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        一測多評法在肺寧口服液品質(zhì)評價中的應(yīng)用

        2020-12-23 07:50:14于艷輝王寶成蘇小紅肖俊美
        人參研究 2020年6期
        關(guān)鍵詞:原酸外標(biāo)法液相色譜儀

        徐 云 ,于艷輝 ,牟 榮 ,王寶成 ,蘇小紅,肖俊美 ,徐 建

        (1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司,吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實驗室,長春130103;2.吉林省藥品審評中心,長春130000;3.通藥制藥集團(tuán)股份有限公司,通化134000)

        肺寧口服液由返魂草的單方制劑。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-083-(Z-017)2005Z,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅包含薄層鑒別及高效液相色譜法綠原酸含量測定,檢測成分單一。尚未有關(guān)于肺寧口服液綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量測定的方法報道,故建立高效液相色譜法對此3種成分同時測定的方法。并采用一測多評法(QAMS)與外標(biāo)法同時測定11批樣品進(jìn)行對比研究。將一測多評法應(yīng)用于產(chǎn)品的品質(zhì)評價中,方法簡便、準(zhǔn)確、可行,也為其他肺寧制劑的品質(zhì)評價方法建立提供依據(jù)。

        1 材料

        1.1 儀器

        Angilent 1200高效液相色譜儀;Ultimate 3000高效液相色譜儀;梅特勒MS205DU型分析天平;梅特勒TOLEDO XPR2型百萬分之一分析天平;SB25-12DT型超聲波清洗器。

        1.2 試劑與試藥

        乙腈為色譜純;甲醇、甲酸、磷酸等均為分析純;水為純化水。

        1.3 對照品與樣品

        綠原酸(110753-201817,純度:96.8%)從中國食品藥品檢定研究院購入;新綠原酸(HNO21137198,純度 98%)、隱綠原酸(HCO2134198,純度 98%)、均從Herbest購入;肺寧口服液 (190309批、191202批、191203批、191204批、191205批、191206批、191207批、191208批、191209批、191210批、191211批),均由通藥制藥集團(tuán)股份有限公司提供。

        2 方法[1~3]

        2.1 色譜條件

        采用Agilent ZORBAX SB C18色譜柱 (柱長為250 mm,內(nèi)徑為4.6 mm粒徑5μm);以乙腈為流動相A,以0.2%甲酸溶液為流動相B,按下表中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為325 nm;柱溫為35℃,流速0.8 ml/min。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于5000,詳見表1。

        表1 流動相洗脫條件

        2.2 混合對照品溶液的制備

        分別精密稱定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸適量,加甲醇制成濃度分別為含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的混合溶液,作為儲備液。精密量取對照品儲備液1 ml,置于10 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

        2.3 供試品溶液制備

        精密量取本品2ml,置于25 ml容量瓶中,加70%甲醇20ml,超聲20分鐘,放冷,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.4 方法學(xué)

        2.4.1 專屬性試驗

        2.4.1.1空白輔料溶液的制備

        按處方制備輔料及用量,制備輔料空白樣品,再按照2.3項下供試品溶液制備方法,制備空白輔料溶液。

        2.4.1.2分別精密吸取空白輔料溶液、空白溶劑(70%甲醇)、供試品溶液、混合對照品溶液(2.2項下)各10 μl,注入液相色譜儀,對比HPLC圖??疾旆椒▽傩?。空白輔料及空白溶劑均無干擾,結(jié)果表明專屬性良好。詳見圖1。

        圖1 專屬性HPLC圖

        2.4.2 線性與范圍

        取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸混合對照品(濃度依 次為 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml),分別稀釋 2、5、10、20、50 倍。作為對照品溶液,精密吸取上述對照品溶液各5μl,注入液相色譜儀測定峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別求出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的回歸方程和r值。結(jié)果見表2。

        表2 HPLC線性回歸方程及線性范圍的測定結(jié)果

        2.4.3 精密度試驗

        取2.4.2項下稀釋10倍的對照品溶液,在2.1項下色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣體積5μl,測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積,計算RSD值。RSD值分別為0.94%、1.09%、1.07%。表明儀器精密度良好。

        2.4.4穩(wěn)定性試驗

        取供試品溶液(批號:190309批),按照2.1項下色譜條件分別在 0、5、10、15、20、25 小時進(jìn)樣,記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積,分別考察其在溶液中的穩(wěn)定性。計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的RSD分別為0.21%、0.29%、0.34%。表明供試品溶液在25小時內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.5 重復(fù)性試驗

        精密量取本品(批號:190309)2ml,共 6 份,按 2.3項下供試品溶液制備方法制備,按2.1色譜條件測定其含量,計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的平均含量分別為 0.47 mg/ml、0.30 mg/ml、0.33 mg/ml及 RSD 分別為0.19%、0.18%、0.18%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

        2.4.6 回收率試驗

        精密量取已知含量樣品(批號:190309批,含新綠原酸0.47 mg/ml、綠原酸0.37 mg/ml、隱綠原酸0.33 mg/ml)1ml,共 6 份,分別置于 25 ml量瓶中,精密加入混合對照品溶液 (濃度為新綠原酸0.4869 mg/ml、綠原酸 0.3489 mg/ml、隱綠原酸 0.3352 mg/ml)1ml,精密加入20 ml 70%甲醇溶液,超聲10分鐘,放冷,加70%甲醇溶液至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液測定含量,計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸回收率,結(jié)果分別為 100.7%~104.6%、95.0%~100.8%、95.7%~101.1%。RSD均小于3%,方法準(zhǔn)確度良好。

        2.5 相對校正因子的重現(xiàn)性考察[4~6]

        取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸混合對照品(濃度依次為 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml),分別稀釋5倍(對照溶液1)、10倍(對照溶液2)、20倍(對照溶液3)、50倍(對照溶液4)。按照2.1項下色譜條件,依法測定。分別考察在不同儀器 (戴安U-3000高效液相色譜儀器、安捷倫1200高效液相色譜儀) 不同色譜柱 (Aglient ZORBAX SB-C18(4.6 mm*250 mm,5 μm)、Kromasil 100-5-C18(4.6 mm*250 mm,5 μm))的峰面積,并計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的相對校正因子。結(jié)果見表3。

        表3 相對校正因子重現(xiàn)性

        結(jié)果f綠/新平均值=1.268 f綠/隱平均值=1.220

        2.6 新綠原酸與隱綠原酸的定位

        根據(jù)重復(fù)性試驗及校正因子重現(xiàn)性考察試驗結(jié)果,記錄其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的保留時間,計算新綠原酸、隱綠原酸與綠原酸的相對保留時間分別為0.64、1.084。不同儀器及色譜柱之間相對保留時間波動較小,RSD值分別為0.34%、0.21%??刹捎孟鄬ΡA魰r間法對新綠原酸及隱綠原酸進(jìn)行定位。

        2.7 一測多評測法與外標(biāo)法比較[7~10]

        取11批肺寧口服液及10批中間體,按2.3項下制備供試品溶液,以一測多評法和常規(guī)外標(biāo)法進(jìn)行新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量測定比較,并將含量測定結(jié)果進(jìn)行T檢驗分析。外標(biāo)法與一測多評法測得的新綠原酸P值為0.893,隱綠原酸的P值為0.926,P>0.05,說明兩種方法之間無顯著性差異。進(jìn)一步驗證一測多評法用于新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果見表4。

        表4 一測多評法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果

        3 討論

        色譜條件篩選時,分別考察不同濃度的磷酸、甲酸,結(jié)果0.2%的甲酸峰型最好。且對不同儀器及不同色譜柱進(jìn)行重現(xiàn)性考察。分別考察在不同儀器 (戴安U-3000高效液相色譜儀器、安捷倫1200高效液相色譜儀)不同色譜柱 (Aglient ZORBAX SB-C18(4.6 mm*250 mm,5 μm)、Kromasil 100-5-C18(4.6 mm*250 mm,5μm))相對校正因子具有較好的重現(xiàn)性。根據(jù)后續(xù)試驗相對保留時間數(shù)據(jù)積累,待進(jìn)一步規(guī)定其相對保留時間及SD值,更加準(zhǔn)確的測定其含量。

        通過前期對返魂草藥材的指紋圖譜研究,其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸3中酚酸類成分含量較高,且通過前期對返魂草藥材及肺寧制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究,綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸是止咳、抗炎作用的主要藥效成分,綠原酸對照品易得,采用一個對照品來評價多個成分,節(jié)約成本,對返魂草及返魂草制劑的品質(zhì)評價及標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

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