葛曉雪 蔣銳達(dá) 王曉燕 高 晶 高潤(rùn)池

（1）云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2）云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明 650500；3）生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心，昆明 650500）

細(xì)胞定向遷移是多細(xì)胞有機(jī)體完成正常生命活動(dòng)的前提和基礎(chǔ)，也是發(fā)生機(jī)體病變的一個(gè)重要因素。環(huán)境中的許多信號(hào)都會(huì)影響細(xì)胞的遷移方向，如化學(xué)因子指導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生的趨化性運(yùn)動(dòng)、生物電信號(hào)指導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生的趨電性運(yùn)動(dòng)等。目前，人們對(duì)細(xì)胞響應(yīng)胞外化學(xué)因子而發(fā)生定向遷移的分子機(jī)制研究的比較透徹，而對(duì)細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境中生物電場(chǎng)的分子機(jī)制則并不十分清楚。

在細(xì)胞的趨化性機(jī)制研究中，人們利用模式生物盤(pán)基網(wǎng)柄菌（Dicyostelium discoideum）證實(shí)了磷脂酰肌醇3 激酶（PⅠ3Ks）的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，盤(pán)基網(wǎng)柄菌中的PⅠ3K1 和PⅠ3K2 都具有Ras 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且都是趨化試劑刺激PⅠ3K 活化所必須的［1］。在趨化試劑刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞中的Ras在前端被快速地激活（最高值在3~4 s 出現(xiàn)）［2］，當(dāng)Ras功能被阻止時(shí)，細(xì)胞不能發(fā)生極化，也不能感知環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)，只發(fā)生隨機(jī)運(yùn)動(dòng)。此外，PⅠ3Ks的趨化性功能依賴(lài)于趨化因子的濃度和盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的發(fā)育階段，可以說(shuō)PⅠ3Ks作為一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞“羅盤(pán)”的組成部分，通過(guò)綜合功能控制細(xì)胞的方向反應(yīng)［3］。然而，研究者在利用PⅠ3K 突變株作為研究對(duì)象探討趨化性機(jī)制的過(guò)程中，也曾觀察到一些相矛盾的現(xiàn)象。例如：Buczynski 等［4］研究表明，PⅠ3K1 和PⅠ3K2 敲除的細(xì)胞株具有更快的趨化性，他們猜測(cè)，這個(gè)表型可能是由于pi3kA/B-細(xì)胞的骨架發(fā)生改變引起，也可能是影響了調(diào)節(jié)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的Rho/Rac家族成員造成的；而Zhou 等［5］和Funamoto 等［6］則看到相反的現(xiàn)象，他們發(fā)現(xiàn)pi3kA/B-細(xì)胞的趨化性降低，速度也減弱。Loovers 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，pi3kA/B-突變株發(fā)育5 h 表現(xiàn)出極化降低并且產(chǎn)生側(cè)生偽足，但在其他發(fā)育條件下，該突變株具有與野生型細(xì)胞相同的行為。其他研究者利用LY294002 對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞的研究也獲得相互矛盾的結(jié)果［8］，其中，用LY294002 短暫地處理盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞不能有效地響應(yīng)趨化因子，也不發(fā)生定向遷移，然而處理5 min甚至更長(zhǎng)時(shí)間后，細(xì)胞發(fā)生極化并能夠向高濃度趨化因子遷移［6-7］，這些都暗示了PⅠ3Ks作用的復(fù)雜性。

細(xì)胞的趨電性也是近年來(lái)人們比較關(guān)注的細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)之一，它指的是細(xì)胞在直流電場(chǎng)中發(fā)生朝向電場(chǎng)正極或負(fù)極定向遷移的現(xiàn)象。許多類(lèi)型的細(xì)胞都能響應(yīng)直流電場(chǎng)，在電場(chǎng)中發(fā)生朝向陽(yáng)極或者陰極的定向運(yùn)動(dòng)，例如：成纖維細(xì)胞［9］、惡性大鼠前列腺癌細(xì)胞［10］、沃克癌肉瘤細(xì)胞［11］、骨髓干細(xì)胞［12］、盤(pán)基網(wǎng)柄菌單細(xì)胞［13］等在直流電場(chǎng)中朝向陰極運(yùn)動(dòng)；人類(lèi)粒細(xì)胞［14］、兔的角膜上皮細(xì)胞［15］、轉(zhuǎn)移程度低的大鼠前列腺癌細(xì)胞AT-2［10］、人的血管內(nèi)皮細(xì)胞［16］等朝向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)；有些細(xì)胞隨環(huán)境條件的變化，在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的方向會(huì)隨著改變，甚至腫瘤細(xì)胞還會(huì)隨惡性程度的增加，對(duì)電場(chǎng)的響應(yīng)也增強(qiáng)，甚至遷移方向完全相反。近年來(lái)，在探究細(xì)胞趨電性運(yùn)動(dòng)機(jī)制過(guò)程中，研究者們關(guān)注到PⅠ3K對(duì)細(xì)胞趨電性運(yùn)動(dòng)的一些作用。Zhao等［17］研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞缺乏PⅠ3Kγ的催化亞基p110的編碼基因后，細(xì)胞的趨電性較野生型細(xì)胞顯著降低；Meng 等［18］用PⅠ3K 的抑制劑處理胚胎和成年神經(jīng)前體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PⅠ3K 抑制劑處理后兩種細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的趨電性改變。Sato 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在盤(pán)基網(wǎng)柄菌中，可溶性的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（sGC）和GbpC的催化結(jié)構(gòu)域通過(guò)cGMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的朝向陰極的信號(hào)，而sGC的N端結(jié)構(gòu)域連同抑制PⅠ3K 以及cGMP 的產(chǎn)物調(diào)節(jié)著細(xì)胞朝向陽(yáng)極的信號(hào)。但由于PⅠ3Ks種類(lèi)和功能的復(fù)雜性，人們并不完全明確PⅠ3Ks與細(xì)胞趨電性中的作用機(jī)制。

在盤(pán)基網(wǎng)柄菌中，PⅠ3K1 和PⅠ3K2 都具有Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們都是細(xì)胞接收化學(xué)信號(hào)刺激后活化Ras 所必需的兩個(gè)關(guān)鍵PⅠ3Ks［1］。為了揭示PⅠ3Ks在細(xì)胞趨電性中的作用，本研究對(duì)盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞中的PⅠ3K1和PⅠ3K2在細(xì)胞響應(yīng)直流電場(chǎng)發(fā)生定向遷移中的作用進(jìn)行研究。首先通過(guò)CRⅠSPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)分別構(gòu)建PⅠ3K1 的編碼基因pikA和PⅠ3K2的編碼基因pikB的單基因敲除突變株，其次對(duì)突變株的趨電性及其機(jī)制進(jìn)行探討，研究結(jié)果表明，PⅠ3K1 和PⅠ3K2 在盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞趨電性中發(fā)揮抑制作用，并且可能通過(guò)增強(qiáng)Akt和ERK的活性來(lái)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：野生型盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞AX2；pikA-突變株；pikB-突變株；克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes，KA）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）。

質(zhì)粒：pTM1285（CRⅠSPR/Cas9 基因編輯載體，來(lái)自日本NBRP Nenkin（National BioResource Project Cellular slime molds）。

分子克隆酶制劑：BbsⅠ-HF （R3539L，BioLabs公司）；rTaq酶；T4 DNA連接酶（M0202S，BioLabs公司）。

抗體：P44/42 MAPK（ERK1/2） Rabbit mAb（HRP Conjugate）（CST）；Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2） （Thr202/Tyr204） （D13.14.4E） XP?Rabbit mAb（CST）；GADPH 抗體（Rabbit pAb，30202ES40，翌圣生物科技（上海）股份有限公司）；T-Akt （pan）（C67E7） Rabbit mAb #4691（CST） ； Phospho-Akt Substrate （RXXS*/T*）（110B7E） Rabbit mAb #9614 （CST） ；Anti-β-tubulin Antibody（BOSTER，A01857-1）。

分子試劑盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0 （TaKaRa 公司）；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 （TaKaRa 公司）；TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（TaKaRa公司）。

引物合成及測(cè)序：引物合成和測(cè)序均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

HL5培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，示蛋白胨10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鈉0.96 g，磷酸二氫鉀0.48 g，硫酸鏈霉素0.03 g，蒸餾水定容到至1 L，pH 6.5，121℃濕熱滅菌30 min。

H50 緩沖液：20 mmol/L HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸），pH 7.0；50 mmol/L氯化鉀，10 mmol/L氯化鈉，1mmol/L 硫酸鎂，5 mmol/L 碳酸氫鈉，1 mmol/L磷酸二氫鈉，過(guò)濾除菌。

發(fā)育緩沖液（DB）：先配制10×磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉12.695 g，磷酸二氫鉀6.803 g，水定容至1L）。使用時(shí)配制用蒸餾水稀釋至1×DB（100 ml 10×磷酸鹽緩沖液、1 mol/L 氯化鈣0.2 ml、2 mol/L硫酸鎂1 ml，水定容至1 L）。

Steinberg’s 溶液：氯化鈉 580 mmol/L，氯化鉀6.7 mmol/L， 硝酸鈣4.4 mmol/L， 硫酸鎂13 mmol/L，三羥甲基氨基甲烷46 mmol/L，水定容至1 L，pH 7.5~7.7，使用時(shí)用水稀釋10倍。

LB 培養(yǎng)基：示蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；必要時(shí)加入瓊脂粉15 g/L（固體）和/或終濃度為100 mg/L的氨芐青霉素鈉。

SM 培養(yǎng)基：示蛋白胨10 g/L，酵母粉1 g/L，葡萄糖10 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸氫二鉀1.9 g/L，磷酸二氫鉀0.6 g/L，瓊脂粉20 g/L （固體），pH 6.4，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1sgRNA設(shè)計(jì)、二聚化和磷酸化

從dictybase.org 上獲取盤(pán)基網(wǎng)柄菌pikA和pikB的基因序列（pikA： DDB_G0278727；pikB：DDB_G0274109），利用網(wǎng)站http://crispr.dbcls.jp/分別設(shè)計(jì)pikA和pikB的sgRNA（single-guide RNA），相關(guān)引物信息見(jiàn)表1。

用滅菌蒸餾水將合成的sgRNA 正向與反向引物稀釋至100 μmol/L，分別取1 μl至PCR管，用滅菌蒸餾水將反應(yīng)體系體積補(bǔ)充至10 μl，于PCR 儀中用95℃、5 min；Ramp -2.5%、25℃程序使引物二聚化。隨后，取5 μl 引物二聚體到滅菌離心管中，并加入1 μl T4 PNK 和1 μl T4 PNK Buffer，并用滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至10 μl，于37℃水浴中嚴(yán)格處理30 min，連接或放入-80℃冰箱保存。

Table 1 Primer information

1.2.2pTM1285-sgRNA載體的制備

用BbsⅠ內(nèi)切酶消化環(huán)狀質(zhì)粒pTM1285 使之形成線性的質(zhì)粒骨架后，酶切體系中加入等體積的異丙醇，混勻并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒提取收集柱中，用含75%乙醇的PE 溶液純化和雙蒸水洗脫，獲得純化的線性質(zhì)粒。構(gòu)建pTM1285-sgRNA 載體時(shí)，將2 μl 稀釋100 倍的磷酸化引物二聚體、2 μl 線性的pTM1285 質(zhì)粒、1 μl 10×T4 Ligase Buffer、1 μl T4 Ligase混合，并用滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系體積補(bǔ)充至10 μl，于16℃水浴中連接過(guò)夜。42℃熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板到LB 固體培養(yǎng)基（Amp+）篩選16~20 h。挑取若干克隆子，利用反向的sgRNA引物和tRNA進(jìn)行菌落PCR 鑒定（表1）。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后提取相應(yīng)克隆子中的質(zhì)粒用于電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3電轉(zhuǎn)化pTM1285-sgRNA載體

無(wú)菌培養(yǎng)野生型盤(pán)基網(wǎng)柄菌AX2 細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)期（方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［20］），收集2×107個(gè)AX2 細(xì)胞至15 ml 離心管中，冰上處理15 min，其間顛倒翻轉(zhuǎn)多次，于4℃、2 000 r/min 條件下離心5 min，棄上清液；再用預(yù)冷的H50緩沖液離心洗2次；最后用100 μl H50 重懸細(xì)胞，并加入5 μl pTM1285-sgRNA 載體與之混合后，將體系轉(zhuǎn)入0.1 cm的電擊杯中，用電穿孔儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，條件為750 V、25 μF，電擊2 次，2 次電擊之間間隔5 s，以不加載體的體系為對(duì)照。電擊結(jié)束后，將懸液全部轉(zhuǎn)入10 ml HL5 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。隨后向培養(yǎng)基中加G418（20 g/L）進(jìn)行篩選，約3 d 時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞開(kāi)始凋亡變圓，而實(shí)驗(yàn)組中的克隆子開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。

1.2.4噬菌斑分離單克隆

用SM 平板活化KA后，挑取單菌落到100 ml液體SM培養(yǎng)基中，22℃培養(yǎng)48 h可達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要的菌體密度，該菌液可以使用7 d左右。

離心收集電轉(zhuǎn)化后經(jīng)過(guò)G418 篩選3 d 的克隆子，于1.5 ml離心管中加入1 mlKA菌液使之重懸，依次吸取10、20、50、100、200、500 μl的懸液分別和990、980、950、900、800、500 μl的KA菌液混合后，涂布到SM固體平板上，于22℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，一般3~5 d 開(kāi)始形成噬菌斑，每1 個(gè)獨(dú)立的噬菌斑即為1個(gè)單克隆。

噬菌斑形成后，分別挑取噬菌斑周?chē)募?xì)胞到24 孔板中培養(yǎng)，每孔加入2 ml HL5 培養(yǎng)基（含雙抗和G418），22℃培養(yǎng)3 d 后，陽(yáng)性克隆子開(kāi)始迅速生長(zhǎng)，隨后這些細(xì)胞將被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)，此時(shí)，從每1個(gè)噬菌斑中分離獲得的細(xì)胞被定義為1個(gè)突變株。

1.2.5突變株的DNA測(cè)序鑒定和蛋白質(zhì)印跡鑒定

當(dāng)突變株細(xì)胞擴(kuò)增到足夠量后，用基因組DNA 提取試劑盒分離突變株的基因組DNA，并以此DNA為模板，用引物screen-F和screen-R（表1）擴(kuò)增獲得單一片段。切膠回收、純化目的片段后進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列與野生型細(xì)胞中的序列比對(duì)，由此可知突變信息。

用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)突變株細(xì)胞中的AKT 和ERKA蛋白的表達(dá)情況及其活性（方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［21］）。

1.2.6細(xì)胞的趨電性研究方法

細(xì)胞趨電性運(yùn)動(dòng)的研究方法參考文獻(xiàn)［21］。簡(jiǎn)述如下：

無(wú)菌培養(yǎng)AX2 細(xì)胞和突變型細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)期，取適量細(xì)胞于24 孔板中，22℃使細(xì)胞貼壁；用新鮮的DB緩沖液輕輕洗2次后，繼續(xù)用DB緩沖液饑餓處理3 h。重懸細(xì)胞，取適量細(xì)胞種到加電小室中，貼壁5 min，蓋上蓋玻片，加入適量的DB緩沖液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在小室兩端用?dǎo)電鹽橋連接直流電場(chǎng)。用帶有CCD 的顯微鏡記錄細(xì)胞在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)情況，拍照頻率為間隔1 min 拍1 幀，共30 min。拍照結(jié)束后，將圖片導(dǎo)入ⅠmageJ 軟件中進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次分析的細(xì)胞個(gè)數(shù)為50 個(gè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用方向性指數(shù)（directedness）和方向持續(xù)性指數(shù)（persistency）評(píng)價(jià)細(xì)胞在直流電場(chǎng)中的方向及在某一特定方向上的持續(xù)行為；用細(xì)胞的軌跡速度（track speed）和位移速度（displacement speed）評(píng)價(jià)細(xì)胞在直流電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)能力，其中，軌跡速度指的是細(xì)胞在單位時(shí)間（min）內(nèi)的運(yùn)動(dòng)路程（μm），位移速度指的是單位時(shí)間（min）內(nèi)的位移路程（μm）。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建基因編輯載體

Fig. 1 Selection of sgRNA and plasmid construction

本研究選用all-in-one 表達(dá)載體pTM1285 作為質(zhì)粒骨架構(gòu)建CRⅠSPR/Cas9基因編輯載體。先根據(jù)pikA和pikB基因的序列信息，在外顯子序列中尋找PAM 序列（NGG），選取該序列上游緊鄰的20 bp堿基序列作為sgRNA（圖1a），并通過(guò)在NCBⅠ系統(tǒng)中BLAST 比對(duì)，排除單核苷酸多態(tài)性序列的可能性，并最終確定sgRNA 的序列信息（表1）。根據(jù)sgRNA 在pTM1285 質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)，在sgRNA 的末端加上BbsⅠ酶切位點(diǎn)序列AGCA（正義鏈5'端）和AAAC（反義鏈5'端）。將引物二聚化和磷酸化后，與BbsⅠ酶切消化的線性pTM1285質(zhì)粒骨架連接，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并用氨芐青霉素鈉抗性篩選。以轉(zhuǎn)化子為模板，利用sgRNA的反向序列和tRNA的正向序列為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可獲得約100 bp 的擴(kuò)增片段（圖1b），該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序（圖1c），根據(jù)序列信息即可鑒定質(zhì)粒是否已經(jīng)重組。提取經(jīng)測(cè)序鑒定的轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒DNA，獲得pTM1285-sgRNA-pikA和pTM1285-sgRNA-pikB重組載體。

2.2 突變株的分離

通過(guò)電穿孔技術(shù)將pTM1285-sgRNA-pikA和pTM1285-sgRNA-pikB重組載體分別導(dǎo)入野生型AX2細(xì)胞中，利用20 mg/L G418篩選3 d后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子開(kāi)始分裂增殖，此時(shí)，收集轉(zhuǎn)化子并與KA混合后逐級(jí)稀釋涂布到SM 平板上，約3 d 后，噬菌斑開(kāi)始出現(xiàn)（圖2a），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，噬菌斑也進(jìn)一步變大，而當(dāng)噬菌斑中央?yún)^(qū)域的絕大部分KA被盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞攝取后，細(xì)胞開(kāi)始處于饑餓狀態(tài)，并開(kāi)始轉(zhuǎn)向多細(xì)胞發(fā)育。在突變株細(xì)胞篩選過(guò)程中，也可以初步根據(jù)噬菌斑中多細(xì)胞發(fā)育的表型進(jìn)行初篩。例如，當(dāng)靶基因是參與盤(pán)基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵基因時(shí)，噬菌斑中在多細(xì)胞發(fā)育情況也會(huì)隨之發(fā)生變化，出現(xiàn)一些發(fā)育缺陷，例如聚集缺失、孢子囊較小、噬菌斑邊緣不整齊等。進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。隨后，通過(guò)提取這些細(xì)胞的基因組DNA，并利用靶向序列兩端的引物進(jìn)行擴(kuò)增（圖2b）。擴(kuò)增片段的大小可能與野生型中靶向序列接近，也有可能差異較大，因此，只要獲得單一特異性的擴(kuò)增片段，都將進(jìn)一步對(duì)其開(kāi)展測(cè)序鑒定。在本項(xiàng)研究中，首先基于蛋白質(zhì)三聯(lián)密碼子的移碼突變，本研究選擇堿基序列變化為非三整數(shù)倍的突變類(lèi)型，其次再通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，最終在本研究中分別選擇了pikA--1（代表pikA基因的突變） 和pikB--5（代表pikB基因的突變）兩個(gè)突變株作為研究細(xì)胞趨電性的突變株。其中，與野生型的pikA基因序列相比，pikA-1的基因序列缺少了一個(gè)堿基，而與野生型的pikB基因序列相比，pikB--5 的基因序列則增加了4個(gè)堿基（圖2c）。

Fig. 2 Identification of gene knockout cell lines

2.3 多細(xì)胞發(fā)育鑒定

野生型盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞在饑餓條件下會(huì)形成具有孢子囊結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞有機(jī)體，這種從單細(xì)胞形成多細(xì)胞的過(guò)程被稱(chēng)為多細(xì)胞發(fā)育。為了研究方便，研究者認(rèn)為的將盤(pán)基網(wǎng)柄菌的多細(xì)胞發(fā)育分為細(xì)胞聚集階段（約4 h）、細(xì)胞丘階段（約8 h）、蛞蝓體階段（約12 h）和子實(shí)體階段（約22 h）。

為了探究pikA和pikB基因在盤(pán)基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的作用，本研究將pikA和pikB基因缺失突變株置于無(wú)營(yíng)養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基上，分別涂布6.5×105/cm2的野生型細(xì)胞、pikA突變株細(xì)胞和pikB突變株細(xì)胞。22℃條件下倒置培養(yǎng)，并利用體視顯微鏡分別觀察培養(yǎng)8 h 和24 h 時(shí)三種細(xì)胞的多細(xì)胞發(fā)育情況（圖3）。從實(shí)驗(yàn)所獲得的照片來(lái)看，饑餓8 h的野生型細(xì)胞AX2和pikA突變株都已經(jīng)處于細(xì)胞丘階段，但pikA突變株還有少數(shù)細(xì)胞處于聚集階段，與二者相比，pikB突變株細(xì)胞的發(fā)育要延遲一些，此時(shí)的pikB突變株細(xì)胞發(fā)育才進(jìn)入聚集階段。當(dāng)饑餓24 h后，野生型細(xì)胞和突變株細(xì)胞都形成了具有孢子囊結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞有機(jī)體，然而，與野生型細(xì)胞形成的多細(xì)胞有機(jī)體相比，pikA突變株細(xì)胞和pikB突變株細(xì)胞形成的多細(xì)胞體在形態(tài)和大小上都表現(xiàn)出差異性。其中，pikA-突變株細(xì)胞形成的孢子囊較野生型細(xì)胞形成的孢子囊結(jié)構(gòu)偏長(zhǎng)，孢子梗更粗壯，能將孢子囊直立于空氣中，而pikB-突變株細(xì)胞形成的孢子囊形狀與野生型相似，但卻比野生型細(xì)胞形成的孢子囊更小，孢子梗較纖細(xì)，使得大部分的孢子囊倒在基質(zhì)表面。這些結(jié)果暗示了PⅠ3K1和PⅠ3K2在盤(pán)基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的功能是有差異的。

Fig. 3 Development of wild-type and mutant cells plated on non-nutrient agar

2.4 突變株在直流電場(chǎng)中的趨電性

將野生型細(xì)胞和突變株細(xì)胞分別置于場(chǎng)強(qiáng)為12 V/cm的直流電場(chǎng)中，通過(guò)實(shí)時(shí)錄像系統(tǒng)記錄細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pikA-和pikB-突變株在直流電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向與野生型細(xì)胞相同，都是朝向電場(chǎng)負(fù)極方向運(yùn)動(dòng)（圖4a，b）。用軟件對(duì)細(xì)胞在直流電場(chǎng)的趨電性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生型細(xì)胞在直流電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向指數(shù)為（0.86±0.03），而pikA-和pikB-突變株在直流電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向指數(shù)分別為（0.95±0.02）和（0.94±0.03），二者與野生型細(xì)胞之間存在顯著差異；野生型細(xì)胞的方向持續(xù)性指數(shù)為（0.36±0.01），pikA-和pikB-突變株的方向持續(xù)性指數(shù)分別為（0.60±0.01） 和（0.62±0.01），說(shuō)明與野生型細(xì)胞相比，pikA-和pikB-突變株在直流電場(chǎng)朝向負(fù)極運(yùn)動(dòng)軌跡更為“筆直”。對(duì)三種細(xì)胞在直流電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，野生型細(xì)胞的平均軌跡速度（3.34±0.08）μm/min，而pikA-和pikB-突變株的平均軌跡速度分別為（4.85±0.20）和（5.48±0.15）μm/min，t檢驗(yàn)表明突變株和野生型之間存在極顯著的差異。平均位移速度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，野生型細(xì)胞的平均位移速度（1.26±0.05）μm/min，而pikA-和pikB-突變株的平均位移速度分別為（3.04±0.17）和（3.46±0.13）μm/min，t檢驗(yàn)同樣表明突變株和野生型之間存在極顯著的差異（圖4c）。以上結(jié)果揭示了pikA和pikB基因在盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞響應(yīng)直流電場(chǎng)發(fā)生定向遷移過(guò)程中發(fā)揮著抑制作用，當(dāng)人為干擾pikA和pikB基因后，突變株對(duì)相同強(qiáng)度的直流電場(chǎng)中的響應(yīng)更為強(qiáng)烈，此外，pikA和pikB基因還抑制了電場(chǎng)作用下的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。

Fig. 4 Electrotaxis of pikA and pikB mutants

2.5 PI3K1和PI3K2通過(guò)調(diào)節(jié)Akt和ERK抑制細(xì)胞的趨電性

據(jù)報(bào)道，盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度和趨電性分別與Akt 和ERKB 有關(guān)，因此，為了初步探究pikA和pikB基因缺失突變株在直流電場(chǎng)中的響應(yīng)機(jī)制，本研究利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分別探究了pikA和pikB突變株中的Akt 和ERK 的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖5），與野生型AX2中p-Akt的表達(dá)量相比，pikA和pikB突變株中的p-Akt的表達(dá)顯著增加，尤其是pikB突變株中的p-Akt的表達(dá)更高，表明細(xì)胞中高表達(dá)的p-Akt可能是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度增加的一個(gè)關(guān)鍵原因。此外，兩個(gè)突變株中ERK 的表達(dá)也與野生型明顯不同，pikA和pikB突變株中的p-ERKA 降低，而p-ERKB 的表達(dá)量卻增加了，推測(cè)細(xì)胞中p-ERKB的高表達(dá)可能是抑制細(xì)胞響應(yīng)電信號(hào)的原因之一。

Fig. 5 Western blot showed expression of Akt and ERK in wild-type and mutant cells

3 討論

PⅠ3K 是細(xì)胞定向遷移中一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)分子［17，22］?；蚪M全序列測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，盤(pán)基網(wǎng)柄菌中共有6 個(gè)Ⅰ類(lèi)的PⅠ3K，其中PⅠ3K1~5（編碼基因依次為pikA、pikB、pikC、pikF、pikG）具有較長(zhǎng)的N 端結(jié)構(gòu)域，1 個(gè)Ras 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）、1個(gè)C2結(jié)構(gòu)域、1個(gè)激酶輔助結(jié)構(gòu)域，以及1個(gè)激酶催化結(jié)構(gòu)域。從激酶結(jié)構(gòu)域組成分析，盤(pán)基網(wǎng)柄菌中的PⅠ3K1 和PⅠ3K2 分別與人類(lèi)的Ⅰa 和Ⅰb PⅠ3Ks 最為相似［3］，功能上有相同部分但也存在差異，例如，Buczynski 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，盤(pán)基網(wǎng)柄菌的PⅠ3K1 和PⅠ3K2 在調(diào)節(jié)盤(pán)基網(wǎng)柄菌的內(nèi)吞、細(xì)胞形狀和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮不同但有選擇性的作用。近來(lái)，Kim 等［23］研究表明，同時(shí)缺失PⅠ3K1 和PⅠ3K2的盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞，其運(yùn)動(dòng)速度較野生型細(xì)胞顯著增加，暗示了這個(gè)兩個(gè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的抑制作用，然而，并未明確哪個(gè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞速度的調(diào)控方面發(fā)揮著更為主導(dǎo)的作用。本項(xiàng)研究通過(guò)單基因敲除研究發(fā)現(xiàn)，PⅠ3K1 和PⅠ3K2 在盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞趨電性運(yùn)動(dòng)中可以獨(dú)自發(fā)揮抑制作用，其中包括運(yùn)動(dòng)的速度和對(duì)電場(chǎng)的響應(yīng)兩方面，本研究中發(fā)現(xiàn)的突變株多細(xì)胞發(fā)育差異也可以為該推測(cè)提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，該結(jié)果暗示了兩個(gè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著不同的功能，可能是與不同的Ras蛋白作用激活不同的信號(hào)通路。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRⅠSPR）相關(guān)蛋白9核酸酶（Cas9）介導(dǎo)的基因組編輯是一個(gè)強(qiáng)大的基因組編輯工具，該技術(shù)已被廣泛用于功能基因組研究。在通常使用的CRⅠSPR/Cas9 系統(tǒng)中，sgRNA的表達(dá)由RNA聚合酶ⅠⅠⅠ依賴(lài)的啟動(dòng)子（如U6）產(chǎn)生。盤(pán)基網(wǎng)柄菌屬U6核內(nèi)小RNA被認(rèn)為是由RNA聚合酶ⅠⅠⅠ轉(zhuǎn)錄的，因?yàn)樗狈υ谄渌矬w中觀察到的U6 的三甲基化5'帽。此外，U6啟動(dòng)子的使用需要一個(gè)“G”殘基作為sgRNA的第一個(gè)堿基來(lái)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，這限制了合適靶序列的數(shù)量。因此，利用內(nèi)源tRNA加工系統(tǒng)在盤(pán)基網(wǎng)柄菌屬中表達(dá)sgRNA。tRNA序列之間插入sgRNA會(huì)引起RNase P 和RNase Z 識(shí)別三葉草結(jié)構(gòu)并在tRNA的5'和3'端切割，產(chǎn)生成熟的sgRNAs。本文基于CRⅠSPR/Cas9基因編輯技術(shù)，利用適用于盤(pán)基網(wǎng)柄菌的all-in-one 表達(dá)載體pTM1285，構(gòu)建了pikA和pikB的基因突變株，為利用CRⅠAPR/Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的其他基因突變株提供了參考。

4 結(jié)論

本研究表明，盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞中的PⅠ3K1 和PⅠ3K2在細(xì)胞響應(yīng)直流電場(chǎng)發(fā)生定向遷移中各自發(fā)揮著抑制作用，具體體現(xiàn)在趨電性指數(shù)的顯著增加，同時(shí)在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度上，PⅠ3K1和PⅠ3K2也各自發(fā)揮著抑制作用，這種抑制作用可能與細(xì)胞中的Akt 和ERKB 的高表達(dá)相關(guān)，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。