龔智君　江宇寧　張淑潔　王修明　朱堯　蔣衛(wèi)民

摘要 目的：通過評價高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖高血壓大鼠合并代謝相關(guān)性脂肪肝的病變程度，初步探索血脂康改善肥胖自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）合并代謝相關(guān)性脂肪肝的作用機制。方法：將24只6周齡的雄性SHR隨機分為普通飲食組（STD組）、高脂飲食組（HFD組）、普通飲食血脂康治療組（STD－X組）、高脂飲食血脂康治療組（HFD－X組），每組6只。STD－X組、HFD－X組予以血脂康灌胃，STD組、HFD組予以生理鹽水灌胃。實時監(jiān)測大鼠體質(zhì)量、血壓變化；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組SHR肝臟游離脂肪酸（FFA）和三酰甘油（TG）水平；蘇木精－伊紅（HE）及油紅O染色觀察各組大鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化；蛋白免疫印跡法檢測各組SHR肝臟組織中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子－1α（PGC－1α）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1－a（CPT1－a）的蛋白表達。結(jié)果：與HFD組比較，HFD－X組大鼠血壓、體質(zhì)量均有降低趨勢，其中舒張壓降低明顯（P＜0.05）。與HFD組比較，HFD－X組肝臟TG及FFA水平均明顯降低（P＜0.05），肝臟脂肪變性程度明顯減輕。與STD組相比，HFD組PPARα、PGC－1α、CPT1－a蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）；STD－X組PPARα、PGC－1α、CPT1－a蛋白表達量均升高（P＜0.05）；與HFD組相比，HFD－X組PPARα、PGC－1α、CPT1－a蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：血脂康通過上調(diào)PPARα/PGC－1α信號通路多個蛋白的表達，降低高脂喂養(yǎng)的SHR大鼠的血壓，減輕其體質(zhì)量，改善其合并代謝相關(guān)性脂肪肝導(dǎo)致的肝內(nèi)脂肪堆積與肝細胞脂肪變性等。

關(guān)鍵詞 自發(fā)性高血壓；代謝相關(guān)性脂肪肝；肥胖；血脂康；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.008

近年來，我國高血壓及其并發(fā)癥的患病率逐漸升高［1］，其中，肥胖合并高血壓的發(fā)病率明顯增加［1］。肥胖是一種慢性代謝疾病，代謝相關(guān)性脂肪肝（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是其最常見的并發(fā)癥之一。2021年5月中國肝病學(xué)會發(fā)布的一項共識指出：支持將非酒精性脂肪肝（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）重新定義為MAFLD，并將診斷標準定義為：肝活檢組織學(xué)或影像學(xué)或血液生物標志物檢查提示脂肪肝；同時合并超重/肥胖或2型糖尿病，或存在代謝功能障礙［2］。據(jù)統(tǒng)計，目前MAFLD的全球患病率約為25%［3］。研究表明，代謝紊亂與心血管不良事件（如腦卒中、心肌梗死、心力衰竭）相關(guān)且增加心血管疾病的死亡風(fēng)險［4－5］。高血壓是最常見的心血管危險因素，在合并肥胖及代謝紊亂的人群中尤為突出。但傳統(tǒng)意義上的非酒精性脂肪肝與許多其他代謝疾病無關(guān)［6］。因此，MAFLD可能是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)［7］。肥胖高血壓和MAFLD常常同時出現(xiàn)，是一種綜合性的代謝紊亂疾病。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators－activated receptors，PPARs）在人體內(nèi)多個組織中都有表達，發(fā)揮促進脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）的攝取、轉(zhuǎn)運和氧化，參與能量代謝平衡的功能。脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator－activated receptor α，PPARα），并誘導(dǎo)PPARα調(diào)控的下游基因表達，降解上述中間產(chǎn)物，降低三酰甘油（triglyceride，TG）和FFA水平，可以減少肌肉中脂肪的含量，調(diào)節(jié)脂聯(lián)素從而增高胰島素敏感性，這些對肝臟的健康都至關(guān)重要［8］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子－1α（peroxisome proliferator－activated receptor γ coactivator－1α，PGC－1α）是過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator－activated receptor γ，PPARγ）的轉(zhuǎn)錄共激活因子，目前被認為是參與線粒體能量代謝的主要調(diào)節(jié)因子。PGC－1α調(diào)節(jié)中樞代謝功能，包括線粒體代謝、細胞分化、血管生成和炎癥［9］。肝臟是協(xié)調(diào)人體新陳代謝的重要器官，其代謝機制復(fù)雜且與多種分子的交互相關(guān)，而越來越多的研究證明，PPARα/PGC－1α信號通路在肝臟的動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。PPARα及其輔助激活物PGC－1α均可在一定程度上影響肥胖高血壓合并MAFLD帶來的一系列代謝紊亂問題，兩者共同上調(diào)肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1－a（carnitine palmitoyl transferase 1－a，CPT1－a）的表達，提高機體脂肪酸氧化水平，從而改善肥胖高血壓合并MAFLD病人的炎癥反應(yīng)和脂肪堆積，降低心血管事件的風(fēng)險。既往研究發(fā)現(xiàn)，血脂康也是一種PPARα激動劑，能夠參與調(diào)控PPARα相關(guān)的生物途徑。中國冠心病二級預(yù)防研究［10］為血脂康的應(yīng)用提供了充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。本實驗旨在探討血脂康是否可以通過PPARα/PGC－1α信號通路干預(yù)肥胖高血壓合并MAFLD。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只無特定病原體（SPF）級雄性6周齡左右自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR），初始體質(zhì)量100～120 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供［生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012－0001］，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心，動物房的溫度維持在（23±1）℃，濕度保持在（55±10）%，并且維持12 h光/暗循環(huán)；動物房通風(fēng)良好，實驗動物可在籠內(nèi)自由活動，每周更換墊料2次，大鼠可以自由獲得食物和水。實驗開始前給予實驗動物2周適應(yīng)動物房環(huán)境的飼養(yǎng)時間，之后將24只SHR隨機分為普通飲食組（STD組）、高脂飲食組（HFD組）、普通飲食血脂康治療組（STD－X組）、高脂飲食血脂康治療組（HFD－X組），每組6只。STD組、STD－X組大鼠連續(xù)16周給予普通飼料（由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供）；HFD組、HFD－X組大鼠連續(xù)16周給予高脂飼料（D12492，Research Diets，USA）。

1.2 實驗藥物

血脂康膠囊，國藥準字Z10950029，北京北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要試劑和儀器

TG試劑盒（南京建成生物研究工程所，貨號：A110－1－1）；Free Fatty Acid Assay（Abcam，貨號：Ab6534）；油紅O染液（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G1016）；蘇木精－伊紅（HE）染液（武漢谷歌生物，貨號：G1005）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（Servicebio，貨號：G2026）；β－actin（Servicebio，貨號：GB12001）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔（Servicebio，貨號GB23303）；HRP標記山羊抗大鼠（Servicebio，貨號：GB23302）。臺式高速冷凍離心機（大龍，型號：D3024R）；酶標檢測儀（BioTeK，型號：Epoch）；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：Chemray 800）；電泳儀（Servicebio，型號：BV－2&BT－2）。

1.4 實驗方法

1.4.1 干預(yù)方法

在實驗開始的第1周， STD－X組、HFD－X組大鼠均予以血脂康（溶解于生理鹽水中）300 mg/（kg·d）灌胃，STD組及HFD組大鼠采用等劑量生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃16周。在實驗期結(jié)束時（即第16周），腹腔注射過量的戊巴比妥鈉（250 mg/kg）處死大鼠。采血后，取出肝臟組織，稱重，記錄肝臟質(zhì)量并儲存于－80 ℃冰箱中待檢。

1.4.2 一般指標檢測

各組大鼠每周稱重1次，每只大鼠連續(xù)測量3次體質(zhì)量，取其平均值。在第12周，采用尾套法無創(chuàng)測量各組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）［11］。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測FFA和TG水平

ELISA檢測各組肝臟FFA和TG水平，按照試劑盒說明書操作，之后于酶標儀上在不同波長下測各孔OD值，根據(jù)OD值計算出實際濃度。

1.4.4 HE染色及油紅O染色觀察肝臟病理學(xué)變化

通過HE染色、油紅O染色觀察各組大鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化，按照常規(guī)取材、脫水、包埋、切片、染色、觀察等途徑進行操作，評價血脂康干預(yù)后SHR肝臟形態(tài)和變性程度，取材部位均為大鼠肝臟最大葉。

1.4.5 免疫蛋白印跡法（Western Blot）檢測肝臟組織中PPARα、PGC－1α、CPT1－a的蛋白表達水平

采用Western Blot檢測各組肝臟組織中PPARα、PGC－1α、CPT1－a的蛋白表達水平。將大鼠肝臟組織蛋白提取后用試劑盒測定蛋白濃度并于100 ℃下煮15 min進行蛋白變性，之后進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉。按照抗體說明書，配制一抗溶液，4 ℃冰箱搖床過夜。次日洗脫后再將二抗按比例稀釋后，然后加入孵育槽中，放置搖床上慢搖，室溫下孵育30 min；最后將聚偏二氟乙烯膜與混合好的化學(xué)發(fā)光試劑充分反應(yīng)，用顯影、定影試劑進行顯影和定影，并用Image－J軟件對條帶進行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血脂康對大鼠體質(zhì)量及血壓的影響

從第7周開始，HFD組大鼠的體質(zhì)量開始明顯高于STD組（P＜0.05），隨著高脂喂養(yǎng)時間的推進，這種差距逐漸明顯，并且HFD組大鼠的體質(zhì)量開始超過STD組的20%，證明肥胖高血壓模型造模成功。在第16周，與HFD組相比，HFD－X組大鼠的體質(zhì)量明顯下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第12周，與HFD組相比，HFD－X組DBP明顯降低（P＜0.05），且MAP也有所降低。詳見圖1～圖4。

2.2 血脂康對大鼠肝臟TG和FFA的影響

與STD組比較，HFD組大鼠肝臟FFA、TG水平明顯上升（P＜0.05）；與HFD組比較，HFD－X組大鼠肝臟FFA、TG水平明顯下降明顯（P＜0.05）。詳見圖5。

2.3 血脂康對大鼠肝臟形態(tài)及變性程度的影響

HE染色結(jié)果顯示，STD組大鼠肝細胞形態(tài)規(guī)則，未見明顯的肝細胞壞死，也未見明顯的肝細胞脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞排列較為整齊，未見較大的脂肪空泡及明顯的炎性細胞浸潤。HFD組大鼠肝細胞脂肪變性非常明顯，且肝細胞排列紊亂，可見明顯的大小不等、數(shù)量不同的脂肪空泡，肝細胞排列混亂，較多肝細胞腫脹變性，胞質(zhì)疏松，染色偏淡。而經(jīng)過血脂康治療的HFD－X組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較為完整，肝細胞排列相對整齊，脂肪變性明顯減輕，脂肪空泡體積縮小及數(shù)量明顯減少。詳見圖6。

油紅O染色結(jié)果顯示，與STD組相比，HFD組大鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，油紅O染色面積明顯增大，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量明顯高于STD組。與HFD組比較，HFD－X組大鼠油紅O染色面積明顯縮小，細胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)量明顯減少，脂質(zhì)含量明顯降低。詳見圖7。

2.4 血脂康對大鼠肝臟組織中PPARα、PGC－1α、CPT1－a蛋白表達水平的影響

與STD組相比，HFD組PPARα、PGC－1α、CPT1－a的蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），STD－X組PPARα、CPT1－a、PGC－1α蛋白表達量均增高（P＜0.05）；與HFD組相比，HFD－X組PPARα、PGC－1α、CPT1－a的蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）。詳見圖8～圖10。

3 討 論

隨著世界肥胖發(fā)生率的不斷增加，肥胖高血壓合并各類代謝疾病的風(fēng)險也與日俱增，當(dāng)前的流行病學(xué)也已經(jīng)明確將肥胖和高血壓的風(fēng)險聯(lián)系起來［12］。在藥物治療方面，現(xiàn)有的西藥不能完全滿足肥胖高血壓合并MAFLD病人的需求，而中藥具有多層次、多成分、綜合調(diào)控的特點，且臨床應(yīng)用歷史悠久，有望成為新藥開發(fā)的最有效來源之一。血脂康是由紅曲發(fā)酵生產(chǎn)的，在我國被歸類為處方藥而不是膳食補充劑，既往的大量臨床研究證實血脂康有確切的降脂療效［13］。前期的實驗研究表明，血脂康可以改善內(nèi)臟組織的脂肪堆積，從而一定程度上改善肥胖導(dǎo)致的一系列代謝紊亂［14］。

PPARα可以有效改善MAFLD病人的糖脂代謝，減輕炎癥反應(yīng)，因此，PPARα激動劑有望成為治療本病的新型藥物［15］。PGC－1α是PPARα的輔助激活物，與PPARα結(jié)合后能夠共同上調(diào)相關(guān)β氧化酶（如CPT1－a）的表達量，提高肝臟、β氧化水平，進而改善肝臟內(nèi)脂肪堆積的現(xiàn)象。

SHR是理想的類似于人類原發(fā)高血壓的動物模型，尤其是雄性SHR，其伴隨的心血管疾病發(fā)病率高，是建立肥胖高血壓大鼠動物模型的理想造模對象。通過高脂喂養(yǎng)，SHR可以呈現(xiàn)明顯的肥胖體征，其內(nèi)臟脂肪的蓄積及代謝紊亂的表現(xiàn)較為明顯。本研究通過高脂喂養(yǎng)SHR獲得肥胖高血壓大鼠模型，因為采用高脂喂養(yǎng)，SHR的TG在肝臟中過多蓄積，造成了MAFLD的發(fā)生。采用血脂康干預(yù)后，HFD－X組SHR的DBP較HFD組明顯下降，且DBP、MAP值均低于HFD組。在第16周，HFD－X組大鼠體質(zhì)量較HFD組明顯下降，說明血脂康有一定的減重作用。HFD－X組大鼠肝臟FFA、TG水平明顯低于HFD組（P＜0.05），提示血脂康一定程度上可以減輕肥胖SHR肝臟中TG和FFA的堆積，降低肝臟內(nèi)的脂肪堆積程度。在肝臟中，通過病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，HFD－X組大鼠無論在肝臟細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列，還是在脂滴數(shù)量及脂肪變性程度方面均明顯優(yōu)于HFD組。與HFD組相比，HFD－X組PPARα、PGC－1α、CPT1－a的蛋白表達量明顯升高，表明血脂康通過PPARα/PGC－1α信號通路減輕高脂喂養(yǎng)的SHR的血壓、體質(zhì)量，改善其合并MAFLD導(dǎo)致的肝細胞脂肪變性等，從而改善肥胖高血壓合并MAFLD導(dǎo)致的綜合代謝紊亂。但血脂康改善肥胖高血壓合并MAFLD的機制還有待進一步研究。

綜上所述，高脂喂養(yǎng)的SHR兼顧了肥胖、高血壓、MAFLD、代謝紊亂等多個體征，血脂康通過上調(diào)PPARα/PGC－1α信號通路相關(guān)蛋白的表達，在減輕肥胖高血壓大鼠體質(zhì)量、降低其血壓的基礎(chǔ)上，同時改善大鼠肝臟內(nèi)FFA、TG堆積，減輕肝細胞脂肪變性，從而有效干預(yù)肥胖高血壓合并MAFLD。

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（收稿日期：2022－08－09）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項目 江蘇省自然科學(xué)基金項目（No.BK20181503）；江蘇省科技重點研發(fā)項目（No.BE2017775）

通訊作者 蔣衛(wèi)民，E－mail：jwm0410@njucm.edu.cn

引用信息 龔智君，江宇寧，張淑潔，等.血脂康干預(yù)肥胖高血壓合并代謝相關(guān)性脂肪肝的作用機制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（1）：46－51.