楊 敏，陳佳俊，趙晨旭，趙宏磊，魏兆明

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院·吉林吉林·132101）

前言

植物多酚是一類具有清除自由基和抗氧化能力的化合物，在降血糖、降血壓、預(yù)防心血管疾病等方面發(fā)揮重要作用[1]。菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）是種富含黃酮類、多糖類、酚類的植物[2,3]，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究集中在黃酮類[4]、多糖[5]成分鑒定及其生殖、抗衰等方面，而關(guān)于菟絲子中多酚化合物抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用的研究少見(jiàn)報(bào)道。在合理利用藥物資源及尋求和擴(kuò)大新藥源的前提下,本試驗(yàn)通過(guò)建立氧化衰老模型考察菟絲子多酚抗氧化能力及免疫調(diào)節(jié)作用，以期為菟絲子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，亦為開(kāi)發(fā)利用長(zhǎng)白山藥用資源提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠60只，健康狀況良好（由長(zhǎng)春市寬城區(qū)宏達(dá)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供）。

1.2 藥品

菟絲子 （購(gòu)自深圳市欣輝安貿(mào)易有限公司）；D-半乳糖（購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司）；維生素E(購(gòu)自吉林恒星科技制藥有限公司)。

1.3 主要試劑

SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒（購(gòu)自南京建成科技有限公司）；IL-1試劑盒、IL-2試劑盒（購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司）。

1.4 主要儀器

真空冷凍干燥機(jī) （購(gòu)自EYELA東京理化器械株式會(huì)社）；離心機(jī)（購(gòu)自東京HITACHI跨國(guó)集團(tuán)）；酶標(biāo)儀（購(gòu)自上海美谷分子儀器有限公司）。

2 操作方法

2.1 藥材預(yù)處理

菟絲子→乙醇水浴提取→真空抽濾→分離→純化→定容→稀釋→樣品

2.2 動(dòng)物模型建立及分組給藥

動(dòng)物選用昆明種小鼠，雌雄兼有，造模藥物進(jìn)行先期配置，將D-半乳糖溶于生理鹽水中，配成體積濃度為20mg/ml,儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。維生素E（VE）配制：將VE膠丸用玉米油配制成20 mg/ml的藥液,儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

小鼠隨機(jī)分為 6 組:空白組（C）、模型組（M）、低劑量組 100 mg/kg（D）、中劑量組 200 mg/kg（Z）、高劑量組 300mg/kg（G），VE 對(duì)照組（VE），每組 10 只。 除 C外，其他各組小鼠每日腹腔注射D-半乳糖200mg/kg,一日1次,連續(xù)4w,C組注射等體積生理鹽水。同時(shí)低、中、高組，每日1次，灌胃給藥，C組和M組給予同體積的0.9%生理鹽水，連續(xù)6w。

2.3 菟絲子多酚對(duì)D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的影響

2.3.1 血清的制備

眼球采血，將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)，在3500rpm、4℃條件下離心15分鐘，取上清液。

2.3.2 MDA含量的測(cè)定（硫代巴比妥酸法）

過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰，用此法測(cè)MDA含量。計(jì)算公式如下：

MDA血清（nmol/ml）=[（OD測(cè)定-OD對(duì)照）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）]×C標(biāo)準(zhǔn)品×稀釋倍數(shù)樣本測(cè)試前

2.3.3 SOD活性測(cè)定

采用水溶性四唑鹽（WST-1）法。在本反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U)。計(jì)算公式如下：

SOD抑制率（%）=[（A對(duì)照-A對(duì)照空白）-（A測(cè)定-A測(cè)定空白）]/（A對(duì)照-A對(duì)照空白）×100%

SOD活力（U/ml）=SOD抑制率/50%×稀釋倍數(shù)反應(yīng)體系×稀釋倍數(shù)樣本測(cè)試前

2.4 菟絲子多酚對(duì)D-半乳糖小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響

用預(yù)冷的 PBS（緩沖液，0.01M，pH=7.4）沖洗脾臟和胸腺，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎，在與PBS以重量體積1∶9的比例，放入勻漿材料中，于冰上充分研磨，對(duì)勻漿液超聲破碎，5000rpm、4℃下離心10分鐘，取上清檢測(cè)。

2.5 菟絲子多酚對(duì)小鼠胸腺組織NO、IL-1功能的影響

計(jì)算公式：

NO（μmol/L）=[（OD測(cè)定-OD空白）/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）]×C標(biāo)準(zhǔn)品×稀釋倍數(shù)

IL-1測(cè)定采用ELISA法,酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（OD值）計(jì)算樣品濃度。

2.6 菟絲子多酚對(duì)小鼠脾臟組織IL-2功能的影響

檢測(cè)方法與IL-1類似。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS19.0軟件，統(tǒng)計(jì)法應(yīng)用單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 模型小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況分析結(jié)果

表1 小鼠造模期間形態(tài)統(tǒng)計(jì)

D、Z組小鼠相比M組，毛態(tài)順亮，進(jìn)食多，重量大，生活狀態(tài)明顯更有生命力，而M組生活狀態(tài)明顯不佳，證明造模成功，指示D、Z組對(duì)衰老小鼠有明顯改善。G組表現(xiàn)低迷，指示高劑量組改善作用不明顯或?qū)π∈蟛焕?/p>

3.2 抗氧化指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果

表2 菟絲子多酚抗氧化能力 n=5（±s）

表2 菟絲子多酚抗氧化能力 n=5（±s）

注：#：表示與空白組相比較，P＜0.05；##：表示與空白組相比較，P＜0.01；*： 表示與模型組相比較，P＜0.05；**：表示與模型組相比較，P＜0.01；n=5。

組別 MDA(nmol·ml-1) SOD(U·ml-1)C 3.28±1.04 23.42±1.38 M 9.17±0.46## 13.58±0.74##D 7.67±0.71** 15.25±0.46*Z 5.75±0.70** 15.54±1.56*G 8.72±0.71 13.70±1.06 VE 3.68±0.80** 19.39±1.29**

由表2可知，M組相比C組，MDA含量極顯著（P＜0.01）增加，SOD 活力極顯著（P＜0.01）下降；D、Z、VE 組較 M 組，MDA 含量顯著（P＜0.05）降低，SOD 活力顯著（P＜0.05）提升；G組與M組MDA含量和SOD含量無(wú)顯著性（P＞0.05）差異。表明低、中劑量的菟絲子多酚提取物可能對(duì)衰老有一定的抗氧化作用。

3.3 免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表3 菟絲子多酚對(duì)免疫的影響n=5（±s）

表3 菟絲子多酚對(duì)免疫的影響n=5（±s）

組別 IL-1（pg·ml-1） IL-2（pg·ml-1） NO(μmol·L-1)C 127.37±4.15 127.37±4.15 24.80±1.91 M 90.12±2.99## 89.72±3.26## 39.70±3.14##D 95.62±1.73* 107.02±4.60** 36.68±1.47*Z 110.30±6.06** 114.30±5.44** 30.81±1.67**G 92.91±3.29 92.91±3.29 37.41±1.82 VE 121.90±4.47** 125.90±8.44** 26.69±2.60**

由表3可知，M組相比C組,IL-1、IL-2的水平極顯著（P＜0.01）降低，NO 水平極顯著（P＜0.01）提高；D組較 M 組，IL-1 水平顯著（P＜0.05）提高，IL-2 水平極顯著（P＜0.01）提高，NO 水平顯著（P＜0.05）下降；Z、VE組較M組，IL-1水平、IL-2水平極顯著 （P＜0.01）提高，NO水平極顯著（P＜0.01）下降；G組與M組比較，3個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著性（P＞0.05）差異。表明D、Z劑量菟絲子多酚提取物能夠調(diào)控衰老模型小鼠免疫系統(tǒng)。

4 討論

本研究通過(guò)D-半乳糖建立衰老小鼠模型，生活能力明顯弱化，與C組區(qū)別較大，造模順利。模型小鼠抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)含量明顯下降，自由基含量明顯增加，指示小鼠衰老同時(shí)對(duì)氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生了影響。本課題研究顯示，菟絲子多酚低、中劑量對(duì)衰老促進(jìn)劑D-半乳糖有拮抗作用，可以提高小鼠抗氧化和促進(jìn)免疫因子的釋放，抑制自由基產(chǎn)生從而減少對(duì)小鼠造成傷害，促進(jìn)免疫系統(tǒng)分泌免疫因子，實(shí)現(xiàn)保護(hù)機(jī)體的作用。