張桂誠(chéng) 龔 鵬 王一凡 趙三軍

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500）

創(chuàng)傷后修復(fù)是一個(gè)動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)過程，需要多基因共同調(diào)控程序的表達(dá)，主要包括止血炎癥、新組織的形成和組織重構(gòu)或分解三個(gè)階段，在傷口愈合過程中細(xì)胞進(jìn)行分裂分化和運(yùn)動(dòng)遷移，而往往遷移要快于分裂分化過程，優(yōu)先對(duì)傷口處進(jìn)行修復(fù)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，傷口處皮膚屏障缺失導(dǎo)致的跨上皮電位短接會(huì)在傷口處產(chǎn)生內(nèi)源性電場(chǎng)（electric field，EF），這種恒穩(wěn)微直流電場(chǎng)能夠指導(dǎo)細(xì)胞向傷口中心定向遷移，在傷口愈合的過程中具有重要作用［2-3］。

上皮損傷后發(fā)生機(jī)械感知的改變與上皮穩(wěn)態(tài)的缺失，在傷口處形成一定的空隙，機(jī)械力環(huán)境發(fā)生改變，研究表明，此種活動(dòng)可以通過機(jī)械感知離子通道發(fā)揮作用，在生物體傷口愈合過程發(fā)揮作用［4］。PⅠEZO1 是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一類廣泛分布于包括皮膚在內(nèi)的各組織器官中的機(jī)械敏感離子通道，它能夠?qū)羟袘?yīng)力做出響應(yīng)，并將機(jī)械力轉(zhuǎn)換為生物信號(hào)，參與流體壓力感知、觸摸感覺，維持上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程。PⅠEZO1 參與介導(dǎo)了包括Ca2+在內(nèi)的多種金屬離子的流動(dòng)，在細(xì)胞增殖、分化和遷移過程中感受外界機(jī)械信號(hào)并在調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方式中發(fā)揮不可或缺的作用［5-6］。在細(xì)胞遷移過程中，PⅠEZO1 在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端的片狀偽足處積聚，抑制PⅠEZO1 通道可以促進(jìn)細(xì)胞遷移［7］。在盤基網(wǎng)柄菌中應(yīng)用siRNA敲低Piezo1表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其趨化性遷移的缺陷［6］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性電場(chǎng)在傷口愈合過程中是重要的細(xì)胞遷移方向信號(hào)［2］，在小鼠傷口愈合模型研究中發(fā)現(xiàn)，PⅠEZO1 參與傷口愈合、趨化性遷移和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［5］的過程，并且可以切換到純電壓門控模式［8］。但是PⅠEZO1是否參與細(xì)胞的趨電性遷移尚不清楚。本研究以人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT為模型，應(yīng)用PⅠEZO1的抑制劑以及siRNA 等方式調(diào)控PⅠEZO1 活性及表達(dá)，研究PⅠEZO1 在細(xì)胞感知電信號(hào)并進(jìn)行定向遷移中的作用，并探討PⅠEZO1 下游相關(guān)分子黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）及整合素（integrin）等蛋白質(zhì)分子對(duì)細(xì)胞趨電性遷移的影響，為研究細(xì)胞趨電性遷移的機(jī)理研究提供參考。

獼猴桃，又叫奇異果，基維果，KIWI fruit，胡桃，羊桃，其原產(chǎn)地在中國(guó)，在我國(guó)的文字記載已有2000余年的歷史，然而到了是20世紀(jì)初才由野生植株轉(zhuǎn)進(jìn)為人工馴化栽培，也就是說獼猴桃至今僅有100多年的人工栽培時(shí)間。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人永生化角質(zhì)細(xì)胞（HaCaT）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)KCB 200442YJ。

近年來，隨著成人高等教育，成人中等專業(yè)學(xué)校的發(fā)展，已初見高等教育大眾化和終身化的趨勢(shì)。由于人們對(duì)社會(huì)公平的追求和想要提高精神境界，以及技術(shù)更新和發(fā)展的要求，高等教育逐步進(jìn)入大眾化和終身化。這是解決結(jié)構(gòu)性失業(yè)的根本措施，也可有效的解決適齡人口下降造成高等教育資源閑置的問題。

1.2 主要試劑

胎牛血清（ExCell Bio），DMEM 高糖培養(yǎng)基（上海培源），F(xiàn)NC coating MⅠX（Enzo，AES），Opti-MEM （Gibco） ， LipofectamineTM2000（Thermo）， 釕 紅 （ruthenium red， RuR）、GsMTx4、PF562271 均購(gòu)自MCE，BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（GlpBio），F(xiàn)AK、磷酸化FAK、Akt、磷酸化Akt、Ⅰntegrin β1均為兔抗購(gòu)自CST公司，PⅠEZO1 兔抗（Affinity），GAPDH 兔抗（上海翌圣），β-tubulin 兔抗（Boster），HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔ⅠgG（華安生物），siRNA 由安徽通用生物技術(shù)公司合成，integrin β1 的抗體抑制劑P5D2 購(gòu)自Abcam公司。

1.3 主要器材

研究進(jìn)一步采取siRNA 干擾Piezo1mRNA 從而降低蛋白質(zhì)的表達(dá)來驗(yàn)證PⅠEZO1對(duì)于細(xì)胞趨電性遷移中的作用。采用三對(duì)不同序列siRNA 和與靶基因無(wú)同源性的序列作為陰性對(duì)照分別進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，PⅠEZO1 蛋白表達(dá)量如圖4 所示，編碼4669的序列顯著降低了PⅠEZO1蛋白的表達(dá)量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后接種于遷移小室（圖4），siRNA 干擾后的細(xì)胞與陰性對(duì)照相比，貼壁細(xì)胞狀態(tài)，呈現(xiàn)為均勻的片狀偽足伸展。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基（89% DMEM高糖培養(yǎng)基，10% FBS，1% 100×青霉素-鏈霉素），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3 d胰酶消化傳代1次，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞趨電性遷移

趨電小室（Boyden Chamber） 的制作參考Zhao 等［9］的方法，取直徑為 100 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿，使用高真空密封脂將蓋玻片（長(zhǎng)22 mm、寬10 mm、厚 0.13 mm）固定于培養(yǎng)皿底部中央，制作長(zhǎng)為22 mm、寬為10 mm的長(zhǎng)方形趨電小室。

取對(duì)數(shù)期HaCaT細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、稀釋至（1~5）×107/L 細(xì)胞密度并接種于FNC 包被的趨電小室，待細(xì)胞貼壁2 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要采用釕紅、GsMTx4、P5D2、PF562271 等孵育1 h 后，在小室兩端施加穩(wěn)定直流電場(chǎng)，強(qiáng)度為100 V/m，置于活細(xì)胞工作站中拍攝細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡，間隔5 min拍攝一次，持續(xù)2 h。每個(gè)處理選取3~5個(gè)視野，隨機(jī)選取細(xì)胞合計(jì)300個(gè)左右，應(yīng)用ⅠmageJ軟件，分析細(xì)胞的遷移路徑，以細(xì)胞遷移的方向性（directedness （cosθ））、軌跡速度（track speed）、位移速度（displacement speed）、方向持續(xù)性（euclidian persistence）四個(gè)指標(biāo)為參數(shù)，計(jì)算細(xì)胞趨電性遷移的能力。

2.3 蛋白樣品收集

Western blot 結(jié)果顯示，siRNA 干擾PⅠEZO1 表達(dá)后FAK 總蛋白未發(fā)生顯著性改變，但FAK 的磷酸化水平顯著降低，且在PⅠEZO1 表達(dá)被干擾后，電場(chǎng)對(duì)FAK 的磷酸化的促進(jìn)作用顯著被抑制，同時(shí)siRNA 干擾PⅠEZO1 表達(dá)后Akt 總蛋白無(wú)顯著變化，但使其磷酸化水平有小幅度下降，PⅠEZO1 低表達(dá)也取消了電場(chǎng)對(duì)于Akt磷酸化的促進(jìn)作用。與此同時(shí)電場(chǎng)作用下，總integrin β1蛋白表達(dá)量明顯升高，而且siRNA干擾PⅠEZO1后，在電場(chǎng)作用下其表達(dá)量未明顯升高（圖6）。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)期HaCaT細(xì)胞按照（2~8）×105/孔接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞融合度應(yīng)為 30%~50%。DEPC 水分裝siRNA 干粉，Opti-MEM 稀釋siRNA 至50 nmol/L，250 μl Opti-MEM 稀釋5 μl LipofectamineTM2000。兩者混勻靜置20 min后加入6孔板，補(bǔ)加培養(yǎng)基，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染18~48 h后收集蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡（Western blot）驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)染成功。

2.5 Western blot

蛋白質(zhì)樣品用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，根據(jù)定量結(jié)果將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至相同濃度，取4%~20%蛋白質(zhì)分離凝膠，組裝電泳架。每孔20 μl蛋白質(zhì)樣品，恒壓80 V電泳20 min，后續(xù)轉(zhuǎn)恒壓100 V 繼續(xù)電泳。甲醇激活PVDF 膜，組裝“三明治”結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件：電流250 mA，時(shí)間120 min。取PVDF 膜浸入預(yù)冷的TBST（TBS with Tween-20）緩沖液震蕩1 min 后，脫脂奶粉封閉60 min。根據(jù)蛋白質(zhì)大小將目的蛋白條帶切出，TBST 漂洗去封閉液，置于一抗4℃過夜孵育。取條帶TBST 漂洗10 min，洗3 次，二抗室溫孵育1 h，取條帶TBST 漂洗10 min，再洗3次。將條帶浸泡于新配制的發(fā)光液1 min 后取出，用化學(xué)成像系統(tǒng)（Tanon 5500 Multi）進(jìn)行拍攝。

2.6 數(shù)據(jù)分析與處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)3~5 個(gè)視野，共300 個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用Excel 2016 統(tǒng)計(jì)所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原始坐標(biāo)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM），應(yīng)用獨(dú)立性t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，較顯著差異*P<0.05，顯著差異**P<0.01，極顯著差異***P<0.001，應(yīng)用GraphPad Prism 8繪圖。

3 結(jié)果

3.1 釕紅顯著抑制HaCaT細(xì)胞趨電性遷移

使用抑制劑抑制FAK 后，與對(duì)照組相比，方向性降至（0.805±0.005）（P<0.01），降幅為9.5%，趨電性遷移軌跡速度降低至（0.589±0.004）μm/min，降幅超過18%，有顯著差異（P<0.001），位移速度顯著降低至（0.376±0.003）μm/min（P<0.01），細(xì)胞趨電性遷移的方向持續(xù)性與對(duì)照組并無(wú)顯著性差異。

GsMTx4是一種蜘蛛毒液肽，是特異性靶向陽(yáng)離子機(jī)械敏感離子通道（mechanosensitive ion channels，MSC）的抑制劑，可以阻礙機(jī)械力刺激細(xì)胞引起的胞內(nèi)電流［10］。選用GsMTx4處理細(xì)胞，調(diào)控PⅠEZO1 通道功能，追蹤細(xì)胞趨電性遷移軌跡（圖2a）。結(jié)果顯示：在未施加電場(chǎng)時(shí)，HaCaT 細(xì)胞呈現(xiàn)出向各方向的隨機(jī)遷移，遷移速度較慢，電場(chǎng)作用下，HaCaT 細(xì)胞呈現(xiàn)向電場(chǎng)正極的定向遷移，遷移速度顯著增加；用GsMTx4處理細(xì)胞抑制PⅠEZO1 功能，HaCaT 細(xì)胞向電場(chǎng)正極進(jìn)行定向遷移的路徑呈現(xiàn)更加分散（圖2b）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與未用GsMTx4的對(duì)照相比，HaCaT細(xì)胞在電場(chǎng)作用下軌跡速度由（0.782±0.008） μm/min 降低為（0.741±0.007）μm/min（n=300，P<0.05），位移速度由（0.529±0.007）μm/min降低至（0.458±0.006）（P<0.001），細(xì)胞在沿電場(chǎng)方向遷移的持續(xù)性也由（0.652±0.006） 顯著降低至（0.594±0.006）（P<0.001）（圖2c~e）。

采用Western blot 檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量以及磷酸化水平（圖3），結(jié)果顯示：100 V/m直流電場(chǎng)作用下，HaCaT 細(xì)胞的Ⅰntegrin β1 表達(dá)上調(diào)，Akt 和FAK的磷酸化水平也顯著上調(diào)；GsMTx4單獨(dú)作用也同樣使HaCaT 細(xì)胞的Akt 和FAK 的磷酸化水平顯著升高；但GsMTx4和電場(chǎng)同時(shí)作用下，未出現(xiàn)對(duì)Akt 與FAK 磷酸化水平以及integrin β1 表達(dá)的疊加促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，GsMTx4 作用于HaCaT 細(xì)胞后，在一定程度上抑制了其趨電性遷移，PⅠEZO1 可能在電場(chǎng)指導(dǎo)的細(xì)胞趨電性遷移過程中發(fā)揮作用。

Fig. 1 Electrotaxis of HaCaT cells treated by ruthenium red

3.2 GsMTx4顯著降低HaCaT細(xì)胞趨電性遷移的軌跡速度和方向持續(xù)性

1.職責(zé)不清。目前公職律師的業(yè)務(wù)范圍基本上與法制機(jī)構(gòu)職責(zé)重疊，公職律師與法律顧問、其他稅收法制人員之間的關(guān)系有待理順，職責(zé)劃分、管理架構(gòu)需進(jìn)一步明確。

Fig. 2 Electrotaxis of HaCaT cells treated by GsMTx4

無(wú)機(jī)化學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為入手和學(xué)習(xí)的一門課程，在理論課后要用實(shí)驗(yàn)去鞏固所學(xué)習(xí)的知識(shí)，在做實(shí)驗(yàn)的過程中，需要向?qū)W生灌輸認(rèn)真細(xì)致的實(shí)驗(yàn)態(tài)度，追求實(shí)事求是的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)可以檢驗(yàn)課本所教授的知識(shí)，同時(shí)可以強(qiáng)化理論的學(xué)習(xí)，鞏固理論知識(shí)。

Fig. 3 Electric field and GsMTx4 treatment promote the phosophorylation of Akt，F(xiàn)AK and integrin β1

3.3 siRNA干擾PIEZO1表達(dá)顯著降低HaCaT細(xì)胞趨電性方向性和方向持續(xù)性

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，活細(xì)胞工作站（Zeiss），細(xì)胞培養(yǎng)皿（LabServ），蛋白質(zhì)分離凝膠（上海翌圣），電泳儀（Bio-Rad），直流電源（百晶）。

綜上所述，當(dāng)前我國(guó)的環(huán)境污染以及土地資源的利用問題比較嚴(yán)重，人們應(yīng)該引起足夠的重視。在經(jīng)濟(jì)快去發(fā)展的今天，人們生活水平不斷提高，但這種現(xiàn)象應(yīng)該是可持續(xù)發(fā)展的，所以相關(guān)部門應(yīng)該注意在經(jīng)濟(jì)建設(shè)的發(fā)現(xiàn)過程中注意環(huán)境的保護(hù)，重視土地資源可持續(xù)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)、健康的發(fā)展。

細(xì)胞的趨電性遷移軌跡圖（圖5a），在電場(chǎng)作用下，陰性對(duì)照組HaCaT 細(xì)胞趨向正極進(jìn)行定向遷移；siRNA 干擾PⅠEZO1 后，HaCaT 細(xì)胞明顯降低了向正極遷移的方向性，且呈現(xiàn)出遷移的軌跡更加分散，說明細(xì)胞遷移的方向性受到影響，遷移的能力有所下降。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：siRNA干擾后，細(xì)胞趨電方向性由（0.805±0.008） 顯著降低至（0.514±0.014）（P<0.001），方向持續(xù)性由（0.606±0.005）降低到（0.579±0.005），存在較顯著差異（P＜0.05）；而siRNA 干擾細(xì)胞后，細(xì)胞在電場(chǎng)中的遷移速度、位移速度都略微降低，但與對(duì)照組相比都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異存在（圖5b~e）。

Fig. 4 Expression of PIEZO1 protein and morphological changes of cells after siRNA interference

Fig. 5 Electrotaxis of HaCaT cells after siRNA interference with PIEZO1

取對(duì)數(shù)期HaCaT 細(xì)胞調(diào)整密度，將約3×107個(gè)細(xì)胞均勻接種于4 cm×3 cm的小室，放入CO2培養(yǎng)箱37℃孵育至完全貼壁（2~4 h），設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)處理。組1：無(wú)電場(chǎng)，無(wú)藥物處理；組2：?jiǎn)为?dú)100 V/m電場(chǎng)處理；組3：無(wú)電場(chǎng)，單獨(dú)藥物處理；組4：100 V/m 電場(chǎng)加藥物處理。處理結(jié)束用預(yù)冷的PBS快速?zèng)_洗3遍，置于冰上加入200 μl配制好的裂解液，裂解5 min，細(xì)胞刮板刮下轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管。渦旋振蕩2 s后，4℃，13 000 r/min，11 min離心后取上清，置于冰上。

對(duì)照組給予常規(guī)護(hù)理管理措施，包括：24 h開診，隨時(shí)應(yīng)診；值班護(hù)士不得離開接診室；完善各類搶救器材與藥品；對(duì)患者具有高度的責(zé)任心與同情心；完善各項(xiàng)病歷與護(hù)理記錄；遇重大事故時(shí)，需要通知門診、醫(yī)務(wù)科、護(hù)理部與院領(lǐng)導(dǎo)等，并積極向有關(guān)部門報(bào)告。

現(xiàn)分別從主觀權(quán)重中抽取l個(gè)樣本、從客觀權(quán)重中抽取q-l個(gè)樣本，即每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)uj(1≤j≤n)有q個(gè)權(quán)重樣本，此時(shí)權(quán)重集合需滿足與q個(gè)權(quán)重向量的離散值越小越好。此外，對(duì)于評(píng)價(jià)指標(biāo)，不同主客觀權(quán)重的重要程度不同，現(xiàn)用α和β分別表示主、客觀權(quán)重的重要程度系數(shù)[21,22]。

PⅠEZO1 下調(diào)后細(xì)胞趨電性遷移的方向性受到顯著影響，暗示PⅠEZO1可能參與細(xì)胞定向遷移過程中對(duì)方向信號(hào)的調(diào)控。同時(shí)，Akt及FAK的磷酸化水平受到顯著抑制，siRNA 干擾PⅠEZO1 表達(dá)顯著影響電場(chǎng)對(duì)Akt及FAK的活化，以上結(jié)果暗示電場(chǎng)可能通過PⅠEZO1 調(diào)節(jié)Akt 及FAK 磷酸化水平調(diào)控細(xì)胞去電性遷移的方向性。而siRNA 干擾PⅠEZO1 的作用對(duì)于電場(chǎng)對(duì)Ⅰntegrin β1 表達(dá)的上調(diào)作用也有所抑制。

Fig. 6 The expression and phosphorylation of FAK，Akt and integrin β1 under electric field after siRNA interfering PIEZO1 expression

3.4 抑制integrin β1或FAK影響HaCaT細(xì)胞趨電性遷移

在細(xì)胞的定向遷移過程中，整合素在運(yùn)動(dòng)方向上呈高度極化狀態(tài)，細(xì)胞遷移過程中負(fù)責(zé)黏附的整合素經(jīng)由內(nèi)吞作用以及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行循環(huán)周轉(zhuǎn)受到FAK和相關(guān)底物的控制［11］。整合素和PⅠEZO1在細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，細(xì)胞感受機(jī)械刺激調(diào)節(jié)剛度增加需要整合素等相關(guān)通路信號(hào)的參與［12］。P5D2是一種特異性靶向integrin β1的抗體抑制劑，可用來阻斷其功能［13］。 FAK 抑制劑 PF562271（Synonyms）是一種可逆的ATP 競(jìng)爭(zhēng)性的FAK 和Pyk2 抑制劑，可以抑制FAK Y397 的磷酸化水平［14］。

軌跡圖顯示（圖7a），在integrin β1 抑制劑P5D2 作用下，HaCaT 細(xì)胞在電場(chǎng)下的運(yùn)動(dòng)軌跡及范圍顯著縮小，細(xì)胞呈現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力的下降，且沿電場(chǎng)方向上進(jìn)行遷移的方向性降低，HaCaT 細(xì)胞趨電性遷移的四個(gè)參數(shù)均顯著下降（圖7b~e）。在FAK 抑制劑PF562271 的作用下，細(xì)胞向正極方向的遷移軌跡范圍有顯著縮小，說明其遷移能力有所下降，但定向移動(dòng)的方向性仍較好。

Fig. 7 The electrotaxis of HaCaT cells under the treatment of integrin β1 antibody inhibitor P5D2 and FAK inhibitor PF562271

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：P5D2 作用后HaCaT 細(xì)胞在電場(chǎng)中遷移的方向性顯著下降，與對(duì)照組相比，細(xì)胞趨電性遷移的方向性由（0.890±0.004）下降至（0.357±0.014）（P<0.001）下降超過59%。細(xì)胞軌跡速度從（0.722±0.005） μm/min， 顯著下降到（0.416±0.004）μm/min（P<0.001）；位移速度也呈現(xiàn)相同的差異降低，從（0.494±0.004）μm/min 下降為（0.111±0.002）μm/min（P<0.001）。方向持續(xù)性從（0.641±0.003）下降為（0.264±0.004），對(duì)照組EF與P5D2處理存在極顯著差異（P<0.001）。

釕紅是廣譜陽(yáng)離子通道抑制劑，抑制包括PⅠEZO1 在內(nèi)的多種陽(yáng)離子通道。從細(xì)胞遷移的軌跡圖可以看出，未施加電場(chǎng)時(shí)HaCaT 細(xì)胞呈現(xiàn)隨機(jī)遷移，在100 V/m的直流電場(chǎng)作用下HaCaT細(xì)胞向電場(chǎng)正極快速定向遷移，釕紅顯著抑制了電場(chǎng)對(duì)于細(xì)胞遷移的促進(jìn)和定向作用（圖1a）。對(duì)細(xì)胞遷移各參數(shù)分析結(jié)果顯示，未施加電場(chǎng)時(shí)，HaCaT細(xì)胞呈向各方向隨機(jī)遷移，遷移速度較慢，電場(chǎng)作用下，HaCaT 細(xì)胞趨電性遷移的方向性、軌跡速度、位移速度和方向持續(xù)性顯著升高（圖1b~e）。釕紅顯著抑制了HaCaT 細(xì)胞的趨電性遷移，其遷移主要參數(shù)均顯著降低：遷移方向性由（0.907±0.007）顯著降低至（0.422±0.018）（P<0.001）；軌跡速度由（0.855±0.007） μm/min 顯著降低至（0.636±0.007） μm/min （P<0.001）；位移速度由（0.615±0.007） μm/min 顯著降低至 （0.296±0.005） μm/min （P<0.001）；方向持續(xù)性也由（0.708±0.005）降低至（0.455±0.006）（P<0.001）。上述結(jié)果表明，釕紅顯著抑制HaCaT 細(xì)胞的趨電性遷移，暗示包括PⅠEZO1 在內(nèi)的陽(yáng)離子通道可能在細(xì)胞的趨電性遷移過程發(fā)揮重要作用。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，P5D2抑制integrin β1后顯著抑制了HaCaT 細(xì)胞的趨電性遷移，其方向性和速度的抑制都較為明顯。抑制FAK 影響HaCaT細(xì)胞的趨電性遷移，但影響幅度較小。

Western blot 結(jié)果顯示，P5D2 抑制integrin β1后，F(xiàn)AK 的磷酸化水平有所上調(diào)，電場(chǎng)作用下其磷酸化水平一步上升（圖8），猜測(cè)電場(chǎng)作用下FAK 的活化可能并不被integrin β1 功能抑制所阻礙，僅被電信號(hào)引起的生理變化所激活。在P5D2的作用下，磷酸化Akt的水平顯著下降，而且電場(chǎng)在P5D2作用下并未改變磷酸化Akt的水平（圖8），說明在電信號(hào)作用下可以通過integrin β1 調(diào)控Akt的活化水平并參與細(xì)胞的趨電性遷移。

Fig. 8 Electrotaxis of HaCaT cells under treatment of integrin β1 inhibitor P5D2

4 討論

在皮膚損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)，在損傷產(chǎn)生的其他因子（如接觸抑制釋放、趨化因子釋放等）同時(shí)存在的情況下，傷口處產(chǎn)生的內(nèi)源性電場(chǎng)，是主導(dǎo)細(xì)胞向傷口中心定向遷移，從而促進(jìn)傷口愈合的重要信號(hào)［2］。但細(xì)胞遷移過程中響應(yīng)電信號(hào)的關(guān)鍵分子及信號(hào)通路尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，PⅠEZO1 可以影響細(xì)胞的趨化性遷移［6］，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［5，15-17］，在傷口愈合過程中發(fā)揮重要作用［4］，并且Piezo1可被電壓門控調(diào)節(jié)［8］。本研究以HaCaT 細(xì)胞為模型研究PⅠEZO1在感知電信號(hào)與促進(jìn)細(xì)胞定向遷移中的作用，研究結(jié)果顯示，抑制或降低PⅠEZO1表達(dá)，HaCaT 細(xì)胞在電場(chǎng)中的定向遷移方向性參數(shù)以及速度參數(shù)受到不同程度的抑制。尤其是通過RNAi 技術(shù)敲低PⅠEZO1 后，細(xì)胞趨電性遷移顯著下降，這與在盤基網(wǎng)柄菌中低表達(dá)Piezo1趨化性受到抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在方向信號(hào)cAMP的作用下，Piezo1參與調(diào)控細(xì)胞定向遷移的方向性，而對(duì)遷移的速度影響甚微，細(xì)胞在電場(chǎng)信號(hào)作用下有同樣的結(jié)果。以上提示PⅠEZO1對(duì)細(xì)胞遷移方向性的重要性［6］。因此，PⅠEZO1 可能參與細(xì)胞感知外界電場(chǎng)信號(hào)影響細(xì)胞的趨電性遷移從而促進(jìn)傷口愈合的過程。

本研究中所采用了兩種抑制劑分別抑制PⅠEZO1 的活性，結(jié)果顯示，廣譜抑制劑釕紅作用下細(xì)胞趨電性遷移的速度、方向性及方向持續(xù)性等參數(shù)均呈現(xiàn)極顯著下降，而抑制劑GsMTx4作用下細(xì)胞趨電性遷移的速度及方向持續(xù)性有顯著下降，造成以上結(jié)果的原因可能是由于廣譜抑制劑釕紅作用主要阻斷部分Ca2+、Na+通道［18］，可以抑制包括PⅠEZO1 介導(dǎo)Ca2+電流。而抑制劑GsMTx4 是選擇性地抑制PⅠEZO 和TRP 通道家族陽(yáng)離子的機(jī)械敏感性通道，還可阻斷陽(yáng)離子選擇性的拉伸激活通道（SAC）［19］。已有研究證明，Ca2+在細(xì)胞遷移過程中具有重要作用［20］，廣譜抑制劑釕紅對(duì)細(xì)胞趨電性遷移的顯著抑制作用可能是通過阻斷PⅠEZO1 介導(dǎo)的Ca2+流發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，電場(chǎng)顯著促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞integrin β1的表達(dá)和FAK磷酸化水平的上升，這與電場(chǎng)誘導(dǎo)升高integrin β1的mRNA或蛋白質(zhì)水平激活FAK 的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遷移［21］和在人晶狀體上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換［22］的研究報(bào)道相符合。電場(chǎng)作用還可以活化上調(diào)PⅠ3K/Akt 途徑啟動(dòng)細(xì)胞反應(yīng)，如遷移、增殖和分化［23］。本研究應(yīng)用GsMTx4抑制劑及RNAi方式敲低PⅠEZO1 的表達(dá)均抑制電場(chǎng)對(duì)HaCaT 細(xì)胞integrin β1 表達(dá)的促進(jìn)，這表明電場(chǎng)作用促進(jìn)integrin β1 表達(dá)上調(diào)的過程是通過PⅠEZO1 介導(dǎo)，同時(shí)敲低PⅠEZO1也抑制了FAK磷酸化，且FAK不能被電場(chǎng)進(jìn)一步激活，這顯示電場(chǎng)對(duì)FAK 的活化作用受到PⅠEZO1 水平的調(diào)節(jié)。但PⅠEZO1 響應(yīng)電場(chǎng)的具體機(jī)制以及是否直接調(diào)節(jié)integrin β1和FAK影響細(xì)胞趨電性遷移仍待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

應(yīng)用抗體抑制劑P5D2 阻斷integrin β1 的功能與抑制劑PF562271來抑制FAK的功能，PⅠEZO1下游的integrin β1和FAK在不同程度上影響HaCaT細(xì)胞的趨電性遷移。暗示細(xì)胞對(duì)趨電性遷移方向的調(diào)控可能是通過PⅠEZO1 影響FAK 的磷酸化和integrin β1表達(dá)來傳遞電場(chǎng)信號(hào)。

5 結(jié)論

PⅠEZO1 參與HaCaT 細(xì)胞的趨電性遷移，是影響HaCaT 細(xì)胞趨電性遷移的重要分子之一；抑制integrin β1和FAK會(huì)影響HaCaT細(xì)胞的趨電性遷移過程，integrin β1 與FAK 可能與PⅠEZO1 介導(dǎo)細(xì)胞感應(yīng)電場(chǎng)的信號(hào)通路有關(guān)，電場(chǎng)信號(hào)可能通過PⅠEZO1介導(dǎo)參與integrin β1和FAK的調(diào)控過程。

分析問卷數(shù)據(jù)了解到，住宅為一層的比例為78%，住宅為二層的比例為22%；住宅圍護(hù)結(jié)構(gòu)為磚房的比例為92%，土房比例為8%，說明一層磚房為北方農(nóng)村住宅的典型形式。