromosomal short tandem repeat，Y-STR），但是目前其檢測(cè)方法主要依賴傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室DNA 檢測(cè)技術(shù)，包括DNA 提取-定量、PCR 擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳檢測(cè)，整個(gè)過程耗時(shí)耗力，且需要專業(yè)人員在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室操作。近年來，基于微流控芯片技術(shù)［8-10］的DNA 快速檢測(cè)儀因具有全自動(dòng)、高度集成、車載便捷的性能而快速發(fā)展并相繼上市銷售，如RapidHⅠTTM200、RapidHⅠT?ⅠD、ANDETM6C 等，學(xué)界對(duì)上述儀器及配套試劑開展了大量驗(yàn)證評(píng)估［11-14］。上述國(guó)外DNA 快檢儀配套試劑均為常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）個(gè)體識(shí)別試劑［15-18］，尚未出現(xiàn)集成Y-STR 試劑的芯片卡盒。本項(xiàng)目組前期研發(fā)出國(guó)產(chǎn)Quick TargSeq 法醫(yī)DNA 快速檢測(cè)儀，配套了常染色體STR 個(gè)體識(shí)別［19］和插入缺失多態(tài)性（insertion/deletion polymorphism，DⅠP）［20-21］族群推斷兩類試劑。Y-STR父系家系排查是目前案件偵查常用手段，為實(shí)現(xiàn)Y-STR的快速全集成檢測(cè)，本研究構(gòu)建了Y-STR微流控芯片檢測(cè)試劑，并根據(jù)DNA 分析方法科學(xué)工作組（SWGDAM）［22］指南對(duì)其靈敏度、抗抑制性、成功率和分型準(zhǔn)確率、峰高平衡性、精準(zhǔn)度和準(zhǔn)確度、混合物檢測(cè)、檢材適應(yīng)性等性能進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估，以期為實(shí)踐應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

本研究實(shí)驗(yàn)樣本包括血卡、口腔拭子、唾液卡、煙蒂、血棉簽和布片精斑等樣本。131份血卡樣本來源于國(guó)家科技資源共享服務(wù)平臺(tái)計(jì)劃項(xiàng)目（YCZYPT［2017］01-3），已通過公安部物證鑒定中心倫理委員會(huì)的倫理審查（編號(hào)：2017-005）；54份口腔拭子樣本、1份唾液卡、2份煙蒂、1份血棉簽和1份布片精斑取自實(shí)驗(yàn)室人員；人類基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948 購(gòu)自蘇州新海生物科技股份有限公司，人類基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品2800M 購(gòu)自Promega公司。

1.2 樣本采集

54 份口腔拭子樣本采集時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員漱口后使用采樣拭子在口腔內(nèi)壁左右刮擦，陰干備用；1份唾液卡樣本采集時(shí)，取實(shí)驗(yàn)人員兩頰黏膜擦拭物轉(zhuǎn)移至唾液卡上，陰干備用［21］。

1.3 DNA提取與定量

使 用 QⅠAamp?DNA Mini M48 試 劑 盒（QⅠAGEN公司，德國(guó)）提取煙蒂DNA，用于檢材適應(yīng)性研究。將人類基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948（初始濃度10 mg/L）進(jìn)行梯度稀釋，使用QuantifilerTM人類DNA定量試劑盒（Life Technologies公司，美國(guó)）進(jìn)行定量，用于靈敏度驗(yàn)證。

1.4 Quick TargSeq法醫(yī)DNA快速檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)

Quick TargSeq 法醫(yī)DNA 快速檢測(cè)系統(tǒng)的全集成芯片卡盒由DNA提取-擴(kuò)增芯片和毛細(xì)管電泳芯片組成。凍干試劑、電泳緩沖液和電泳凝膠均已預(yù)置于芯片卡盒內(nèi)。全集成檢測(cè)時(shí)，在1.5 ml EP 管中加入200 μl直擴(kuò)處理液（含80 μl直擴(kuò)處理液Ⅰ和120 μl 直擴(kuò)處理液ⅠⅠ，蘇州新海生物科技股份有限公司），放入1 根口腔拭子或血卡/唾液卡3 片（φ=2 mm），然后取60 μl 上述混合液（提取的DNA 樣本或DNA標(biāo)準(zhǔn)品加去離子水定容至60 μl）加樣至芯片樣本處理池，全集成芯片卡盒放入快檢系統(tǒng)進(jìn)樣倉(cāng)，點(diǎn)擊運(yùn)行鍵，儀器自動(dòng)完成樣本裂解、PCR擴(kuò)增、電泳分離全過程。詳細(xì)操作步驟參見文獻(xiàn)［21］。

1.5 靈敏度研究

利用人類基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948，口腔拭子和血卡三種樣本類型進(jìn)行靈敏度測(cè)試。使用去離子水將DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948 進(jìn)行如下稀釋：50、30、16、8、5、2.5、1.5 ng；采集3 名實(shí)驗(yàn)室人員口腔拭子，使用取樣拭子在測(cè)試人員口腔內(nèi)壁左右刮取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 次，不同次數(shù)采集時(shí)間隔3 h；選取3份血卡，利用直徑2 mm打孔器在待測(cè)血卡上采集1、2、3、4、5、6、7、8片。使用全集成芯片卡盒測(cè)試，上述每種DNA 含量、取樣方式均重復(fù)測(cè)試3次。

1.6 成功率和分型準(zhǔn)確率研究

對(duì)115 份血卡和50 份口腔拭子進(jìn)行全集成檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)成功率和分型準(zhǔn)確率。以常規(guī)PCR-CE平臺(tái)分型結(jié)果作為參考樣本分型。成功率是指基因座全部檢出的樣本占全部測(cè)試樣本的比率；分型準(zhǔn)確率是指分型成功的結(jié)果，軟件準(zhǔn)確分型的等位基因占全部等位基因的比率［23］。

1.7 平衡性研究

選取1.5中全集成檢測(cè)成功的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因座的等位基因峰高值，評(píng)估同一熒光通道和不同熒光通道之間的平衡性，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)［24-25］。

1.8 精準(zhǔn)性和準(zhǔn)確性研究

將RTyper Y27 的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品（allelic ladder）在Quick TargSeq 快檢儀上重復(fù)電泳10 次，計(jì)算各等位基因片段大小的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以驗(yàn)證體系的精準(zhǔn)度（以堿基為單位）。隨機(jī)選取1.5中全集成檢測(cè)成功的20 份血卡樣本，計(jì)算各樣本的等位基因片段大小與相應(yīng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的差異。選取使用同一批次凍干擴(kuò)增試劑在同一儀器上檢測(cè)的6份同一人員口腔拭子樣本，計(jì)算各樣本的等位基因片段大小均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV）值［26］，以驗(yàn)證體系的批內(nèi)精密度。選取使用不同批次（3 個(gè)批次，每個(gè)批次2 份樣本）凍干擴(kuò)增試劑在同一儀器上檢測(cè)的6份同一人員口腔拭子樣本，計(jì)算各樣本的等位基因片段大小均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV值，以驗(yàn)證體系的批間精密度。

1.9 檢材適應(yīng)性研究

選取口腔拭子、血卡、唾液卡、煙蒂、血棉簽和布片精斑（其中煙蒂樣本采取先提取DNA 后檢測(cè)和直接擴(kuò)增檢測(cè)兩種方式，其余檢材采取直接擴(kuò)增檢測(cè)方式）等法醫(yī)常見檢材進(jìn)行全集成檢測(cè)，驗(yàn)證該體系的檢材適應(yīng)性。

1.10 混合物檢測(cè)研究

采用DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948和2800M，按照19∶1、9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶9、1∶19比例進(jìn)行全集成檢測(cè)，以驗(yàn)證該體系對(duì)混合物的檢測(cè)性能。

1.11 抗抑制性研究

選取3種常見的PCR抑制劑（腐殖酸、靛藍(lán)和血紅蛋白）驗(yàn)證該體系的抗抑制能力。配置不同濃度的抑制劑，使腐殖酸的終濃度為400、300、200、100、50 mg/L，靛藍(lán)的終濃度為100、80、60、40、20 nmol/L，血紅蛋白的終濃度為500、400、300、200、100 μmol/L，分別進(jìn)行全集成檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Y-STR基因座選擇和微流控芯片擴(kuò)增體系構(gòu)建

本研究選取27 個(gè)Y-STRs 基因座，其中包含《全國(guó)刑偵信息專業(yè)應(yīng)用系統(tǒng)Y-STR DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)與管理指南》 規(guī)定的20 個(gè)核心基因座（GB/T41009-2021），DYS19、DYS385a、DYS385b、DYS389Ⅰ、 DYS389ⅠⅠ、 DYS390、 DYS391、DYS392、 DYS393、 DYS437、 DYS438、DYS439、 DYS448、 DYS456、 DYS458、DYS481、 DYS533、 DYS576、 DYS635、Y-GATA-H4，和該指南推薦的15 個(gè)優(yōu)選基因座中選取7 個(gè)單倍型多態(tài)性好、個(gè)體識(shí)別能力強(qiáng)的Y-STR 基因座， DYF387S1a、 DYF387S1b、DYS449、 DYS460、 DYS518、 DYS627、DYS570。上述基因座與進(jìn)口Y-STR試劑盒兼容。

通過對(duì)引物濃度配比、輔料配比、凍干條件等優(yōu)化，確定了2.5×PCR Mix和5×Primer Mix分別與凍干輔料按照1∶1體積比混合，按照每12 μl點(diǎn)樣凍干，采用-50℃ 5 min、-45℃ 240 min、-35℃360 min、-25℃ 240 min、20℃ 360 min 凍干程序獲得的凍干小球狀態(tài)最佳。通過PCR 熱循環(huán)參數(shù)優(yōu)化確定的最佳PCR 擴(kuò)增條件為：95℃ 1 min；95℃ 10 s，59℃ 1 min，2℃ 20 s，共28 個(gè)循環(huán)；60℃ 10 min。綜上，最終構(gòu)建了一套R(shí)Typer Y27微流控芯片檢測(cè)體系，能夠獲得完整而準(zhǔn)確Y-STR分型結(jié)果（圖1），全集成檢測(cè)時(shí)間約為83 min。

Fig. 1 DNA standard 9948 profile obtained from the RTyper Y27 microfluidic chip rapid detection system

2.2 靈敏度

使用1.5~50 ng DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948進(jìn)行靈敏度測(cè)試，統(tǒng)計(jì)不同DNA 模板量全集成檢測(cè)結(jié)果的等位基因峰高值和等位基因檢出率［21］（圖2）。結(jié)果顯示，等位基因峰高值隨著DNA模板量增加而增大。當(dāng)DNA模板量為1.5、2.5、5 ng時(shí)，出現(xiàn)不同程度等位基因丟失；當(dāng)模板量≥8 ng 時(shí)，可以獲得完整Y-STR 分型結(jié)果，等位基因檢出率達(dá)到100%。因此，本體系對(duì)于DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948的最低檢測(cè)限為8 ng。

Fig. 2 Sensitivity study for different input DNA template

使用1~10次擦拭的口腔拭子進(jìn)行全集成測(cè)試，統(tǒng)計(jì)不同擦拭次數(shù)口腔拭子的等位基因峰高值和等位基因檢出率（圖3）。結(jié)果顯示，隨著擦拭次數(shù)的增加，等位基因峰高值和檢出率均逐漸增加。擦拭次數(shù)為1~7次時(shí)，等位基因峰高值較低，等位基因檢出率從63.42%增加到100%，擦拭次數(shù)≥7 次時(shí)，等位基因檢出率均為100%。故口腔拭子的最低擦拭次數(shù)為7次。

Fig. 3 Sensitivity study for different wipes of buccal swabs

使用1~8片血卡進(jìn)行靈敏度測(cè)試，統(tǒng)計(jì)不同血卡片數(shù)全集成結(jié)果的等位基因峰高值和等位基因檢出率（圖4）。結(jié)果顯示，等位基因峰高值隨著血卡片數(shù)的增加而增加，血卡片數(shù)為1 和2 片時(shí)，均出現(xiàn)不同程度等位基因丟失，等位基因檢出率分別為86.83%和90.94%。血卡片數(shù)≥3片時(shí)，等位基因檢出率可達(dá)100%。故本體系對(duì)血卡的最低檢測(cè)片數(shù)為3片。

Fig. 4 Sensitivity study for different pieces of dried blood spot samples

2.3 成功率和分型準(zhǔn)確率

對(duì)115 份血卡和50 份口腔拭子進(jìn)行全集成檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)成功率和分型準(zhǔn)確率（表1）。165份樣本中6份樣本未獲得成功分型，151份樣本分型成功。其中104份血卡分型成功，成功率達(dá)90.43%，分型準(zhǔn)確率為99.65%，47 份口腔拭子分型成功，成功率為94.00%，分型準(zhǔn)確率為99.92%。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)血卡和口腔拭子兩種類型樣本的分型準(zhǔn)確率之間是否存在差異性。結(jié)果表明，兩者之間未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

Table 1 The result of success rate and concordance rate

Table 2 The effect of different sample types (blood card /oral swab) on concordance rate

2.4 平衡性

利用2.2中分型成功的70份樣本進(jìn)行熒光通道平衡性分析（表3）。紅色熒光通道（ROX 染料標(biāo)記）峰高比值最高，為91.15%，黃色熒光通道（TAMRA 染料標(biāo)記）次之，為86.25%，其余兩個(gè)熒光通道峰高比值分別為74.85%、70.81%，不同熒光通道之間的峰高比值為89.81%。以上結(jié)果表明該體系有較好的平衡性。

Table 3 Balance within one dye and among different dyes for 151 testing samples

2.5 精準(zhǔn)度和準(zhǔn)確度

對(duì)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10次全集成檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)其各等位基因片段大小的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（圖5）。結(jié)果表明，各等位基因片段大小的標(biāo)準(zhǔn)差均在0.5 bp 以內(nèi)。隨機(jī)選取2.2中分型成功的20 份血卡全集成結(jié)果（圖6）。計(jì)算所有等位基因片段與等位基因標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的片段大小差異均不超過0.5 bp。批內(nèi)精密度和批間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表4），批內(nèi)和批間精密度實(shí)驗(yàn)中等位基因DYS460的CV值最大，分別為0.48%和0.68%，均小于15%。以上結(jié)果表明，該體系有較高的精準(zhǔn)度和準(zhǔn)確度。

Fig. 5 Standard deviation of sizing precision for each locus in the allelic ladder calculated for 10 runs on Quick TargSeq systems

Fig. 6 Size differences between allele and corresponding allele in allelic ladder for 20 testing samples on Quick TargSeq systems

Table 4 The precision of intra and inter batch

2.6 檢材適應(yīng)性

對(duì)口腔拭子、血卡、唾液卡、煙蒂（包括使用提取DNA檢測(cè)和直接樣本檢測(cè)兩種方式）、血棉簽和布片精斑等法醫(yī)常見檢材進(jìn)行全集成檢測(cè)（圖7）。結(jié)果表明，除直接擴(kuò)增的煙蒂檢材DYS481基因座出現(xiàn)等位基因丟失（圖中紅框所示），其余檢材均獲得完整Y-STR分型，說明該體系檢材適應(yīng)性良好。

2.7 混合樣本檢測(cè)性能

將DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948 和2800M 按照19∶1、9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶9、1∶19 比例進(jìn)行全集成檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)次要貢獻(xiàn)者的等位基因峰高值和等位基因檢出率，以驗(yàn)證該體系對(duì)混合樣本的檢測(cè)性能（圖8）。當(dāng)9948∶2800M 為19∶1 和1∶19時(shí)，出現(xiàn)不同程度等位基因丟失，次要貢獻(xiàn)者的等位基因檢出率分別為66.67%和67.61%，且等位基因峰值較低，9948∶2800M 為9∶1 和1∶9 時(shí)，次要貢獻(xiàn)者的等位基因檢出率為97.53%和98.76%，而當(dāng)9948 和2800M 的比例為3∶1、1∶1 和1∶3時(shí)，能夠檢測(cè)出所有次要貢獻(xiàn)者的等位基因（檢出率均為100%）。

Fig. 7 The Y-STR profiles of mock case samples

Fig. 8 Mixture study for different ratio of 9948：2800M

2.8 抗抑制性

對(duì)3種常見的PCR抑制劑（腐殖酸、靛藍(lán)和血紅蛋白）進(jìn)行全集成檢測(cè)，以驗(yàn)證該體系的抗抑制性（表5）。結(jié)果表明，該反應(yīng)體系中分別添加濃度為50~400 mg/L 的腐殖酸、20~100 nmol/L 的靛藍(lán)、100 ~500 μmol/L 的血紅蛋白時(shí)，仍能獲得完整分型結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失。

Table 5 The detection results of samples with different inhibitor concentrations

3 討論

Y-STR遺傳標(biāo)記在與男性相關(guān)的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中作用獨(dú)特［27］，傳統(tǒng)Y-STR 檢測(cè)流程復(fù)雜，耗時(shí)耗力，目前尚未見有報(bào)道將Y-STR 基因座應(yīng)用于DNA 快速檢驗(yàn)系統(tǒng)，本研究率先構(gòu)建了Y-STR 微流控芯片檢測(cè)試劑體系，經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)現(xiàn)了法醫(yī)DNA 快檢儀的集成應(yīng)用。本研究參考SWGDAM指南，對(duì)構(gòu)建的RTyper Y27微流控芯片檢測(cè)體系進(jìn)行了性能驗(yàn)證研究。

靈敏度研究中，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948 達(dá)到8 ng 時(shí)能檢測(cè)出完整Y-STR 分型，對(duì)比PowerPlex?Y23、Yfiler?Plus PCR 等Y-STR 試劑盒［25，28］常規(guī)PCRCE 檢測(cè)平臺(tái)略有不足，但滿足大多數(shù)現(xiàn)場(chǎng)生物檢材檢測(cè)限的需求［12］?？谇皇米庸尾链螖?shù)為7 次和血卡片數(shù)3 片時(shí)（φ=2 mm），等位基因檢出率為100%，與Quick TargSeq 快檢儀DⅠP 族群推斷體系的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)［21］，同時(shí)口腔拭子擦拭次數(shù)靈敏度與RapidHⅠT?ⅠD 快檢儀（擦拭次數(shù)8 次時(shí)，等位基因檢出率為100%）相近［29］。在165 份樣本的成功率和分型準(zhǔn)確率研究中：成功率達(dá)到91.52%，低于ANDETM6C （99.2%［30］） 的成功率、高于RapidHⅠTTM200（85.45%［31］）快檢儀的首次成功率，與RapidHⅠT?ⅠD（92%［29］）相近；分型準(zhǔn)確率可達(dá)99.74%，與ANDETM6C（99.98%［30］）和RapidHⅠTTM200（100%［31］）的分型準(zhǔn)確率相當(dāng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血卡和口腔拭子準(zhǔn)確分型。準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度的等位基因片段大小誤差均在0.5 bp以內(nèi)，批內(nèi)批間精密度CV最大值分別為0.48%和0.68%，均小于15%［32］，表明體系能夠精確并準(zhǔn)確的對(duì)樣本進(jìn)行分型?；旌蠘颖緳z測(cè)中較小貢獻(xiàn)者在1∶3比例下能獲得完整等位基因分型，與RapidHⅠT?ⅠD快檢儀對(duì)混合物檢測(cè)能力相近［29］，與常規(guī)PCR-CE 平臺(tái)使用的DNATyperTMY26（1∶3）［33］、Microreader 40Y ⅠD（1∶3）［34］等Y-STR 試劑盒對(duì)混合樣本檢測(cè)能力亦相當(dāng)。該體系可對(duì)常見口腔拭子、血卡、唾液卡、精斑等檢材完整分型，但直接處理煙蒂樣本出現(xiàn)等位基因丟失，推測(cè)原因可能是剪取的煙蒂過濾嘴處含有口腔上皮細(xì)胞少［35］，DNA 含量低，導(dǎo)致全集成檢測(cè)結(jié)果分型不完整。同時(shí)該體系對(duì)腐殖酸、靛藍(lán)和血紅蛋白等常見PCR抑制劑耐受性較好，與PowerPlex?Y23等試劑盒常規(guī)PCR-CE平臺(tái)的耐受力相當(dāng)［28，36］。

4 結(jié)論

本研究將RTyper Y27 微流控芯片快速檢測(cè)體系與國(guó)產(chǎn)Quick TargSeq 快檢儀結(jié)合，2 h 左右可獲得樣本Y-STR 準(zhǔn)確分型，一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該體系重復(fù)性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好，能滿足現(xiàn)場(chǎng)Y-STR檢測(cè)要求，可供法醫(yī)學(xué)實(shí)踐選擇使用。