韓維維,王 博,鐘 晴,張 蓉,徐 馳*

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院;2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150040

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的主要危險(xiǎn)因素之一。人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells,HAECs)與AS病變的產(chǎn)生有關(guān)[1]。此外,既往研究表明,HAECs的異常遷移、增殖和凋亡與AS的進(jìn)展密切相關(guān)[2]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)會(huì)損害人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能并且是促進(jìn)AS進(jìn)展的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[3]。研究發(fā)現(xiàn)糖酵解是參與動(dòng)脈粥樣硬化形成最重要的代謝途徑之一[4]。Sarrazy等[5]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠敲低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá)水平,可提高小鼠對(duì)葡萄糖的攝取從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。Matsui等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性減少糖酵解可降低血管中超氧化物的水平,進(jìn)而減輕動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的損傷,另一研究發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑關(guān)鍵基因PGK1參與ox-LDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[7]。以上研究結(jié)果說明糖酵解途徑在動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程中扮演重要角色。

18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,GA)是甘草中關(guān)鍵的生物活性成分,具有抗炎癥,抗氧化,抗病毒及抗癌等多種藥理作用,其中抗氧化的作用尤其顯著,與此同時(shí)還可以通過生物轉(zhuǎn)化等過程更大限度地發(fā)揮積極作用[8]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)GA可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的白介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎性細(xì)胞因子的分泌及凋亡的發(fā)生,提示GA可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和凋亡。那么GA能否通過糖酵解途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡進(jìn)而防治動(dòng)脈粥樣硬化,目前尚未報(bào)道。因此本研究基于PGK1介導(dǎo)的糖酵解途徑來探討GA抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為AS的防治提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(武漢普諾賽生物技術(shù)公司);GA(貨號(hào)DG0172,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,成都德思特生物技術(shù)有限公司);oxLDL(貨號(hào)CB82737214,廣州奕元生物有限公司);乳酸檢測試劑盒(貨號(hào)A019-2-1,南京建成公司);葡萄糖檢測試劑盒(貨號(hào)S0201S)、CCK8試劑盒(貨號(hào)C0038)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)C1090)購于碧云天公司;PGK1(貨號(hào)E9R7O)、GLUT1(貨號(hào)E4S6I)、HK2(貨號(hào)C64G5)、PKM2(貨號(hào)D78A4)Rabbit mAb抗體購于美國Cell-Signaling公司;Bax(貨號(hào)14-6999-82)Mouse mAb、Bcl2(貨號(hào)13-8800)Mouse mAb、Caspase-3(貨號(hào)700182)Rabbit mAb及Caspase-9(貨號(hào)MA1-12562)Mouse mAb抗體購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 主要儀器

CO2恒溫孵育箱(MCO-15AC,SANYO公司,日本);多功能酶標(biāo)儀(FlexStation 3,Molecular Devices,美國)。

1.3 原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

使用原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),包含1%青鏈霉素、1%原代內(nèi)皮細(xì)胞添加劑及2%胎牛血清作為完全培養(yǎng)基,不含胎牛血清添加的培養(yǎng)基作為同步化培養(yǎng)基,同步化6 h后進(jìn)行給藥處理。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control,Con)、oxLDL模型組(model,Mod,100 mg/L)、GA治療組(oxLDL+10 μmol/L,GA-10;oxLDL+20 μmol/L,GA-20;oxLDL+40 μmol/L,GA-40),其中oxLDL處理細(xì)胞24 h后,不同濃度的GA再處理24 h。給予PKG1激動(dòng)劑后分組為空白對(duì)照組(control,Con),oxLDL模型組(model,Mod,100 mg/L),GA治療組(oxLDL+40 μmol/L,GA-40),PKG1激動(dòng)劑(特拉唑嗪)+GA+oxLDL組(GA+TZ),其中特拉唑嗪和GA共同作用于細(xì)胞24 h。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

用預(yù)冷的PBS清洗用藥處理后的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞3次,每孔加入60 μL RIPA強(qiáng)裂解液,置于冰上裂解30 min,12 000 r/min收集細(xì)胞上清,加入細(xì)胞上樣緩沖液,100℃煮沸5 min。SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,脫脂奶粉封閉1 h,TPBS洗膜3次,分別加入一抗PGK1(1∶500)、GLUT1(1∶1 000)、HK2(1∶1 000)、PKM2(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl2(1∶300)、Caspase-3(1∶500)、Caspase-9(1∶200)及β-actin(1∶2 000),4℃孵育過夜,洗膜后室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h,洗膜后用成像儀發(fā)光拍照。

1.6 TUNEL法檢測主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

棄掉細(xì)胞上清后,用PBS輕輕沖洗細(xì)胞,4%多聚甲醛固定15 min。然后,用TUNEL試劑在37 ℃避光條件下孵育1 h,使其滲透30 min。最后,用DAPI染料標(biāo)記細(xì)胞核。熒光圖像采用共聚焦激光掃描顯微鏡(奧林巴斯,日本)拍攝。紅色熒光代表TUNEL標(biāo)記的標(biāo)記凋亡細(xì)胞的信號(hào)。TUNEL標(biāo)記核的數(shù)量(紅色)占總DAPI標(biāo)記核的數(shù)量(藍(lán)色)的百分比為凋亡指數(shù)。

1.7 CCK-8法檢測人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活性

將原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種在96孔板,每孔200 μL培養(yǎng)基并根據(jù)不同的GA濃度進(jìn)行給藥,每組設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔,作用24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,待明顯顯色后用多功能酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長的各組OD值。

1.8 比色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖和乳酸濃度

去除人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS清洗三次。加入裂解液充分裂解后,離心取上清作為待測樣品,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,96孔板每孔加200 μL上清液,于630 nm和530 nm波長處分別檢測葡萄糖和乳酸吸光度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 GA對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

CCK-8結(jié)果顯示GA濃度0、10、20、40、80、160 μmol/L處理內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),細(xì)胞活性(OD值)分別為0.89±0.07、0.87±0.03、0.83±0.05、0.85±0.04、0.61±0.04、0.52±0.12,其中大于GA濃度大于80 μmol/L時(shí)細(xì)胞的活性降低(P<0.01),而濃度在10～40 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的活性無影響(P>0.05),因此選用10、20、40 μmol/L分別為低劑量組,中劑量組和高劑量組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 GA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

與Con相比,Mod人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平及TUNEL凋亡指數(shù)明顯增加,Bcl2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與Mod相比,GA治療組(GA-10、GA-20、GA-40)內(nèi)皮細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平及TUNEL凋亡指數(shù)明顯降低,Bcl2蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)(見圖1、2)。以上結(jié)果說明GA可以抑制oxLDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

圖1 GA對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of GA on cell apoptosis in each group

圖2 TUNEL法檢測凋亡水平Fig.2 Apoptosis level was measured by TUNEL method

2.3 GA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵基因PGK1、GLUT1、HK2、PKM蛋白水平的影響

與Con相比,Mod人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PGK1蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01);與Mod相比,GA治療組(GA-10、GA-20、GA-40)內(nèi)皮細(xì)胞PKG1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),并且呈劑量依賴性(見圖3)。

圖3 GA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵基因PGK1、GLUT1、HK2、PKM蛋白水平的影響Fig.3 Effect of GA on the protein levels of PGK1,GLUT 1,HK2,and PKM,the key glycolysis genes induced by oxLDL in human aortic endothelial cells

2.4 GA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響

比色法結(jié)果顯示,與Con相比,Mod人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯降低,乳酸分泌量明顯增加(P<0.01);與Mod相比,GA治療組(GA-10、GA-20、GA-40)內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯上升,乳酸分泌量顯著減少(P<0.01),并且呈劑量依賴性(P<0.01)(見圖4)。

圖4 GA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響Fig.4 Effect of GA on glucose consumption and lactate production in human aortic endothelial cells induced by oxLDL

2.5 PGK1蛋白激動(dòng)劑特拉唑嗪對(duì)GA抑制oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的影響

與Con相比,Mod人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯增加,Bcl2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與Mod相比,GA治療組(GA-40)內(nèi)皮細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯降低,Bcl2蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)(見圖5),然而加入PGK1蛋白激動(dòng)劑特拉唑嗪后可以逆轉(zhuǎn)GA的上述作用,提示GA通過抑制PGK1介導(dǎo)的糖酵解通路進(jìn)而抑制oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

圖5 特拉唑嗪對(duì)每組凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of terrazosin on apoptotic protein expression in each group

3 討論與結(jié)論

近年來研究發(fā)現(xiàn),作為甘草的關(guān)鍵生物活性成分GA對(duì)多種心血管疾病具有一定的防治作用。GA通過調(diào)控RhoA/Rho激酶通路抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖進(jìn)而防治肺動(dòng)脈高壓[10]。Yang等[11]通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GA可通過抗氧化和抗炎作用緩解肺動(dòng)脈高壓大鼠代謝紊亂,提高機(jī)體抗缺氧能力,恢復(fù)各種代謝途徑(能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝)。另外GA還可以通過抑制IP3介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控多種心血管的功能。比如其可以通過減弱細(xì)胞內(nèi)鈣過載改善心臟舒張功能,并可以通過調(diào)控鈣內(nèi)流介導(dǎo)的p38 MAPK通路進(jìn)而抑制缺血性心肌細(xì)胞凋亡[12,13]。然而GA對(duì)AS的防治機(jī)制目前尚不清楚。

本研究利用oxLDL處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞模擬AS體外細(xì)胞模型。發(fā)現(xiàn)在oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中,促進(jìn)凋亡指標(biāo)cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax及TUNEL水平顯著增加,抑制凋亡因子Bcl2的水平顯著下調(diào),加入低中高劑量的GA均可以有效抑制促凋亡指標(biāo)Caspase-3、Caspase-9、Bax及TUNEL的水平,并促進(jìn)抑制凋亡因子Bcl2的表達(dá),提示GA可以抑制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)另外,在oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型中,糖酵解關(guān)鍵基因PGK1、GLUT1、HK2及PKM表達(dá)水平顯著增加,提示在oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中激活了細(xì)胞的糖酵解代謝。而加入低中高劑量的GA均可以有效抑制上述糖酵解關(guān)鍵基因的表達(dá)水平,說明GA可以抑制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解途徑。多項(xiàng)研究已證實(shí)糖酵解是參與動(dòng)脈粥樣硬化形成最重要的代謝途徑之一[14-16],而本研究結(jié)果也證實(shí)了糖酵解參與了oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程,并且GA可以抑制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解途徑。本研究進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)加入PGK1激動(dòng)劑特拉唑嗪后,可以顯著逆轉(zhuǎn)GA對(duì)oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用,上述研究說明GA通過PGK1介導(dǎo)的糖酵解途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。而PGK1是催化糖酵解途徑中第一個(gè)產(chǎn)生ATP的酶,是介導(dǎo)糖酵解途徑的關(guān)鍵基因。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)oxLDL處理的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞模型中PGK1蛋白表達(dá)顯著增加,而本研究結(jié)果與上述一致,說明PGK1介導(dǎo)的糖酵解途徑是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)GA通過抑制PGK1介導(dǎo)的糖酵解通路進(jìn)而抑制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。