趙俊　陳勇　吳春芳

摘要 目的：探討長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）在脊髓損傷凋亡和自噬中的作用及相關(guān)機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）和模型組（SCI組）。構(gòu)建缺氧缺糖誘導的SY－SH5Y細胞模型（OGD模型），將SY－SH5Y細胞分為Control組、OGD組、OGD＋Vector組、OGD＋pcDNA－HOTAIR組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組。通過脊髓損傷運動功能（BBB）評分評估大鼠運動功能的恢復能力；通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e檢測HOTAIR和miR－17、miR－17和Beclin－1之間的靶向關(guān)系；實時定量聚合酶鏈反應（RT－qPCR）檢測大鼠脊髓組織和細胞中HOTAIR、miR－17、Beclin－1 mRNA的表達；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠脊髓組織和細胞中Beclin－1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、P62蛋白的表達；流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況。結(jié)果：與Sham組比較，SCI組大鼠BBB評分下降，脊髓組織中HOTAIR水平降低，miR－17水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Control組比較，OGD組處理的SY－SH5Y細胞中HOTAIR水平降低，miR－17水平升高，神經(jīng)元凋亡率升高，LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋Vector組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR組細胞中HOTAIR水平升高（P＜0.05），神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表達升高（P＜0.05），P62蛋白表達降低（P＜0.05），而自噬抑制劑3－甲基腺嘌呤（3－MA）逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果（P＜0.05）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，Beclin－1是miR－17的靶基因，miR－17是HOTAIR的靶基因。與OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組細胞中miR－17表達明顯升高，神經(jīng)元凋亡率明顯升高，Beclin－1和LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：LncRNA HOTAIR通過靶向miR－17/Beclin－1通路增強自噬，從而減輕神經(jīng)元凋亡和改善脊髓損傷。

關(guān)鍵詞 脊髓損傷；長鏈非編碼核糖核酸；HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA；細胞自噬；神經(jīng)元凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.014

脊髓損傷（SCI）是血管外科、胸外科、脊柱外科手術(shù)中常見的并發(fā)癥，可引起損傷脊髓節(jié)段肢體運動和感覺功能障礙，嚴重威脅人類健康和生命［1］。神經(jīng)元凋亡是脊髓損傷中的主要病理特征之一，導致一定程度的神經(jīng)損傷、壞死或自主神經(jīng)功能障礙［2－3］。然而，細胞凋亡并不是決定細胞命運的唯一途徑，自噬與凋亡相互作用［4］。自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，可清除細胞生長和衰老過程中多余或損傷的細胞器，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［5］。研究表明，在脊髓損傷模型大鼠中，自噬已被證實通過抑制脊髓損傷后的神經(jīng)元凋亡來減少神經(jīng)元損傷和促進運動恢復［6］。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類核苷酸長度超過200的非編碼RNA，它們在多種生物和病理過程中廣泛調(diào)節(jié)基因表達。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）位于12號染色體，與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥和心肌損傷［7－8］。HOTAIR影響神經(jīng)元凋亡，HOTAIR通過調(diào)節(jié)miR－874－5p促進帕金森病介導的神經(jīng)元損傷［9］。然而，關(guān)于HOTAIR在脊髓損傷中對神經(jīng)元凋亡的作用機制尚未明確。因此，本研究探討LncRNA HOTAIR在脊髓損傷神經(jīng)細胞凋亡和自噬中的作用，旨在為脊髓損傷治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pcDNA－HOTAIR、Vector、miR－17 mimic及NC mimic質(zhì)粒購自漢恒生物科技（上海）有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自Sigma－Aldrich中國公司。流式細胞儀購自BD公司；低氧培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司；ABI 7500 實時PCR系統(tǒng)購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～230 g，由河南省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)在標準溫度（23～25 ℃）、濕度（50%～60%）的環(huán)境條件下，12 h光/暗循環(huán)，所有動物均可自由獲得食物和水。本研究的動物實驗均按照中國衛(wèi)生研究院《實驗動物護理使用指南》進行，并經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.3 實驗方法

1.3.1 構(gòu)建脊髓損傷模型

將大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（SCI組）。模型組構(gòu)建脊髓損傷模型：將大鼠麻醉后俯臥位于手術(shù)臺上，消毒備皮。逐層解剖暴露大鼠脊柱，在T9和T10棘突處行椎板切除術(shù)以徹底暴露脊髓。然后用10 g的重物從5 cm高的地方落下?lián)舸蚣顾璞砻?，造成脊髓損傷。當觀察到雙下肢癱瘓、尾巴擺動和脊髓血腫形成，表明脊髓損傷模型的成功建立。隨后，用生理鹽水清洗傷口，將肌肉和皮膚分層縫合。Sham組大鼠僅進行椎板切除術(shù)。脊髓損傷術(shù)后，每天按摩大鼠膀胱2次，直至自主排尿功能恢復。為了驗證HOTAIR在脊髓損傷體內(nèi)進展中的作用，通過建立脊髓損傷大鼠模型，將5 μL pcDNA－HOTAIR及其陰性對照Vector腺病毒載體用玻璃微移液管注射到大鼠脊髓（每組6只）。48 h后處死大鼠，取脊髓組織進行后續(xù)實驗。

1.3.2 脊髓損傷運動功能（BBB）評分

采用BBB評分評估大鼠運動功能的恢復能力［10］。分別在大鼠脊髓損傷后1、6、12、24、48 h對大鼠的運動進行雙盲觀察。BBB評分是由2名獨立的調(diào)查人員進行盲測。將大鼠置于實驗平臺上，對大鼠的后肢運動進行評分和觀察，每次測試持續(xù)4 min。每只大鼠的最終評分取2名研究者的平均分。

1.3.3 實時定量聚合酶鏈式反應（RT－qPCR）

在脊髓損傷后48 h處死大鼠，取損傷部位上下1 cm的脊髓組織，用Trizol試劑提取總RNA。為了量化HOTAIR和miR－17的表達，使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒根據(jù)其說明書將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。LncRNA和miRNA表達水平的相對定量在ABI 7500 實時聚合酶鏈式反應系統(tǒng)上進行，并使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒通過2－ΔΔCt方法計算。LncRNA和miRNA的相對表達分別歸一化為甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6表達。

1.3.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

使用RIPA裂解緩沖液從脊髓組織中獲取總蛋白，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定其蛋白質(zhì)濃度。將樣品用12%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后，PVDF膜用含5%脫脂牛奶的TBST在室溫下封閉1 h，然后用抗Beclin－1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、P62的一抗在4 ℃孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。條帶通過增強化學發(fā)光（ECL）曝光并使用Image J 軟件進行分析。

1.3.5 細胞培養(yǎng)

將人海馬神經(jīng)元來源的細胞系SY－SH5Y在添加有Eagle′s最低必需培養(yǎng)基（EMEM）、1%非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺、15%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進行缺氧葡萄糖剝奪（OGD）試驗以通過減少O2和葡萄糖的補充來模擬神經(jīng)元損傷誘導的缺血病理條件。神經(jīng)元在OGD溶液中于94%N2、5%CO2、1%O2的受控低氧培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育1 h。然后神經(jīng)元在含有5.5 mmol/L葡萄糖的OGD溶液中于37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)24 h進行復氧。

1.3.6 細胞轉(zhuǎn)染

為了研究HOTAIR和miR－17在神經(jīng)元凋亡中的作用及其相互作用，將SY－SH5Y細胞分為6組：Control組、OGD組、OGD＋Vector組、OGD＋pcDNA－HOTAIR組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組。根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000將pcDNA－HOTAIR、Vector、miR－17 mimic及NC mimic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SY－SH5Y細胞中。用OGD處理細胞6 h，然后置于含有1 mmol/L自噬抑制劑3－甲基腺嘌呤（3－MA）的正常培養(yǎng)基中并再給氧24 h，收集細胞并進行后續(xù)實驗。

1.3.7 流式細胞術(shù)

用膜聯(lián)蛋白V－FITC/Annexin V－FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒測定SY－SH5Y細胞凋亡，然后進行流式細胞分析。將SY－SH5Y細胞（2×105/孔）接種至6孔板中，待其生長融合至70%～80%。收集細胞并用200 μL的Annexin V－FITC和10 μL的PI染色，最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

將HOTAIR－WT、HOTAIR－MUT序列或Beclin－1－野生型（WT）、Beclin－1－突變型（MUT）序列插入熒光素酶報告載體pmirGLO。隨后，使用Lipofectamine 2000將pmirGLO－HOTAIR－WT、pmirGLO－HOTAIR－MUT以及pmirGLO－Beclin－1－WT、pmirGLO－Beclin－1－MUT分別與NC mimic、miR－17 mimic共轉(zhuǎn)染到SY－SH5Y細胞中。最后，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析細胞的熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s） 表示，組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓損傷大鼠脊髓組織和OGD誘導的細胞中HOTAIR、miR－17表達比較

與Sham組比較，SCI組術(shù)后1、6、12、24、48 h的BBB評分均明顯下降（P＜0.05）。術(shù)后48 h取脊髓組織進行RT－qPCR實驗，結(jié)果顯示，與Sham組比較，SCI組大鼠脊髓組織中HOTAIR水平明顯降低（P＜0.05），miR－17水平明顯升高（P＜0.05）；與Control組比較，OGD組處理的SY－SH5Y細胞中HOTAIR水平明顯降低，miR－17水平明顯升高（P＜0.05）。詳見圖1～圖3。

2.2 HOTAIR對自噬和神經(jīng)元凋亡的影響

與Control組比較，OGD組細胞中HOTAIR水平明顯降低，神經(jīng)元凋亡率明顯升高，LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋Vector組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR組細胞中HOTAIR水平明顯升高，神經(jīng)元凋亡率明顯降低，LC3Ⅱ蛋白表達升高，P62蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋pcDNA－HOTAIR組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR＋3－MA組細胞中HOTAIR表達無明顯變化（P＞0.05），神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高（P＜0.05）。詳見圖4～圖6。

2.3 HOTAIR靶向miR－17

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與NC mimic組比較，miR－17 mimic與HOTAIR－3′－UTR－WT共轉(zhuǎn)染時的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR－17 mimic與HOTAIR－3′－UTR－MUT共轉(zhuǎn)染時的熒光素酶活性無明顯性變化（P＞0.05）；RT－qPCR實驗結(jié)果顯示，與Vector組比較，pcDNA－HOTAIR組細胞中miR－17表達明顯降低（P＜0.05）。詳見圖7。

2.4 miR－17靶向Beclin－1

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與NC mimic組比較，miR－17 mimic與Beclin－1－3′－UTR－WT共轉(zhuǎn)染時的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR－17 mimic與Beclin－1－3′－UTR－MUT共轉(zhuǎn)染時的熒光素酶活性無明顯性變化（P＞0.05）；RT－qPCR和Western Blotting實驗結(jié)果顯示，與NC mimic組比較，miR－17 mimic組細胞中Beclin－1的mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。詳見圖8～圖10。

2.5 HOTAIR通過miR－17/Beclin－1通路對自噬和凋亡的影響

與OGD＋Vector組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR組細胞中miR－17蛋白表達明顯降低，神經(jīng)元凋亡率明顯降低，Beclin－1和LC3Ⅱ蛋白表達升高，P62蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組細胞中miR－17蛋白表達明顯升高，神經(jīng)元凋亡率明顯升高，Beclin－1和LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖11～圖13。

2.6 HOTAIR過表達對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能的影響

與Vector組比較，pcDNA－HOTAIR組大鼠在脊髓損傷后12～48 h的BBB評分明顯升高，HOTAIR表達升高，miR－17表達降低，LC3Ⅱ蛋白表達明顯升高，而P62蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖14～圖15。

3 討 論

脊髓損傷是一種嚴重的神經(jīng)創(chuàng)傷，但其發(fā)病機制和關(guān)鍵影響因素尚未明確闡明。神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)元丟失的主要因素，與脊髓損傷的發(fā)展有關(guān)［11］。研究表明，自噬與脊髓損傷誘導的神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)［12］。然而，其機制仍有待闡明。本研究通過構(gòu)建脊髓損傷體內(nèi)體外模型來闡明LncRNA HOTAIR在脊髓損傷中的作用及其與自噬和凋亡的關(guān)系，這一研究可能為脊髓損傷的治療和預后評估提供新的有效靶點。

LncRNAs對細胞自噬或凋亡的調(diào)節(jié)作用已在人類疾病中得到證實。如LncRNA MALAT1通過誘導自噬抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡［13］。LncRNAs還可以調(diào)節(jié)脊髓損傷的啟動和進展，主要是通過影響細胞自噬或凋亡，如LncRNA SNHG5通過上調(diào)Krueppel樣因子4（KLF4）來增強星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活力促進創(chuàng)傷性脊髓損傷［14］。在急性脊髓損傷中，敲除LncRNA BDNF－AS抑制神經(jīng)元細胞凋亡［15］。抑制LncRNA Sox2ot可減少細胞凋亡和自噬從而抑制脊髓損傷［16］。因此，調(diào)節(jié)LncRNA的表達有可能通過抑制自噬來減輕脊髓損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR在OGD處理的SY－SH5Y細胞中降低，且LncRNA HOTAIR抑制細胞凋亡，而當用自噬抑制劑3－MA刺激時，細胞凋亡率升高，表明LncRNA HOTAIR通過誘導自噬抑制神經(jīng)元凋亡，揭示了LncRNA HOTAIR在脊髓損傷中的神經(jīng)保護作用，有利于脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復。因此，選擇LncRNA HOTAIR進行下一步的研究。

證據(jù)表明，大多數(shù)LncRNAs通過作為miRNAs的競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）調(diào)節(jié)疾病的起始和進展［17］。LncRNA XIST通過競爭性結(jié)合miR－494促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)元凋亡，參與脊髓損傷的發(fā)病機制［18］。MALAT1通過調(diào)節(jié)miR－204在脊髓缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用［19］。此外，研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs作為ceRNAs在各種疾病的發(fā)展中調(diào)節(jié)自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR在脊髓損傷大鼠模型和細胞模型中低表達，而miR－17高表達，并且LncRNA HOTAIR靶向miR－17并負調(diào)節(jié)miR－17的表達。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR通過靶向miR－17增強自噬從而改善神經(jīng)元細胞凋亡和緩解脊髓損傷。miR－17是一種新型miRNA，與多種癌癥密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR－17－5p通過靶向Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）促進胃癌細胞增殖和侵襲性［20］。miR－17通過靶向軸突生長誘向因子4（NTN4）誘導乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移［21］。研究表明在脊髓損傷后的神經(jīng)元損傷中，敲除miR－17可能有助于脊髓損傷治療［22］。然而，miR－17與脊髓損傷之間的關(guān)系尚未闡明。Beclin－1是一種關(guān)鍵的自噬相關(guān)蛋白和凋亡調(diào)節(jié)因子［23］，據(jù)報道，在脊髓神經(jīng)元中，Beclin－1過表達明顯增強自噬并逆轉(zhuǎn)機械損傷誘導的細胞凋亡，提示Beclin－1在脊髓損傷中促進自噬和保護神經(jīng)元免于凋亡的作用［24］。此外，白藜蘆醇通過激活自噬和抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路介導的細胞凋亡來保護脊髓損傷［3］。以上研究表明，Beclin1在調(diào)節(jié)自噬、神經(jīng)元凋亡和脊髓損傷發(fā)展中具有重要作用。本研究證實了miR－17通過調(diào)控Beclin－1在自噬、凋亡和脊髓損傷進展中的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HOTAIR在脊髓損傷大鼠模型和OGD細胞模型中低表達，而miR－17高表達，過表達LncRNA HOTAIR通過miR－17/Beclin－1途徑增強自噬減少神經(jīng)元細胞凋亡和改善脊髓損傷。因此，本研究可能為脊髓損傷的治療提供新的策略。然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，需要探索更多LncRNA HOTAIR的潛在靶點，尋找對神經(jīng)元自噬、凋亡、脊髓損傷影響最大的最佳miRNA。此外，許多miR－17的其他靶向基因和miR－17的其他內(nèi)源性競爭RNA也值得在未來進一步研究。

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（收稿日期：2022－02－12）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項目 河南省醫(yī)學科學研究重點課題計劃基金項目（No.202102310398）

引用信息 趙俊，陳勇，吳春芳.LncRNA HOTAIR調(diào)節(jié)細胞自噬對脊髓損傷模型神經(jīng)元凋亡的保護作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（1）：79－87.