徐 云 ，于艷輝 ，牟 榮 ，王寶成 ，蘇小紅，肖俊美 ，徐 建

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實驗室，長春130103；2.吉林省藥品審評中心，長春130000;3.通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，通化134000）

肺寧口服液由返魂草的單方制劑。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-083-（Z-017）2005Z，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅包含薄層鑒別及高效液相色譜法綠原酸含量測定，檢測成分單一。尚未有關(guān)于肺寧口服液綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量測定的方法報道，故建立高效液相色譜法對此3種成分同時測定的方法。并采用一測多評法（QAMS）與外標(biāo)法同時測定11批樣品進(jìn)行對比研究。將一測多評法應(yīng)用于產(chǎn)品的品質(zhì)評價中，方法簡便、準(zhǔn)確、可行，也為其他肺寧制劑的品質(zhì)評價方法建立提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Angilent 1200高效液相色譜儀；Ultimate 3000高效液相色譜儀；梅特勒MS205DU型分析天平；梅特勒TOLEDO XPR2型百萬分之一分析天平；SB25-12DT型超聲波清洗器。

1.2 試劑與試藥

乙腈為色譜純；甲醇、甲酸、磷酸等均為分析純；水為純化水。

1.3 對照品與樣品

綠原酸（110753-201817，純度：96.8%）從中國食品藥品檢定研究院購入；新綠原酸（HNO21137198，純度 98%）、隱綠原酸（HCO2134198，純度 98%）、均從Herbest購入；肺寧口服液 （190309批、191202批、191203批、191204批、191205批、191206批、191207批、191208批、191209批、191210批、191211批），均由通藥制藥集團(tuán)股份有限公司提供。

2 方法[1～3]

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB C18色譜柱 （柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm粒徑5μm)；以乙腈為流動相A，以0.2%甲酸溶液為流動相B，按下表中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為325 nm；柱溫為35℃，流速0.8 ml/min。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于5000，詳見表1。

表1 流動相洗脫條件

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸適量，加甲醇制成濃度分別為含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的混合溶液，作為儲備液。精密量取對照品儲備液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

精密量取本品2ml，置于25 ml容量瓶中，加70%甲醇20ml，超聲20分鐘，放冷，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)

2.4.1 專屬性試驗

2.4.1.1空白輔料溶液的制備

按處方制備輔料及用量，制備輔料空白樣品，再按照2.3項下供試品溶液制備方法，制備空白輔料溶液。

2.4.1.2分別精密吸取空白輔料溶液、空白溶劑（70%甲醇）、供試品溶液、混合對照品溶液（2.2項下）各10 μl，注入液相色譜儀，對比HPLC圖?？疾旆椒▽傩?。空白輔料及空白溶劑均無干擾，結(jié)果表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 專屬性HPLC圖

2.4.2 線性與范圍

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸混合對照品（濃度依 次為 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml），分別稀釋 2、5、10、20、50 倍。作為對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液各5μl，注入液相色譜儀測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的回歸方程和r值。結(jié)果見表2。

表2 HPLC線性回歸方程及線性范圍的測定結(jié)果

2.4.3 精密度試驗

取2.4.2項下稀釋10倍的對照品溶液，在2.1項下色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積5μl，測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積，計算RSD值。RSD值分別為0.94%、1.09%、1.07%。表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：190309批），按照2.1項下色譜條件分別在 0、5、10、15、20、25 小時進(jìn)樣，記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積，分別考察其在溶液中的穩(wěn)定性。計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的RSD分別為0.21%、0.29%、0.34%。表明供試品溶液在25小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗

精密量取本品（批號：190309）2ml，共 6 份，按 2.3項下供試品溶液制備方法制備，按2.1色譜條件測定其含量，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的平均含量分別為 0.47 mg/ml、0.30 mg/ml、0.33 mg/ml及 RSD 分別為0.19%、0.18%、0.18%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗

精密量取已知含量樣品（批號：190309批，含新綠原酸0.47 mg/ml、綠原酸0.37 mg/ml、隱綠原酸0.33 mg/ml）1ml，共 6 份，分別置于 25 ml量瓶中，精密加入混合對照品溶液 （濃度為新綠原酸0.4869 mg/ml、綠原酸 0.3489 mg/ml、隱綠原酸 0.3352 mg/ml）1ml，精密加入20 ml 70%甲醇溶液，超聲10分鐘，放冷，加70%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液測定含量，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸回收率，結(jié)果分別為 100.7%～104.6%、95.0%～100.8%、95.7%～101.1%。RSD均小于3%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 相對校正因子的重現(xiàn)性考察[4～6]

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸混合對照品（濃度依次為 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml），分別稀釋5倍（對照溶液1）、10倍（對照溶液2）、20倍（對照溶液3）、50倍（對照溶液4）。按照2.1項下色譜條件，依法測定。分別考察在不同儀器 （戴安U-3000高效液相色譜儀器、安捷倫1200高效液相色譜儀） 不同色譜柱 （Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）)的峰面積，并計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的相對校正因子。結(jié)果見表3。

表3 相對校正因子重現(xiàn)性

結(jié)果f綠/新平均值=1.268 f綠/隱平均值=1.220

2.6 新綠原酸與隱綠原酸的定位

根據(jù)重復(fù)性試驗及校正因子重現(xiàn)性考察試驗結(jié)果，記錄其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的保留時間，計算新綠原酸、隱綠原酸與綠原酸的相對保留時間分別為0.64、1.084。不同儀器及色譜柱之間相對保留時間波動較小，RSD值分別為0.34%、0.21%?？刹捎孟鄬ΡＡ魰r間法對新綠原酸及隱綠原酸進(jìn)行定位。

2.7 一測多評測法與外標(biāo)法比較[7～10]

取11批肺寧口服液及10批中間體，按2.3項下制備供試品溶液，以一測多評法和常規(guī)外標(biāo)法進(jìn)行新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量測定比較，并將含量測定結(jié)果進(jìn)行T檢驗分析。外標(biāo)法與一測多評法測得的新綠原酸P值為0.893，隱綠原酸的P值為0.926，P＞0.05，說明兩種方法之間無顯著性差異。進(jìn)一步驗證一測多評法用于新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果見表4。

表4 一測多評法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果

3 討論

色譜條件篩選時，分別考察不同濃度的磷酸、甲酸，結(jié)果0.2%的甲酸峰型最好。且對不同儀器及不同色譜柱進(jìn)行重現(xiàn)性考察。分別考察在不同儀器 （戴安U-3000高效液相色譜儀器、安捷倫1200高效液相色譜儀）不同色譜柱 （Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm*250 mm，5μm）)相對校正因子具有較好的重現(xiàn)性。根據(jù)后續(xù)試驗相對保留時間數(shù)據(jù)積累，待進(jìn)一步規(guī)定其相對保留時間及SD值，更加準(zhǔn)確的測定其含量。

通過前期對返魂草藥材的指紋圖譜研究，其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸3中酚酸類成分含量較高，且通過前期對返魂草藥材及肺寧制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸是止咳、抗炎作用的主要藥效成分，綠原酸對照品易得，采用一個對照品來評價多個成分，節(jié)約成本，對返魂草及返魂草制劑的品質(zhì)評價及標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。