酈露群，龔一富*，宋奕珩，高孟雪，王何瑜

1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315832

2.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832

三葉崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg 是被子植物門(mén)雙子葉植物綱葡萄科崖爬藤屬多年蔓生植物，作為中國(guó)特有的珍貴中草藥，臨床上主要用于抗癌，治療血液及心腦血管疾病、肝炎、腦膜炎、肺炎、腸炎、咽炎等感染性疾病，以及兒童高熱驚厥[1-2]，在抗氧化、抗癌、抗炎等方面中也均得到證實(shí)[3-5]。三葉崖爬藤藥物有效成分分析方面已經(jīng)有大量的研究報(bào)道，主要包括黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、磷脂、糖酯類(lèi)和苯磺酸類(lèi)等[6]，黃酮類(lèi)化合物是三葉崖爬藤的主要功效成分[7]，現(xiàn)有研究表明，其可結(jié)合新型冠狀病毒的2～3 個(gè)靶蛋白，從而發(fā)揮抗新冠病毒感染的作用[8]。

已有研究闡述黃酮類(lèi)化合物的合成通路中的關(guān)鍵酶基因，查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）基因調(diào)控早期黃酮生物合成途徑，并產(chǎn)生不同種類(lèi)的類(lèi)黃酮前體[9]。CHI基因作為黃酮合成過(guò)程中重要的限速酶，催化查耳酮異構(gòu)化為黃烷酮柚皮素。CHI基因具有重要作用，可以控制花色苷的合成，增強(qiáng)植物抗逆性和抗氧化能力，增加藥用植物中的黃酮及類(lèi)黃酮化合物的積累等[10]?，F(xiàn)已從苦蕎麥Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.[11]、灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.[12]、青蒿ArtemisiacaruifoliaBuch.-Ham.ex Roxb.[13]、紅花CarthamustinctoriusL.[14]和丹參SalviamiltiorrhizaBunge.[15]等多種藥用植物中克隆得到了CHI基因序列并對(duì)其功能進(jìn)行剖析，但在三葉崖爬藤中CHI基因還未見(jiàn)有被克隆的研究報(bào)道，因此從三葉崖爬藤中克隆CHI基因并探究基因表達(dá)特性可為三葉崖爬藤黃酮生物合成機(jī)制提供分子基礎(chǔ)。

外源誘導(dǎo)因素對(duì)次生代謝產(chǎn)物的形成具有重要作用，黃酮類(lèi)合成途徑的眾多結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因均具有誘導(dǎo)表達(dá)特性，已有研究表明，吲哚-3-乙酸（3-indoleacetic acid，IAA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）和酵母提取物（yeast extract，YE）均可誘導(dǎo)藥用植物中次生代謝產(chǎn)物的生物合成。100 μg/mL 的IAA 可以促進(jìn)甘草中甘草酸的積累[16]。100 μmol/L 的MeJA 處理可以誘導(dǎo)丹參中苯丙烷生物合成基因的表達(dá)，促進(jìn)酚類(lèi)化合物的積累[17]。ABA 可促進(jìn)越南三七中三萜皂苷的積累[18]。100 μmol/L 的SA 可有效提高東北刺人參不定根中黃酮類(lèi)和蒽醌類(lèi)物質(zhì)的含量[19]。100 mg/L 的YE可誘導(dǎo)夾竹桃科植物懸浮細(xì)胞總黃酮和總酚的積累[20]。外源化學(xué)誘導(dǎo)子均可誘導(dǎo)處理參與黃酮類(lèi)生物合成途徑的代謝和相關(guān)基因的表達(dá)，但在三葉崖爬藤中對(duì)于誘導(dǎo)子調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成的研究較少，主要針對(duì)各種培養(yǎng)條件下三葉崖爬藤生理生化和黃酮含量方面，對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控的研究較少。目前對(duì)于黃酮合成研究主要集中在相關(guān)酶基因的表達(dá)或相關(guān)酶活性的變化，缺乏對(duì)基因表達(dá)、酶活性和黃酮含量三者之間的研究。本研究從基因?qū)用娉霭l(fā)，重點(diǎn)探討外源誘導(dǎo)子調(diào)控CHI基因表達(dá)、CHI酶活性及黃酮含量積累的機(jī)制。本研究從三葉崖爬藤中克隆CHI基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，測(cè)定三葉崖爬藤中各組織CHI基因表達(dá)量及黃酮含量，并分析各組織基因表達(dá)量與黃酮含量之間的相關(guān)性。探究IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 對(duì)三葉崖爬藤CHI基因相對(duì)表達(dá)量和CHI 酶活性的動(dòng)態(tài)變化及黃酮含量的影響，并對(duì)黃酮含量、CHI基因表達(dá)量和CHI 酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析。明確三葉崖爬藤黃酮合成相關(guān)酶基因CHI在不同組織和不同誘導(dǎo)處理下的表達(dá)模式，以期進(jìn)一步探究三葉崖爬藤中CHI基因功能及外源誘導(dǎo)子提高三葉崖爬藤內(nèi)源性黃酮含量的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料

三葉崖爬藤由寧波大學(xué)海洋學(xué)院海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，由寧波大學(xué)海洋學(xué)院龔一富副教授鑒定為三葉崖爬藤T.hemsleyanumDiels et Gilg。部分樣品烘干用于黃酮含量測(cè)定，部分樣品液氮速凍后保存于?80 ℃低溫條件下，用于RNA 提取。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)1103M028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、IAA（批號(hào)610M021）、MeJA（批號(hào)3230306002）、ABA（批號(hào)814C0223）、SA（批號(hào)515A031）和YE（批號(hào)505U051）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、三氯化鋁和氫氧化鈉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；克隆載體pMD-19T、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×Taq MasterMix 購(gòu)于江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，植物總RNA 提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；CHI 試劑盒購(gòu)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

光照培養(yǎng)箱（寧波萊?？萍加邢薰荆?；PCR 擴(kuò)增儀（eppendorf 公司，德國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（eppendorf 公司，德國(guó)）；NanoDrop 2000 核酸/蛋白定量?jī)x（Thermo 公司，美國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（eppendorf 公司，德國(guó)）。

2 方法

2.1 三葉崖爬藤的處理與采集

選擇生長(zhǎng)狀況良好且相似的三葉崖爬藤植株，每組每株葉片噴施5 mL 蒸餾水、IAA、MeJA、ABA、SA 和YE，2 周后取樣，55 ℃烘干，用于測(cè)定黃酮含量變化。另外在同等培養(yǎng)和處理?xiàng)l件下，采集處理后0、6、12、24、48、72、96 h 外源誘導(dǎo)條件下的三葉崖爬藤葉片組織用于基因表達(dá)量及酶活性的測(cè)定。所有樣品采集均遵循3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)原則并在采集后立即液氮速凍儲(chǔ)存在?80 ℃低溫條件下，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 三葉崖爬藤轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及CHI 基因序列的獲得

提取三葉崖爬藤葉片總RNA，測(cè)定RNA 濃度，并對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行電泳檢測(cè)評(píng)估。通過(guò)RTPCR，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行構(gòu)建、純化、檢測(cè)、定量，送至安升達(dá)生物科技有限公司進(jìn)行Illumina HiSeqTM2000 高通量測(cè)序。通過(guò)數(shù)據(jù)分析獲得三葉崖爬藤CHI基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)了一對(duì)CHI基因開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）擴(kuò)增引物：F：5’-TTCTCCTTTATCTGCATCAG-3’；R：5’-GCACAAGGGTTTTATTCCAT-3’。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 后電泳檢測(cè)、回收，通過(guò)測(cè)序證實(shí)插入片段。

2.3 三葉崖爬藤CHI 蛋白的生物信息學(xué)分析

在DNAMAN 9.0 軟件上分析三葉崖爬藤CHI基因cDNA 全長(zhǎng)序列，通過(guò)ExPASy Protparam 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量、PI 值、分子式和不穩(wěn)定系數(shù)等。WOLF PSORT進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。ExPASy ProtScale預(yù)測(cè)蛋白親水性和疏水性。TMHMM 2.0 分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP 4.1 Server 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。SMART 和NCBI 中的CD search 分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。SOPMA 對(duì)CHI 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。SWISS-MODEL 和Phyre2 預(yù)測(cè)CHI 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)，下載綠豆、甘草、苜蓿和黃芪等15 個(gè)物種的CHI 氨基酸序列并利用MEGA 11 以鄰接法（neighbour joining，NJ），設(shè)置Bootstrap值（自展值）為1 000，其他參數(shù)默認(rèn)，進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.4 三葉崖爬藤黃酮含量測(cè)定

黃酮含量測(cè)定參考朱良輝等[21]的方法，以蘆丁對(duì)照品的濃度（Y）為橫坐標(biāo)，吸光度值（X）為縱坐標(biāo)，繪制線(xiàn)性方程Y＝9.340 7X－0.004 5，R2＝0.998 8，線(xiàn)性范圍為0.008～0.048 mg/mL，用于計(jì)算三葉崖爬藤黃酮含量。本研究所建立的黃酮含量測(cè)定方法能滿(mǎn)足方法學(xué)考察要求。

2.5 三葉崖爬藤CHI 基因組織及誘導(dǎo)表達(dá)測(cè)定

分別提取三葉崖爬藤根、莖、塊莖、老葉和幼葉組織總RNA。利用IAA、MeJA、ABA、SA 和YE誘導(dǎo)處理三葉崖爬藤，分別提取經(jīng)誘導(dǎo)處理0、6、12、24、48、72、96 h 后的三葉崖爬藤葉片RNA，測(cè)定三葉崖爬藤中各組織及各誘導(dǎo)處理的RNA 濃度，并對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行電泳檢測(cè)評(píng)估，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并于?20 ℃保存?zhèn)溆?。設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物F-5’-GCCAACCACCTCTTCCTCAG-3’和R-5’-TCAACAGTCTTGCCCTTCCA-3’。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物序列為F-5’CCATTACTGCTACCCAAAAAACT-3’和 R-5’-GTGAGGTCAACCACCGACACATC-3’。根據(jù)上述基因的引物序列進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，對(duì)三葉崖爬藤CHI基因進(jìn)行各組織及各誘導(dǎo)處理的表達(dá)量分析，各組織基因表達(dá)量以塊莖中的表達(dá)量為參照。qRT-PCR 反應(yīng)體系為：滅菌水8.2 μL，SYBR qPCR Master Mix10 μL，正反引物各0.4 μL，cDNA 模板1.0 μL，共20 μL 的反應(yīng)體系。qRT-PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，熔解曲線(xiàn)按儀器默認(rèn)，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法分析基因表達(dá)水平。

2.6 誘導(dǎo)條件下三葉崖爬藤CHI 酶活性測(cè)定

CHI 酶活性測(cè)定使用查耳酮異構(gòu)酶試劑盒，稱(chēng)取三葉崖爬藤誘導(dǎo)處理后的葉片0.1 g 和提取液1 mL 于離心管中，至于冰上，進(jìn)行冰浴勻漿，4 ℃離心取上清，置冰上待測(cè)。用蒸餾水調(diào)零，在1 mL 玻璃比色皿中加入50 μL 上清液和950 μL緩沖液，立即混勻并在381 nm 下測(cè)定初始吸光度（A）值，記為A1，37 ℃保溫30 min 后測(cè)定A值，記為A2，計(jì)算ΔA（ΔA＝A2－A1）。按公式計(jì)算CHI活性。

CHI 活性＝400×ΔA/樣本質(zhì)量

2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS 26.0 和Graph Pad Prism 9 等軟件進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 三葉崖爬藤CHI 基因克隆和序列分析

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得三葉崖爬藤CHI基因cDNA 全長(zhǎng)序列1 096 bp，經(jīng)ORF-Finder 分析，含有一個(gè)長(zhǎng)為714 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼237 個(gè)氨基酸（圖1）。對(duì)三葉崖爬藤CHI 蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，該蛋白分子式為C1148H1819N285O348S5，PI 值為5.28，偏酸性，相對(duì)分子質(zhì)量為25 340，其中谷氨酸（Glu）和絲氨酸（Ser）占比最高，達(dá)10.1%，色氨酸（Trp）和組氨酸（His）占比最低，只占0.8%。該蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌型蛋白，編碼的氨基酸全都在膜外，不具有跨膜結(jié)構(gòu)。ProtScale 預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白，且總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為0.070。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)三葉崖爬藤CHI蛋白主要分布在在葉綠體中，其次分布于細(xì)胞質(zhì)中，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為37.61，屬于穩(wěn)定蛋白。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，三葉崖爬藤CHI 蛋白屬于Chalcone-3 超基因家族，包含一個(gè)Chalcone 結(jié)構(gòu)域（4～233），編碼查耳酮黃烷酮異構(gòu)酶。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)在整個(gè)氨基酸序列中均有分布，該蛋白中α-螺旋（alpha helix）占比最高，占46.41%，無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）占29.11%，延伸鏈（extended strand）占16.03%，β-折疊（beta turn）占8.44%。α-螺旋為三葉崖爬藤CHI 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)組成元件，占比最高，其次是延伸鏈。利用Phyre2和SWISSMODEL 在線(xiàn)預(yù)測(cè)三葉崖爬藤CHI 編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)（圖2）。在蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中，三葉崖爬藤CHI 蛋白呈明顯的倒置三明治狀折疊結(jié)構(gòu)，是該類(lèi)蛋白的特征之一，明顯可見(jiàn)三級(jí)結(jié)構(gòu)中存在大量的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖2 三葉崖爬藤CHI 蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional spatial structure of T.hemsleyanum CHI protein

3.2 三葉崖爬藤CHI 蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為進(jìn)一步研究三葉崖爬藤CHI氨基酸序列與其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA11 中的NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。進(jìn)化樹(shù)總體分為2 個(gè)分支，單子葉植物和雙子葉植物分支。美人蕉、玉米、日本晴水稻和小麥聚為單子葉植物分支，綠豆、甘草、苜蓿、黃芪、花生、大豆和歐洲葡萄等聚為雙子葉植物分支，雙子葉植物分支可進(jìn)一步細(xì)分為豆科和葡萄科兩小支，三葉崖爬藤CHI 蛋白與其他葡萄科植物CHI 蛋白具有高度的相似性，與歐洲葡萄VitisviniferaL.和山葡萄VitisamurensisRupr.在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上聚為葡萄科小支，同源性最高，說(shuō)明該基因具有較高的科間同源性。

圖3 三葉崖爬藤CHI 蛋白與其他植物CHI 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of T.hemsleyanum CHI proteins and other plant species

3.3 三葉崖爬藤CHI 基因組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR 測(cè)定三葉崖爬藤CHI基因在不同組織下的表達(dá)模式，結(jié)果表明（圖4），CHI基因在三葉崖爬藤各組織中均得到表達(dá)，但基因表達(dá)量存在差異。以三葉崖爬藤塊莖中的CHI基因表達(dá)量為參照，表達(dá)量從高到低為根＞幼葉＞莖＞老葉＞塊莖，CHI基因在根中的表達(dá)量顯著高于其他組織，是幼葉、莖、老葉和塊莖的1.52、2.44、2.61、4.78倍。黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，三葉崖爬藤各組織黃酮含量從高到低為莖＞根＞塊莖＞幼葉＞老葉（圖4）。CHI基因在三葉崖爬藤根、幼葉、老葉中表達(dá)量與總黃酮量變化趨勢(shì)一致，莖和塊莖中基因表達(dá)量與總黃酮含量趨勢(shì)不一致，對(duì)2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，各組織中基因表達(dá)量與總黃酮含量趨勢(shì)無(wú)顯著相關(guān)性。

圖4 三葉崖爬藤在各組織中的黃酮含量和CHI 基因表達(dá)量Fig.4 Flavonoid content and CHI gene expression of T.hemsleyanum in various tissues

3.4 三葉崖爬藤CHI 基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控分析

利用IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 誘導(dǎo)處理三葉崖爬藤葉片，利用RT-qPCR 對(duì)不同處理時(shí)間后CHI基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，5 種外源誘導(dǎo)物質(zhì)對(duì)三葉崖爬藤CHI基因表達(dá)量均起到不同程度的誘導(dǎo)作用。IAA 處理后，三葉崖爬藤CHI基因在96 h 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，基因表達(dá)量為對(duì)照組的7.36 倍（圖5-A）。MeJA 處理后，三葉崖爬藤CHI基因表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加，基因表達(dá)量呈逐漸上升的變化趨勢(shì)，48 h 后基因表達(dá)量開(kāi)始顯著高于對(duì)照組，96 h 基因表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照組的11.61 倍，說(shuō)明MeJA 對(duì)CHI基因誘導(dǎo)表達(dá)效果顯著且相對(duì)較快（圖5-B）。ABA 處理后，CHI基因表達(dá)量呈現(xiàn)先穩(wěn)定后迅速提高的趨勢(shì)，在72 h 和96 h 顯著提高了三葉崖爬藤CHI基因表達(dá)量，在處理后72 h 達(dá)到最高，為對(duì)照組的5.04 倍（圖5-C）。SA、YE 處理后，三葉崖爬藤CHI基因表達(dá)量也呈現(xiàn)先穩(wěn)定后迅速提高的趨勢(shì)，均在96 h 顯著提高了三葉崖爬藤CHI基因表達(dá)量，相比對(duì)照組分別提高了8.62 倍和5.71 倍（圖5-D、5-E）。結(jié)果表明，5 種外源物質(zhì)對(duì)三葉崖爬藤CHI基因表達(dá)有重要的誘導(dǎo)提高作用。

為進(jìn)一步探究5 種外源誘導(dǎo)處理下三葉崖爬藤黃酮含量積累情況，對(duì)各誘導(dǎo)處理下的三葉崖爬藤黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，ABA 處理對(duì)黃酮積累效果最為明顯，相比對(duì)照組提高了1.97 倍，其次是YE 和SA，相比對(duì)照組提高了1.74 倍和1.57 倍，最后是MeJA 和IAA 比對(duì)照組提高了1.42 倍和1.31倍（圖5-F）。利用不同誘導(dǎo)物質(zhì)處理后，對(duì)三葉崖爬藤黃酮含量的影響雖具有一定差異性，但較對(duì)照組黃酮含量均顯著提高。結(jié)果表明，5 種外源物質(zhì)均促進(jìn)三葉崖爬藤黃酮含量積累。

3.5 不同誘導(dǎo)處理對(duì)CHI 酶活性的影響分析

為進(jìn)一步探究5 種外源誘導(dǎo)物質(zhì)在翻譯水平上對(duì)黃酮含量積累的作用，對(duì)各誘導(dǎo)處理下三葉崖爬藤CHI 酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 處理下CHI 酶活性與對(duì)照組相比顯著提高（圖6）。IAA 處理后，0～48 h CHI 酶活性無(wú)顯著差異，處理后72 h，CHI 酶活性才顯著提高，96 h 達(dá)到最高，相比對(duì)照組提高了3.23 倍（圖6-A）。MeJA 處理后，0～72 h 酶活性基本持平，只在處理后96 h 顯著提高，相比對(duì)照組提高了1.76 倍（圖6-B）。ABA 處理后，0～48 h CHI 酶活性基本無(wú)變化，72 h 后CHI 酶活性才顯著提高，96 h 達(dá)到最高，相比對(duì)照組提高2.41 倍（圖6-C）。SA 和YE在處理后0～24 h 酶活性都無(wú)顯著差異，48 h 開(kāi)始顯著提高，在96 h 后酶活性進(jìn)一步提高，相比對(duì)照組分別提高了2.39 倍和2.95 倍（圖6-D、6-E）。該5 種誘導(dǎo)物質(zhì)對(duì)CHI 酶活性均有不同程度的促進(jìn)作用，結(jié)合黃酮含量積累結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明外源物質(zhì)誘導(dǎo)提高了CHI 酶的活性，加速了次生代謝產(chǎn)物黃酮的合成。

圖6 5 種外源因素 [IAA (A)、MeJA (B)、ABA (C)、SA(D)、YE(E)] 對(duì)三葉崖爬藤CHI 酶活性的影響Fig.6 Effect of five exogenous factors [IAA (A), MeJA (B), ABA (C), SA(D), YE(E)] on CHI enzyme activity of T.hemsleyanum

3.6 三葉崖爬藤黃酮含量、CHI 基因表達(dá)量和CHI酶活性的相關(guān)性

利用SPSS 26.0 進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸分析，結(jié)果表明，5 種外源誘導(dǎo)處理雖然在黃酮合成途徑中對(duì)黃酮的積累及CHI基因的表達(dá)有顯著促進(jìn)作用，但在各誘導(dǎo)處理下，黃酮含量與CHI基因表達(dá)量之間未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，黃酮含量與CHI 酶活性的相關(guān)系數(shù)要高于CHI基因表達(dá)（R2＝0.453，P＜0.01），說(shuō)明黃酮含量與CHI 酶活性存在中等相關(guān)，在各誘導(dǎo)處理下，CHI 酶活性變化顯著影響黃酮含量。

4 討論

藥用植物三葉崖爬藤用途廣泛，市場(chǎng)需求量大，其中含有的黃酮類(lèi)化合物具有抗癌、抗炎等多種不同的藥理作用，提高三葉崖爬藤內(nèi)源性黃酮含量尤為重要。CHI是黃酮合成途徑的關(guān)鍵基因之一，具有重要的作用，它調(diào)控早期黃酮類(lèi)合成途徑，提高CHI 酶活性，可以提高植物中黃酮類(lèi)、花色素等有效成分的含量[22]。本研究基于前期三葉崖爬藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，三葉崖爬藤CHI基因全長(zhǎng)1 096 bp，含有一個(gè)長(zhǎng)為714 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼的237 個(gè)氨基酸，通過(guò)測(cè)定三葉崖爬藤根、莖、塊莖、老葉、幼葉的黃酮含量及黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因CHI的表達(dá)量，探究黃酮含量和CHI基因表達(dá)差異及其關(guān)系。CHI基因在三葉崖爬藤各組織中均有表達(dá)，以三葉崖爬藤塊莖中CHI基因表達(dá)量為參照，表達(dá)量從高到低為根＞幼葉＞莖＞老葉＞塊莖，說(shuō)明CHI基因在不同部位的時(shí)空表達(dá)特性不同，各組織總黃酮含量從高到低為莖＞根＞塊莖＞幼葉＞老葉，不同部位總黃酮含量存在著明顯差異，這與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[23]，同時(shí)也證明三葉崖爬藤全草均可入藥一說(shuō)。三葉崖爬藤各組織中CHI基因表達(dá)與黃酮含量并無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明黃酮含量與三葉崖爬藤CHI基因的表達(dá)具有差異性，推測(cè)自然狀態(tài)下三葉崖爬藤黃酮含量積累不完全只受到CHI基因表達(dá)量的影響，還受到黃酮類(lèi)合成途徑中其他重要的限速酶影響，說(shuō)明黃酮類(lèi)生物合成途徑是復(fù)雜多變的，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，各類(lèi)非生物脅迫因素也是黃酮生物合成和積累的調(diào)節(jié)劑，如植物激素尤其是生長(zhǎng)素或其他外源誘導(dǎo)物質(zhì)可以調(diào)控黃酮類(lèi)化合物合成途徑和有效成分的積累[24-26]。

本研究利用IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 誘導(dǎo)處理三葉崖爬藤，結(jié)果表明，CHI基因表達(dá)量和黃酮含量均表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，其他物種的CHI基因也受到本實(shí)驗(yàn)中5 種外源誘導(dǎo)物質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)，IAA 誘導(dǎo)草莓FragariaananassaDuch.CHI的表達(dá)，從而使總黃酮、總酚、花色苷的含量得到積累[27]。外源添加MeJA 不僅增強(qiáng)了黃芩Scutellaria baicalensisCHI基因表達(dá)，而且使黃岑產(chǎn)生更多的黃芩苷、黃芩素等黃酮化合物[28]，植物激素ABA、SA 誘導(dǎo)愈傷組織中白香木AquilariasinensisCHI基因表達(dá)，從而積累了內(nèi)源黃酮類(lèi)化合物[29]。YE 可以誘導(dǎo)甘草GlycyrrhizauralensisFisch.毛狀根中CHI基因表達(dá)，使CHI的轉(zhuǎn)錄水平和CHI 酶活性顯著提高，從而積累甘草毛狀根中的黃酮含量[30]。研究成果表明，CHI基因表達(dá)量、CHI 酶活性、黃酮含量受到本實(shí)驗(yàn)5 種外源物質(zhì)不同程度的誘導(dǎo)，說(shuō)明外源誘導(dǎo)物質(zhì)對(duì)三葉崖爬藤CHI基因響應(yīng)和黃酮代謝具有重要作用。究其原因，一方面，這些外源誘導(dǎo)物質(zhì)作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)三葉崖爬藤CHI基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，另一方面，在翻譯水平上，三葉崖爬藤CHI 酶活性水平得以提高，從而產(chǎn)生并積累大量的次生代謝產(chǎn)物。

不同誘導(dǎo)物質(zhì)下三葉崖爬藤黃酮含量和CHI基因表達(dá)量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，5 種誘導(dǎo)處理下，黃酮含量與CHI基因表達(dá)量并無(wú)顯著相關(guān)性，在枸杞中，CHI基因表達(dá)量與類(lèi)黃酮含量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，而CHI 酶活性與類(lèi)黃酮含量達(dá)到顯著相關(guān)關(guān)系[31]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。說(shuō)明黃酮合成途徑錯(cuò)綜復(fù)雜，CHI基因作為黃酮合成途徑上游基因，對(duì)最終代謝產(chǎn)物的積累不起決定性作用，也可能還受到其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

不同誘導(dǎo)物質(zhì)下三葉崖爬藤黃酮含量和CHI酶活性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，黃酮含量與CHI 酶活性存在顯著正相關(guān)。在煙草中CHI 酶活性與黃酮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[32]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。說(shuō)明5種外源處理可以強(qiáng)烈激活CHI 酶的活性，促使產(chǎn)物黃酮生成與積累，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其活性整體呈逐漸上升的趨勢(shì)，CHI 作為關(guān)鍵酶參與到了黃酮合成途徑中。外源物質(zhì)的誘導(dǎo)、關(guān)鍵酶基因的表達(dá)、生物合成關(guān)鍵酶活性的變化以及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與積累之間存在相互交織的關(guān)系。因此，通過(guò)外源誘導(dǎo)物質(zhì)提高關(guān)鍵酶基因的表達(dá)及酶活性的提高是藥用有效成分積累的方法之一。外源誘導(dǎo)物質(zhì)可能通過(guò)多方面影響黃酮合成通路關(guān)鍵基因，因此可通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析對(duì)各關(guān)鍵基因調(diào)控黃酮合成的機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突