宋亞南，王 云，張 村*，楊洪軍,

1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700

2.中國中醫(yī)科學院，北京 100700

高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝異常疾病，具體表現(xiàn)為血液循環(huán)中總膽固醇、總三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平的升高和/或高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平的降低[1]。辣木葉為辣木科辣木屬熱帶落葉喬木辣木MoringaoleiferaLam.的干燥葉，原產(chǎn)于印度等南亞國家，如今，在我國云南等地已形成一定的種植規(guī)模。據(jù)報道，辣木葉在降脂方面效果明顯，早在《印度阿育吠陀藥典》中就有記載，辣木葉可除風止痛、明目清腦、潤膚殺蟲，主治寄生蟲、水腫、脂類病、脾胃病等[2]?，F(xiàn)代研究表明，辣木葉提取物能夠有效降低3T3-L1 細胞中脂肪的生成[3]，甲醇提取物能降低糖尿病大鼠血清LDL-C 的水平并提高HDL-C 水平[4]，黃酮類成分可提高HDL-C 對血漿及外周組織膽固醇的清除能力[5-6]。辣木葉中化學成分種類豐富，除維采寧-2、異槲皮素、紫云英苷等黃酮類成分外，還富含新綠原酸、隱綠原酸等有機酸類成分、L-色氨酸等氨基酸類成分等。但目前，有關辣木葉中真正能夠發(fā)揮調(diào)血脂作用的關鍵性成分尚不清楚。

中藥質(zhì)量標志物（quality markers，Q-Marker）是為規(guī)范中藥質(zhì)量評價研究而提出的概念，其以“五原則”為核心，關聯(lián)質(zhì)量控制與藥效，是與中藥功能屬性密切相關的化學物質(zhì)，是存在于中藥材或中藥產(chǎn)品中固有的或加工過程中產(chǎn)生的成分，同時也是方劑中的君藥兼顧臣、佐使藥的代表性成分[7]。目前，辣木葉的質(zhì)量評價研究主要集中在指紋圖譜、含量測定等方面，尚未見對其QMarkers 的研究。

特征圖譜具有整體性與動態(tài)性的特點，能客觀反映中藥材所含成分，可揭示成分的特征性、溯源性及可測性。網(wǎng)絡藥理學可從藥物-疾病-靶點-通路全方位解析藥材的成分-藥效的關聯(lián)，從而體現(xiàn)成分的有效性及配伍的合理性?；诖?，本研究以“五原則”為指導，以特征圖譜-化學計量學結合網(wǎng)絡藥理學-分子對接研究模式確定辣木葉用于高脂血癥的Q-Markers，進一步對Q-Marker 進行含量測定，旨在為辣木葉質(zhì)量控制及臨床應用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，日本島津公司；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀和6520 Q-TOF 四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；XS105DU 型1/10 萬分析天平，梅特勒-托利多公司；BSM-3 200.2 型百分之一電子天平，上海卓精電子科技有限公司；LD-T100A 型高速萬能粉碎機，上海頂帥電器有限公司；KQ-300B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-61 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇杰瑞爾電器有限公司。

1.2 試劑與試藥

維采寧-2 對照品（批號PS000897），購自成都普思生物科技股份有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；L-色氨酸（批號 CHB190220），新綠原酸（批號CHB190217），隱綠原酸（批號CHB170828），異槲皮素（批號 CHB160506），紫云英苷（批號CHB181115）均購自成都克洛瑪生物有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%。印度種改良種（PKM1 型）辣木葉15 批均購自云南天佑科技開發(fā)有限公司，經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所李志勇研究員鑒定為辣木科辣木屬辣木M.oleiferaLam.的干燥葉，樣品信息見表1。水為娃哈哈純凈水，乙腈，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.3 數(shù)據(jù)庫與軟件

PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），SEA 數(shù)據(jù)庫（https://sea.bkslab.org/），UniProt 數(shù)據(jù)庫（ https://www.uniprot.org/ ），Genecards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），Venny 2.1 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），String 數(shù)據(jù)庫（https://cn.stringdb.org/），KOBAS 平臺（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/in），DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），ImageGP 平臺（http://www.ehbio.com/ImageGP/），蛋白結構數(shù)據(jù)庫（PDB，https://www.rcsb.org/），Cytoscape 3.8.2 軟件和Discovery studio 2016 軟件。

2 基于HPLC 特征圖譜-化學計量學的Q-Markers初步篩選

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、維采寧-2、異槲皮素、紫云英苷等6 個對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇水使溶解并定容至刻度，制成適宜濃度的對照品溶液，吸取適量母液，配制成質(zhì)量濃度分別為79.20、88.80、38.00、15.47、39.68、86.10 μg/mL 混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取辣木葉粉末（過4 號篩）0.2 g，精密稱定，置25 mL 圓底燒瓶中，精密加入10 mL 50%甲醇溶液，稱定質(zhì)量，加熱回流提取60 min，放冷。用50%甲醇水補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，得供試品溶液。

2.3 檢測條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱 Phenomenex Luna C18(2)100A（250 mm×4.6 mm，5 μm），波長254 nm，體積流量0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量5μL；流動相乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（0～20 min，5%～13% A；20～40 min，13%～18% A；40～50 min，18%～30% A；50～60 min，30%～60% A；60～70 min，60%～100% A；70～72 min，100% A）。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子檢測模式（ESI+、ESI?），氮氣作去溶劑化氣體。毛細管電壓為3.5 kV，碎片電壓120 V，碰撞能量為65 eV，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣體積流量11.0 L/min，霧化器壓力275.79 kPa，；掃描模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 700。

2.4 特征圖譜方法學考察

2.4.1 參照峰的選擇 本實驗在254 nm 下檢出了8 個主要共有峰。采用HPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定出了這8 個共有峰，通過對照品比對及文獻[8-12]確認了其中6 個色譜峰。供試品及對照品色譜圖見圖1，總離子流圖見圖2，鑒定結果見表2。5 號峰峰面積較高、分離度良好，穩(wěn)定、無其他峰干擾，且經(jīng)對照品指認為異槲皮素，故以5 號峰為參照峰。

圖1 辣木葉供試品Y10 (A) 及混合對照品 (B) 的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sample Y10 (A) and mixed reference standards (B)

2.4.2 精密度試驗 稱取辣木葉藥材（Y10，過4 號篩），按“2.2”項下方法制備得到供試品溶液，按

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 稱取辣木葉藥材（Y10，過4 號篩），按“2.2”項下方法制備得到供試品 溶液，在室溫放置0、2、4、8、10、24 h，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，以峰5 為參照峰。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD≤1.8%，相對峰面積RSD≤4.6%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 稱取同一批辣木葉粉末（Y10，過4 號篩）6 份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，以峰5 為參照峰。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD≤1.5%，相對峰面積RSD≤4.5%。表明該方法重復性良好。

2.5 15 批辣木葉的特征圖譜測定

將15 批辣木葉藥材HPLC 色譜文件導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件中，以Y1 作為參照圖譜，時間窗寬度設置為0.1 min，進行多點校正后自動匹配，得到辣木葉HPLC特征圖譜，并生成對照圖譜（圖3），以峰5 作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。

圖3 15 批辣木葉HPLC 圖譜疊加圖Fig.3 HPLC chromatogram of 15 batches of MOLs

圖4 15 批辣木葉的HCA 圖 (A) 及OPLS-DA 圖 (B)Fig.4 HCA diagram (A) and OPLS-DA diagram (B) of 15 batches of MOLs

以生成的對照圖譜作為參照圖譜（R），對15批樣品進行相似度評價，相似度均大于0.967，表明15 批樣品間的特征圖譜共有峰的差異較小。8個共有峰的相對保留時間RSD≤1.1%，相對峰面積的RSD≤22.4%，說明辣木葉不同批次樣品間的特征圖譜中的8 個共有峰在保留時間上差異不大，但峰面積存在較大差異。以上結果說明不同產(chǎn)地的辣木葉含量存在較大差異，可初步反映辣木葉的質(zhì)量屬性特征。

2.6 化學計量學分析

2.6.1 聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）將15 批辣木葉樣品的特征圖譜各峰峰面積導入SIMCA 14.0 進行聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA），15 批辣木葉樣品可根據(jù)樣品間峰面積不同分為5 組。

2.6.2 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）為了更好地觀察不同產(chǎn)地樣品間的組內(nèi)差異，在PCA 分析的基礎上進一步采用SIMCA 軟件進行OPLS-DA 方法進一步分析。在建立的OPLS-DA 模型中R2X（在X軸方向的累積解釋率）分別為0.992，R2Y（在Y軸方向的累積解釋率）分別為0.924，Q2（模型預測率）為0.83，說明建立的OPLS-DA 模型預測率及穩(wěn)定性良好。結合變量重要性投影值（variable importance projection，VIP），可知VIP＞1的色譜峰為4、5、3、1、2（圖5），說明不同產(chǎn)地4、5、3、1、2 號峰分別代表的5 個化學成分（維采寧-2、異槲皮素、隱綠原酸、新綠原酸、L-色氨酸）含量差異較大，是不同產(chǎn)地辣木葉的差異性標志物。

圖5 VIP 圖Fig.5 VIP diagram

3 辣木葉治療高脂血癥的Q-Markers 預測-網(wǎng)絡藥理學

3.1 交集靶點的獲取

將特征圖譜8個成分的典范SMILES（Canonical SMILES）格式文件導入SEA 數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，在Library Search 選項中以Custom Query 進行查找。選擇所有人類相關靶點，去重，共獲得307 個靶點。

以“高脂血癥（hyperlipidemia）”為關鍵詞，檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫（Score≥中位數(shù)），并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白信息轉化為UniProt ID，共獲得777 個靶點。將所得成分靶點基因與疾病靶點基因分別與Uniprot KB 數(shù)據(jù)庫中經(jīng)篩選得到的所有人類已驗證靶點基因庫（更新至20 386 個條目）進行比對，剔除非人類或未經(jīng)驗證的靶點基因（Organism 設置為“Homo sapiens”，Status 設置為“Reviewed”）。獲得成分靶點307 個，高脂血癥靶點717 個，交集靶點35 個（圖6-A）。

圖6 辣木葉治療高脂血癥相關靶點預測Fig.6 Targets of MOLs for hyperlipidemia

3.2 關鍵靶點的獲取

3.2.1 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 將35 個交集靶點通過String 數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析并剔除獨立靶點，共獲得32 個共同靶點（圖6-B）；進行拓撲參數(shù)篩選（Analyze Network），以中位數(shù)為臨界值，以同時滿足中介中心性＞0.007、節(jié)點緊密度＞0.539、連接度＞6.5 的13 個靶點作為關鍵候選靶點。按照連接度值排序為血清白蛋白（serum albumin，ALB）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）、血管緊張素Ⅰ轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）、腎素（ renin，REN ）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、趨化因子家族成員（ C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、醛酮還原酶1 成員B1（aldo-keto reductase family 1 member B1，AKR1B1）、皮質(zhì)激素受體（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、細胞色素P450 家族成員1A1（cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1，CYP1A1）。表明這些靶點可能是治療高脂血癥的關鍵候選靶點。

3.2.2 基于MCODE 模塊的聚類分析 對32 個交集靶點的PPI 網(wǎng)絡圖進行MCODE 模塊分析，設置“Degree Cutoff”為2，“Node Score Cutoff”為0.2，“K-Core”為2，“Max.Depth”為100。共獲得2 個功能模塊，分別命名為MCODE 1 和MCODE 2，節(jié)點個數(shù)分別為11 和3，得分分別為9 和3（圖6-C）。其中，MCODE 1 模塊包括靶點基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、REN、MPO、ACE、IL6、ALB、MMP9、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、VEGFA、IL2、CXCL12。MCODE2 模塊包括靶點丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BCHE）、轉甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）、APP。表明這些靶點模塊可能與辣木葉治療高脂血癥有關。

將2 種方法所得的關鍵靶點取交集（圖6-D），得到9 個靶點（ALB、IL6、VEGFA、MMP9、ACE、REN、MPO、CXCL12、IL2）同時與PPI 網(wǎng)絡及MCODE1 有關，1 個靶點（APP）同時與PPI 網(wǎng)絡及MCODE2 有關。故以此確定10 個靶點為辣木葉治療高脂血癥的關鍵靶點。

3.3 生物信息學分析

將10 個關鍵靶點輸入DAVID 平臺，設置屬性為“Homo sapiens”，進行基因本體（gene ontology，GO）分析；將10 個關鍵靶點輸入KOBAS 平臺，設置屬性為“Homo sapiens”，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。并將P＜0.01 的前10 條通過ImageGP 平臺、微生信平臺進行可視化分析（圖7）。

圖7 GO 分析 (A) 及KEGG 通路分析 (B) 氣泡圖Fig.7 Diagrams of GO analysis (A) and KEGG pathway analysis (B)

GO 分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞定位（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。以P＜0.05 為篩選條件，高脂血癥涉及BP、CC、MF 及KEGG 通路分別為28、4、6、22 個；以P＜0.01 為篩選條件，高脂血癥涉及BP、CC、MF 及KEGG 通路分別為12、3、3、16 個。

GO 分析結果顯示，辣木葉治療高脂血癥主要與細胞凋亡負調(diào)節(jié)、腎臟發(fā)育等生物過程有關，與胞外區(qū)、細胞外液、細胞外外泌體等細胞定位有關，與生長因子活性、肽酶活性等有關。

KEGG 通路富集結果顯示，辣木葉治療高脂血癥主要與產(chǎn)生免疫球蛋白（immunoglobulin A，IgA）的腸道免疫網(wǎng)絡、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、細胞因子-細胞因子受體相互作用、腎素分泌、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3 kinaseprotein kinase B，PI3K-Akt）信號通路等有關。

3.4 “特征成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建

將篩選的特征成分、關鍵靶點及關鍵通路（P＜0.01 的前10 條通路）導入Cytoscape 軟件中，構建“特征成分-關鍵靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡（圖8）。黃色圓形代表特征成分，深綠色方形代表關鍵靶點，淺綠色三角形代表關鍵通路。并計算網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，篩選核心成分、靶點與通路，見表3～5。

圖8 “特征成分-關鍵靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡Fig.8 “Characteristic component-key target-key pathway” network

表3 關鍵通路的拓撲參數(shù)Table 3 Topology parameters of key pathways

表4 關鍵靶點的拓撲參數(shù)Table 4 Topology parameters of key targets

表5 關鍵成分的拓撲參數(shù)Table 5 Topology parameters of key components

根據(jù)拓撲參數(shù)值分別進行通路、靶點、成分的重要性排序。以拓撲參數(shù)大于第一、四分位數(shù)且數(shù)值大于0.01 限定核心通路、靶點及成分。如表3～5 所示，核心通路、靶點、成分分別為3、5、5 個。結果顯示，色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2 等成分可能通過作用于IL6、IL2、MMP9 等靶點，影響細胞因子-細胞因子受體相互作用、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡、PI3K-Akt 等信號通路來發(fā)揮調(diào)血脂的作用。

3.5 分子對接

為了驗證關鍵靶點預測結果的可靠性，采用Discovery studio 2016 軟件對篩選出的部分核心成分和核心靶點進行“LibDock”分子對接。

3.5.1 分子結構預處理 分別從PubChem 和PDB數(shù)據(jù)庫獲取化合物（配體）的SDF 格式文件和核心靶點的3D 靶蛋白復合物結構。采用Discovery Studio 2016 軟件對大分子靶蛋白復合物進行常規(guī)預處理，去除所有水分子，處理蛋白質(zhì)結構、加氫后進行力場優(yōu)化，確定結合位點；獲取小分子的多個構象，加氫，施加力場。

3.5.2 分子對接流程的可靠性驗證 將蛋白質(zhì)3D結構中的原配體抽離，再分別對蛋白結構和原配體結構進行預處理，如果Discovery studio 2016 的均方根偏差值（RMSD）＜0.2 nm（表6），則代表該方法是可靠的[13]。

表6 靶點蛋白的具體信息Table 6 Specific information on target proteins

3.5.3 分子對接結果的可視化 分子對接得分見圖9。L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2 與MMP9 對接得分最高，與IL6 對接得分最高的成分是異槲皮素，與IL-2 對接得分最高的成分是維采寧-2，與MMP9 對接得分最高的成分是隱綠原酸。整體來看，對接結果均大于89.880 分，說明辣木葉候選的Q-Markers 與高脂血癥的關鍵靶點能夠進行高質(zhì)量的對接。

將分子對接的得分較高的結果進行可視化，見圖10。MMP9 可與L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素發(fā)生相互作用，與L-色氨酸以常規(guī)氫鍵作用于其殘基亮氨酸（LEU）418、酪氨酸（TYR）420、甲硫氨酸（MET）422，以π-Alkyl 作用于其殘基纈氨酸（VAL）398，以π-π T-shaped 相互作用于其殘基TYR4423，以π-π Stacked 及Unfavorable Donor-Donor 作用于其殘基組氨酸（HIS）401；與隱綠原酸以常規(guī)氫鍵作用于殘基丙氨酸（ALA）417 和189、谷氨酸（GLU）16、LEU 188，以碳氫鍵作用于脯氨酸（PRO）421、LEU 187，以π-Alkyl 作用于其殘基LEU 418；MMP9 與異槲皮素以常規(guī)氫鍵作用于其殘基谷氨酰胺（GLN）402、ALA 189、LEU 188、TYR 423，以碳氫鍵作用于其殘基PRO 421、HIS 411，以 π-Alkyl 作用于其殘基 VAL 398，以Unfavorable Acceptor-Acceptor 作用于其殘基ALA 189。

圖10 分子對接結果的可視化Fig.10 Visualization of molecular docking results

IL-6 可與異槲皮素發(fā)生相互作用，以常規(guī)氫鍵作用于其殘基絲氨酸（SER）368、天冬氨酸（ASP）318、GLN 369、TYR 159，以Metal-Acceptor 作用于金屬鎂（MG）602，以π-π Stacked 作用于殘基TYR 159、以π-π T-shaped 作用于苯丙氨酸（PHE）372、HIS 160，以π-Alkyl 作用于其殘基異亮氨酸（ILE）336、PRO 322。

IL-2 可與維采寧-2 發(fā)生相互作用，以常規(guī)氫鍵作用于精氨酸（ARG）38、蘇氨酸（THR）41，以碳氫鍵作用于賴氨酸（LYS）35、ALA 73，以π-Alkyl作用于LEU 72。以上結果表明，辣木葉候選的QMarkers 主要依賴于常規(guī)氫鍵、碳氫鍵、π-Alkyl、ππ Stacked、π-π T-shaped 等與氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用，進而實現(xiàn)與高脂血癥關鍵靶點的分子對接。

4 Q-Markers 的含量測定

4.1 對照品溶液的制備

同“2.1”項。

4.2 供試品溶液的制備

同“2.2”項。

4.3 方法學考察

4.3.1 線性關系考察 對辣木葉的經(jīng)對照品指認的6 個成分進行含量測定通過多成分含量測定，對15 批辣木葉進行整體質(zhì)量控制。

取“2.1”項下新綠原酸、L-色氨酸、維采寧-2、異槲皮素、紫云英苷各0.5、1、1、0.5、0.5 mL 定容到5 mL，得到質(zhì)量濃度分別為26.4、29.6、23.8、24.8、24.6 μg/mL 的混合對照品溶液，分別精密量取混合對照品溶液0.5、0.8、1、2 mL 定容到2 mL。并分別精密量取各對照品溶液1、2 mL 定容到2 mL。進樣5 μL，分析并進行線性關系考察。此外，精密量取質(zhì)量濃度為380 μg/mL 的隱綠原酸對照品溶液0.1、0.2、1、1.2、1.5、2 mL，分別定容到2 mL。進樣5 μL，分析并進行線性關系考察。結果顯示，新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、維采寧-2、異槲皮素、紫云英苷分別在0.033～1.320，0.037～0.740，0.030～0.595，0.030～0.595，0.031～1.240，0.031～1.230 μg內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關系，線性回歸方程分別為y＝1 099 323.26x－13 922.33，y＝998 312x－389.13、y＝129 927x－16 015、y＝1 424 745.62x－10 780.61、y＝2 726 799.27x－25 481.72，y＝2 373 532.70x－5 592.42，r2均≥0.999 6。

4.3.2 精密度試驗 精密稱取辣木葉藥材粉末（Y10，過4 號篩），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算得到上述6 種成分的峰面積的RSD。結果顯示，6 種成分的峰面積RSD 均≤3.0%，表明儀器精密度良好。

4.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取辣木葉藥材粉末（Y10，過4 號篩），按“2.2”項下制備供試品溶液，在室溫放置0、2、4、8、10、24 h，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得到上述6 種成分的峰面積的RSD。結果顯示，6 種成分的峰面積RSD 均≤3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.3.4 重復性試驗 稱取同一批辣木葉粉末（Y10，過4 號篩）6 份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得到上述6 種成分含量的RSD。結果表明，6 種成分含量的RSD 均≤3.0%，表明該方法重復性良好。

4.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取辣木葉藥材粉末（Y10，過4 號篩）0.1 g，共6 份，每份樣品加入100%的對照品。按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算得到上述6 種成分的回收率的RSD。結果顯示，新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、維采寧-2、異槲皮素、紫云英苷的平均加樣回收率分別在 98.75%、101.70%、101.42%、97.88%、101.48%、100.97%，RSD 分別為2.9%、2.5%、2.6%、2.9%、2.3%、2.8%，均≤3.0%，表明6 種成分的加樣回收率結果良好，說明該方法可用于辣木葉中的6 種成分的含量測定。

4.4 15 批藥材的多成分含量測定

取辣木葉藥材各樣品，按“2.2”項下依法制備成供試品溶液并進樣測定，計算辣木葉藥材中6 種成分的含量（扣除水分）[14]，結果見圖11。15 批辣木葉中的新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、維采寧-2、異槲皮素、紫云英苷的平均質(zhì)量分數(shù)分別為5.81、1.91、2.23、0.94、6.59、2.91 mg/g，RSD 分別為9.2%、19.7%、10.9%、7.6%、9.4%、12.0%。

圖11 辣木葉中主要成分的含量測定結果Fig.11 Contents of main components in MOLs

5 討論

5.1 Q-Markers 的初步篩選—HPLC 特征圖譜

在供試樣品的制備方面，本實驗依次考察了提取方式（加熱回流、超聲）、提取溶劑（水、甲醇、乙醇及不同比例的甲醇水溶液）、提取時間（30、60、90 min），以色譜峰數(shù)量、響應值為主要參考指標，最終確定了辣木葉的最佳提取方法。

在色譜分析方法的建立方面，本實驗依次考察了不同型號色譜柱[Phenomenex Luna C18（2）100A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及WelchXtimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同流動相組成（乙腈-0.5%甲酸水、甲醇-0.5%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.5%醋酸水）以及檢測波長（254、280、305、330、350 nm），以色譜峰數(shù)量、響應值、分離度為主要參考指標，最終確定了辣木葉的液相色譜分離條件。

5.2 以調(diào)血脂作用為導向的Q-Markers 篩選—網(wǎng)絡藥理學研究

根據(jù)HPLC 特征圖譜篩選出的8 個特征成分均具有一定的降脂作用。有研究表明，色氨酸生物合成或代謝的相關途徑可以發(fā)揮降脂作用，這可能是因為當L-色氨酸含量增加時，其代謝產(chǎn)物5-羥色胺合成量增加，從而達到抑制攝食需求、減少脂肪攝入的目的[15]。綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩岷?,4,5-三咖啡?？鼘幩岬瓤Х弱？鼘幩犷惓煞挚梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)脂代謝相關基因的表達發(fā)揮降脂作用[16]。新綠原酸可能通過改變參與多種細胞內(nèi)信號傳導途徑的過氧化物增殖激活受體 α（ peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）和肝X 受體α（liver X receptor α，LXRα）的表達來改善脂質(zhì)代謝疾病[17]，或是通過減少過氧化物增殖激活受體γ2（peroxisome proliferatoractivated receptor γ2，PPARγ2）的表達和下調(diào)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路改善肥胖和肥胖相關的代謝紊亂[18]，也可能通過下調(diào)微小RNA-34（miR-34），激活煙酰胺腺苷二核苷酸依賴性脫乙酰酶/一磷酸腺苷依賴的蛋白激酶（ sirtuin 1/AMP-activated protein kinase，SIRT1/AMPK）途徑，從而減輕肝臟脂質(zhì)積累[19]。而綠原酸、新綠原酸等是隱綠原酸的代謝產(chǎn)物[20]，因而對改善高脂血癥也具有一定功效。異槲皮素、維采寧-2、槲皮素-3-O-β-D-(6′′-O-丙二酰) 葡萄糖苷、紫云英苷、山柰酚-3-O-β-D-(6′′-O-丙二酰) 葡萄糖苷均屬于黃酮類成分。有研究表明，黃酮類成分可通過提高卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶活性，增加膽固醇的逆向轉運，來提高HDL-C 對血漿及外周組織膽固醇的清除能力[5-6]；也可通過降低血清中的脂質(zhì)過氧化，減少大鼠氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的含量[21]等，來發(fā)揮治療高脂血癥的作用。

在此基礎上，利用網(wǎng)絡藥理學共得到交集靶點35 個，經(jīng)過PPI 蛋白互作及MCODE 模塊分析得到10 個關鍵靶點（ALB、IL6、VEGFA、MMP9、ACE、REN、MPO、CXCL12、IL2、APP）。其中，IL-6、MMP9 等炎癥因子的激活可以通過誘導肝臟脂肪酸合成的刺激和脂解作用的增加來升高血脂水平[22-24]。IL2、ACE、MPO[25]、VEGFA 與高脂血癥及動脈粥樣硬化密切相關[23-24]。ALB 是糖脂代謝的共性生物標志物[26]。血清CXCL12 可作為動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病的一種生物學標志物[27]。抑制腎素-血管緊張素轉換酶對治療動脈粥樣硬化及調(diào)血脂具有一定的協(xié)同作用[28]。

為了解釋信號通路中關鍵靶點的作用，進行了KEGG 通路富集分析，篩選出辣木葉治療高脂血癥的3 條核心通路。高脂飲食導致的肥胖往往伴隨炎癥反應，推測辣木葉可能通過調(diào)節(jié)細胞因子-細胞因子受體相互作用（促進抗炎因子，抑制促炎因子IL-2、IL-6 等炎癥因子發(fā)揮抗炎作用[22-29]）、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡（藥物發(fā)揮抗炎作用極有可能與減少IgA 的分泌有關[30]）、PI3K-Akt 信號通路[通過影響哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）和膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（sterol-regulatory element binding protein，SREBP）[31]、核苷酸代謝[26]等來發(fā)揮調(diào)血脂的作用。最后，通過構建“特征成分-關鍵靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡及計算網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，在有效性方面，篩選出了5 個Q-Markers（新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2）。

5.3 Q-Markers 的五原則分析

基于特征圖譜的OPLS-DA 分析結果顯示，維采寧-2、異槲皮素、隱綠原酸、新綠原酸、L-色氨酸含量差異較大，是不同產(chǎn)地辣木葉的差異性標志物，上述幾種成分含量較高且穩(wěn)定，符合Q-Marker 的可測性。

同時，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以上5 個產(chǎn)地差異性標志物成分從藥材到水煎液具有較好的傳遞性（新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、維采寧-2、異槲皮素從辣木葉藥材到水煎液的轉移率分別為34.37%～63.83%、62.43%～115.94%、64.65%～120.06%、56.98%～105.82%、37.46%～69.57%），且以上5 個成分均能在血清或血漿中檢出原型或代謝產(chǎn)物[15,32-34]，符合Q-Marker 的傳遞與溯源性。

在此基礎上，通過檢索TCMSP 網(wǎng)站判斷成分的特有性，結果顯示，新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2 分別在3、4、3、55、8種中藥中存在，除異槲皮素外，另外4 種成分在其他中藥中存在較少，符合Q-Marker 的特有性，建議將上述4 種成分納入辣木葉的質(zhì)量控制指標。但是考慮到異槲皮素的含量較高，從相對含量和絕對含量來看，異槲皮素在辣木葉中所占的比例高于其他成分，故將該成分也納入辣木葉的質(zhì)量控制指標。

辣木葉富含黃酮類成分、有機酸類成分及大量氨基酸，而這些成分又具有顯著的藥理活性。研究報道，辣木葉總黃酮具有顯著的調(diào)血脂作用[3-6]，又因為異槲皮素和維采寧的含量較高，推測其可能是代表性發(fā)揮調(diào)血脂作用的黃酮類成分。同時，咖啡酰奎寧酸類的有機酸成分可以通過調(diào)節(jié)脂代謝相關基因的表達發(fā)揮調(diào)血脂作用[16]。例如，新綠原酸可能通過改變參與多種細胞內(nèi)信號傳導途徑的PPARα 和LXRα 的表達來改善脂質(zhì)代謝疾病[17]，或是通過減少PPARγ2 的表達和NF-κB 信號通路改善肥胖和肥胖相關的代謝紊亂[18]，也可能通過下調(diào)miR-34，激活SIRT1/AMPK 途徑，從而減輕肝臟脂質(zhì)積累[19]。而綠原酸、新綠原酸等是隱綠原酸的代謝產(chǎn)物或異構化產(chǎn)物[20]。此外，色氨酸生物合成或代謝的相關途徑也可以發(fā)揮調(diào)血脂作用，這可能是因為當L-色氨酸含量增加時，其代謝產(chǎn)物5-羥色胺合成量增加，從而達到抑制攝食需求、減少脂肪攝入的目的[15]。本研究結合文獻并通過網(wǎng)絡藥理學證明以上5 個成分符合Q-Marker 的有效性，同時推測這5 個成分作為辣木葉的主要成分且具有顯著的藥理作用，可能具有一定的協(xié)同作用，即滿足QMarker 的配伍合理性。后續(xù)，也將針對成分的配伍合理性進行進一步探索。綜上，結合以調(diào)血脂作用為導向的網(wǎng)絡藥理學篩選過程，最終將新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2 這5 種成分作為辣木葉的調(diào)血脂Q-Markers。

綜上，本研究基于特征圖譜-化學計量學、網(wǎng)絡藥理學-分子對接、含量測定的方法，以Q-Marker 的五原則為核心，初步確定新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2 可作為辣木葉用于高脂血癥的候選Q-Markers，為建立辣木葉的質(zhì)量評價標準提供數(shù)據(jù)參考。同時，本研究探索了辣木葉治療高脂血癥的藥效物質(zhì)及潛在的作用機制，推測辣木葉的主要成分新綠原酸、L-色氨酸、隱綠原酸、異槲皮素、維采寧-2 等可能通過作用于ALB、IL6、VEGFA 等靶點來影響細胞因子-細胞因子受體相互作用、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡、PI3K/Akt 信號通路以發(fā)揮調(diào)血脂作用，這也為臨床使用提供一定的理論依據(jù)。鑒于辣木葉發(fā)揮高脂血癥為多成分的相互協(xié)同作用，本研究預測的候選Q-Markers 尚需要進一步開展其體內(nèi)吸收、藥效等多層面的藥效物質(zhì)研究，并基于多批次、多因素的藥材質(zhì)量分析，為基于高脂血癥的辣木葉候選QMarkers 標準的制訂提供科學支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突