白淑坤，劉 凱，趙芬芬

（1.鄭州黃河護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 450066；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.鄭州黃河護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 450066）

黃芪（Astragalus membranaceus）又名黃耆，是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao 和膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge. 的干燥根（司晶晶等，2022），多生長在我國東北、華北、西北等地區(qū)。黃芪多糖作為黃芪的重要組成成分，具有極強(qiáng)的免疫活性（蔡明燴等，2021）和抗衰老、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等功效（穆飛艷等，2022）。近年來，隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告規(guī)定禁止在我國飼料產(chǎn)品中添加含有除中藥類以外的促生長類藥物飼料添加劑（郭盛等，2020），畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)更致力于天然中草藥飼料添加劑的開發(fā)與研究，以減少禁用傳統(tǒng)抗生素后對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的沖擊。目前，專家學(xué)者將黃芪多糖作為飼料添加劑開展了諸多研究，獲得了良好的效果（桂文龍和李巨銀，2023 ；于阿男等，2023 ；張璽等，2023）。因此，從黃芪中提取黃芪多糖在飼料領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。當(dāng)前，黃芪多糖主要的提取制備方法有水提醇沉法（權(quán)彥等，2018）、堿溶提取法（謝丹丹等，2019）、堿醇提取法（田洛等，2006）、酶輔助提取法（張曉偉等，2007）、超聲輔助提取法（朱雙雙等，2022）和生物發(fā)酵提取法（陳麗艷等，2011）等。其中超聲輔助提取法具有省時(shí)高效且提取雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究以黃芪為原料，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃芪多糖的超聲輔助提取工藝，旨在進(jìn)一步推動黃芪多糖在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用與開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 黃芪（甘肅省定西市隴西縣，三年生栽培黃芪）：市售。無水乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 FJ-7200 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平AL204，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；JXFSTPRP-11-01 型液氮冷凍低溫粉碎機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋H-8，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；TGL16M 型冷凍離心機(jī)，長沙英泰儀器有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101A-3ET 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司。

1.3 黃精多糖的提取與含量測定

1.3.1 原料處理 將黃芪洗凈切片后置于鼓風(fēng)干燥箱烘干，再用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉，過40 目篩。稱取黃芪粉末樣品置于圓底燒瓶中，加入10 倍量的80% 乙醇，回流提取3 次，每次2 h，去除醇溶類雜質(zhì)?；亓魈崛『?0℃烘干備用。

1.3.2 黃芪多糖的提取 精密稱取1.3.1 處理過的黃芪粉末5 g 于錐形瓶中，加入適量去離子水?dāng)嚢杈鶆?，置于超聲儀中，控制料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行超聲輔助提取。提取后離心得到濾液，稀釋至50 mL 的黃芪多糖待測液。

1.3.3 最大吸收波長的確定 取1.3.2 黃芪多糖提取物，采用苯酚—硫酸法（藍(lán)永鋒和歐國燈，2014）在紫外分光光度計(jì)400 ～900 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1 所示。可以看出，在波長為488.2 nm 出現(xiàn)峰值，故確定488 nm 為測定波長。

圖1 提取物紫外光譜分析圖

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及提取率

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取對照品D-葡萄糖10.0 mg，加入適量蒸餾水，配置濃度為

1.0 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液于100 mL 容量瓶中，依次加入0.5 mL 的5% 苯酚溶液和5 mL的98% 濃硫酸溶液，混合均勻后置于沸水浴中加熱20 min，冷卻后加蒸餾水至容量刻度。用紫外分光光度計(jì)在波長488 nm 處分別測其吸光度值。以D- 葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，吸光度作為坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：Y ＝0.0129X+0.0197，R2＝0.9963。見表1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 μg/mL

1.3.4.2 黃芪多糖提取率的計(jì)算 計(jì)算公式如下：

式中：A 為黃芪多糖提取液吸光度；n 為稀釋的倍數(shù)；V 為黃芪多糖提取液總體積，mL；m為黃芪的質(zhì)量，g。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取5 g 黃芪粉末于反應(yīng)瓶中，對提取溫度、提取時(shí)間、料液比和超聲功率4 個(gè)因素進(jìn)行研究，固定其中3 個(gè)因素處于中間水平，改變第4 個(gè)因素進(jìn)行。

正交試驗(yàn)：選擇提取溫度、提取時(shí)間、料液比和超聲功率為研究因素，以黃芪多糖的提取率為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），優(yōu)化最佳提取工藝條件，因素及水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對提取率的影響 按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定料液比為1 ∶20（g/mL），提取時(shí)間為30 min，超聲功率為300 W，改變提取溫度為40、50、60、70、80℃。

由圖2 可知，隨著提取溫度的升高，黃芪多糖的提取率呈先升高后降低的狀態(tài)。當(dāng)提取溫度為70℃時(shí)，黃芪多糖的提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)樽畛蹼S著溫度的升高，分子熱運(yùn)動加快，致使黃芪多糖的溶解度增加，所以提取率增加，但溫度一旦過高后，高溫會導(dǎo)致黃芪多糖結(jié)構(gòu)被破壞，多糖分子量降低，從而出現(xiàn)提取率下降的情況（余萍等，2021）。

圖2 提取溫度對提取率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對提取率的影響 按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定料液比為1 ∶20（g/mL），提取溫度為70℃，超聲功率為300 W，改變提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min。

由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的增加，黃芪多糖的提取率呈先升高后降低的狀態(tài)。當(dāng)提取時(shí)間為20 min 時(shí)，黃芪多糖的提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槌暡▽?xì)胞膜的破碎作用隨時(shí)間的延長而增大，致使多糖溶出量增加，但隨著超聲波提取時(shí)間的進(jìn)一步延長，超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，可使多糖斷裂，并且時(shí)間過長還會使溶解的雜質(zhì)增多，導(dǎo)致黃芪多糖提取率降低（呂幫玉等，2009）。

圖3 提取時(shí)間對提取率的影響

2.1.3 料液比對提取率的影響 按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定提取溫度為70℃，提取時(shí)間為20 min，超聲功率為300 W，改變料液比為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）。

由圖4 可知，隨著料液比的增加，黃芪多糖的提取率持續(xù)提高，但當(dāng)料液比＞1 ∶15（g/mL）時(shí)，黃芪多糖的提取率增長較為緩慢。這是因?yàn)殡S料液比的增加，單位質(zhì)量黃芪的提取溶劑增加，而提取溶劑增加，有利于黃芪多糖的溶解，使提取率不斷增加。但當(dāng)料液比超過1 ∶15（g/mL）時(shí)，黃芪中的黃芪多糖絕大部分已被提取出來，再增加料液比，提取率盡管有所增加，但基本趨于不變（郭曉莎和劉軍海，2023）。因此，綜合考慮得率、溶劑用量和溶劑回收幾方面，選取1 ∶15（g/mL）作為最佳料液比。

圖4 料液比對提取率的影響

2.1.4 超聲功率對提取率的影響 按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定提取溫度為70℃，提取時(shí)間為20 min，料液比為1 ∶15（g/mL），改變超聲功率為100、200、300、400、500 W。

由圖5 可知，隨著超聲功率的增大，黃芪多糖的提取率呈先升高后降低的狀態(tài)。當(dāng)超聲功率為300 W 時(shí)，黃芪多糖的提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)樵谝欢üβ史秶鷥?nèi)，超聲功率增大帶來的空化效應(yīng)增強(qiáng)，有利于提取溶劑進(jìn)入黃芪內(nèi)部，加速黃芪多糖的溶解，提取率不斷增加。但隨著功率的進(jìn)一步增強(qiáng)，空化效應(yīng)的進(jìn)一步增強(qiáng)會導(dǎo)致多糖糖苷鍵斷裂，進(jìn)而造成降解，提取率反而降低（朱雙雙和楊濤，2022）。

圖5 超聲功率對提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn) 由表3 可知，4 個(gè)因素對多糖得率影響從大到小依次為提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度＞超聲功率，提取黃芪多糖的最佳條件為A3B2C3D2，即提取溫度為80℃，提取時(shí)間為20 min，料液比1 ∶20（g/mL），超聲功率為300 W，在此條件下，黃芪多糖的提取率為9.87%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

超聲波輔助提取法已被廣泛應(yīng)用于黃芪多糖的快速提取，由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，黃芪多糖最佳提取條件為提取溫度80℃，提取時(shí)間20 min，料液比為1 ∶20（g/mL），超聲功率為300 W，在此條件下，黃芪多糖的提取率為9.87%。