戴家齊，賀 婧，朱曉藍，王立元，龍 凱，周立分，楊安金，翁美芝*，謝小梅*

1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

2.南昌大學轉化醫(yī)學研究院，江西 南昌 330031

3.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

淡豆豉為豆科植物大豆的成熟種子與桑葉、青蒿等輔料經發(fā)酵加工而成，是我國特有的藥食兩用中藥。黃曲霉菌Aspergillusflavus廣泛存在于環(huán)境中，侵染農作物、中藥材等[1]。本實驗室前期研究表明，在淡豆豉炮制中的“黃衣上遍”和“再悶”前期均分離出黃曲霉菌，可能因炮制的特殊環(huán)境及微生物抑制等多重因素，至“再悶”后期產毒黃曲霉菌和黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）含量逐漸減少直至消失[2]。

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是黃曲霉菌和寄生曲霉菌A.parasiticus等真菌產生的次級代謝物，在已知多種AFT 中，AFB1的毒性最強，分布廣泛、具強致癌性、且難以清除，被世界衛(wèi)生組織列為I 類致癌物[3]。李汶等[4]報道淡豆豉中AFB1含量高達21.52 ng/g，Qiu 等[5]報道多批次淡豆豉樣品存在AFT 污染其陽性率為81.8%，淡豆豉因發(fā)酵不充分被產毒株污染的風險提升，安全性難以保證[6]。

γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，是人體重要的抑制性神經遞質，能從根本上起到抗焦慮、促進睡眠等作用，與淡豆豉主治“虛煩不眠”相吻合。本實驗室首次報道淡豆豉中富含γ-氨基丁酸，并篩選出多株產γ-氨基丁酸微生物[7-8]?；诖?，本實驗考察從淡豆豉炮制中分離的15 株產γ-氨基丁酸微生物對產毒黃曲霉菌的拮抗能力，并篩選出具有抑制產毒黃曲霉菌生長和降解AFB1的高效拮抗菌，進一步探究其對黃曲霉毒素合成關鍵基因mRNA 表達的影響。研究結果將為淡豆豉的AFT 污染防控、提高“虛煩不眠”之療效、揭示其炮制機制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗菌株

產毒黃曲霉標準株A.flavus，購于中國普通微生物菌種保藏中心，編號CGMCC3.4408；產γ-氨基丁酸微生物15 株（真菌8 株，細菌7 株）均為本實驗室從淡豆豉炮制中分離、鑒定并保存[8]，由江西中醫(yī)藥大學謝小梅教授和王立元副教授鑒定和命名，具體NCBI 對比結果見表1。

表1 淡豆豉中產γ-氨基丁酸真菌和細菌的NCBI 對比結果Table 1 NCBI comparison results of γ-amino butyri acidproducing fungi and bacteria in Sojae Semen Praeparatum(SSP)

1.2 試劑及儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基，批號20230216、20201017，青島海博生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB），批號505E031，北京索萊寶科技有限公司；種子培養(yǎng)基、細菌發(fā)酵培養(yǎng)基、真菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方參見實驗室前期研究[9]；AFB1對照品，質量分數≥98.0%，A832707-1mg，麥克林公司；M5 Plant RNeasy Plus Mini Kit 試劑盒，批號22HB0613，北京聚合美生物有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTM（Tli RNase HPlus），批號AM81776A、AM61256A，TaKaRa 生物技術公司；Nexera X2 型超快速液相色譜儀，日本島津公司；AB Sciex QTRAP 4500 型三重四極桿線性離子肼串聯質譜儀，美國AB Sciex 公司；7500 Real Time PCR System（ABI75000），Applied Biosystems公司。

2 方法與結果

2.1 平板對峙法與十字交叉法檢測各待測菌及其發(fā)酵產物對產毒標準株生長的影響

2.1.1 各待測菌對產毒標準株生長的影響 參考本課題組前期研究[9]，活化后培養(yǎng)各待測菌及產毒標準株，吸取1×105CFU/mL 的產毒標準株孢子液10μL 接種于培養(yǎng)基中央，用十字交叉法接種20 μL 1×107CFU/mL 各待測菌孢子液（真菌）或種子液（細菌）于等距的四端，以僅接種1×105CFU/mL 的產毒標準株孢子液于培養(yǎng)基中央作為對照組，28 ℃培養(yǎng)5 d，記錄產毒標準株菌落直徑，每組3 個平行，計算生長抑制率，結果見表2 和圖1。2 株黑曲霉菌JD2、JC2 對產毒標準株的生長抑制效果為真菌中最佳，抑制率分別為56.05%、55.58%；2 株枯草芽孢桿菌Xd3、Xd1 對產毒標準株的生長抑制效果為細菌中最佳，抑制率分別為39.10%、29.64%。

圖1 對峙法檢測各待測菌對產毒標準株生長的影響Fig.1 Growth effect against toxigenic A.flavus of different strains each microorganisms detected by plate confrontation culture

表2 15 株菌及其發(fā)酵產物對產毒標準株的生長抑制率和AFB1 降解率 (±s, n = 3)Table 2 Growth inhibition of A.flavus and degradation of AFB1 by 15 strains (±s, n = 3)

表2 15 株菌及其發(fā)酵產物對產毒標準株的生長抑制率和AFB1 降解率 (±s, n = 3)Table 2 Growth inhibition of A.flavus and degradation of AFB1 by 15 strains (±s, n = 3)

菌株編號生長抑制率/% AFB1 降解率/%平板對峙 發(fā)酵產物JD2 56.05±1.16 48.78±1.18 41.52±0.48 MD1 45.34±2.13 34.62±0.48 11.17±1.29 MD2 15.88±0.39 29.73±0.83 24.56±0.93 JC2 55.58±1.02 52.12±0.32 57.87±0.86 MG1 16.19±1.56 25.74±0.96 11.11±0.84 MA3 46.91±0.45 35.01±0.79 17.04±1.53 ME3 21.08±0.39 28.57±1.37 8.21±0.12 ME4 21.24±0.80 31.27±1.44 19.80±0.86 9R2 25.06±1.14 29.47±0.96 26.12±0.53 Z3R3 27.05±1.42 38.87±1.11 12.59±1.12 Xd3 39.10±2.27 43.76±1.7 29.54±0.51 Xd1 29.64±2.13 38.48±0.18 43.93±0.93 15R3 22.01±0.57 32.95±1.19 13.44±0.97 9R3 16.36±1.84 34.75±0.95 43.76±0.90 15r1 26.59±1.31 28.31±1.31 2.74±0.39

抑制率＝(對照組菌落直徑－實驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑

2.1.2 各待測菌發(fā)酵產物對產毒標準株生長的影響取1 mL 1×107CFU/mL 各待測菌孢子液或種子液于25 mL 相應的發(fā)酵培養(yǎng)基中，細菌于37 ℃發(fā)酵3 d，真菌于28 ℃、120 r/min 發(fā)酵7 d，11 269.44×g離心5 min 后取上清液，0.22 μL 濾膜除菌得發(fā)酵產物。取8 mL 與20 mL PDA 在培養(yǎng)皿中混勻凝固后，于培養(yǎng)皿中央接種20 μL 1×105CFU/mL 的產毒標準株孢子液，以中央僅接種1×105CFU/mL 產毒菌標準株孢子液作對照。28 ℃培養(yǎng)5 d，記錄菌落直徑，計算抑菌率，每組3 個平行。結果顯示，黑曲霉菌JD2（48.78%）和JC2（52.12%）、溜曲霉菌MA3（35.01%）和MD1（34.62%）等真菌及枯草芽孢桿菌Xd1（38.48%）和Xd3（43.76%）鳥腸球菌Z3R3（38.87%）和9R3（34.75%）等細菌的抑制率較高，結果見表2 和圖2。

圖2 各待測菌發(fā)酵產物對產毒標準株生長的影響Fig.2 Effect of fermentation product of different strains on growth of toxigenic A.flavus

抑菌率＝(對照組菌落直徑－實驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑

2.2 UPLC-MS/MS 法檢測各待測菌對AFB1 的降解率

本課題組前期已建立了UPLC-MS/MS 法測定AFB1，具體色譜及質譜條件參考前期報道[9]。

2.2.1 對照品溶液的制備 精確量取0.1 mg AFB1對照品于50 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得2 μg/mL 的AFB1對照品儲存液。

2.2.2 供試品溶液的制備 吸取1 mL 1×107CFU/mL 待測菌孢子液或種子液，于25 mL 相應的發(fā)酵培養(yǎng)基中，細菌37 ℃培養(yǎng)2 d、真菌28 ℃培養(yǎng)3 d 后，避光吸取980 μL 各菌發(fā)酵液，加入20μL 100 μg/mL 的AFB1對照品，對照組不接種待測菌發(fā)酵液，37 ℃避光孵育72 h。取孵育后液體各1 mL，氮氣吹至近干，加1 mL 甲醇復溶，10 000×g離心10 min，上清液經0.22 μm 濾膜濾過，UPLCMS/MS 上機檢測。

2.2.3 線性關系考察 將AFB1對照品儲存液配置成各個質量濃度的AFB1對照品溶液（10、50、100、150、200、250、300 ng/mL），混勻，上機測定。得AFB1回歸方程為Y＝2 154.4X＋397.36，r＝0.999 2，結果表明，AFB1在10～200 ng/mL 呈現良好的線性關系。

2.2.4 精密度考察 配制AFB1質量濃度為100 ng/mL 的對照品溶液，連續(xù)重復進樣6 次，按峰面積計算，RSD 為1.87%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 取無菌發(fā)酵液6 份，精密加AFB1對照品溶液，使終質量濃度為100 ng/mL。按“2.2.2”項下方法制備，分別測定制備后0、4、8、12、16、20、24 h 時的AFB1含量，以峰面積計算，RSD 為0.51%，結果表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復性考察 取無菌發(fā)酵液6 份，精密加AFB1對照品溶液，使終質量濃度為100 ng/mL。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣2 μL 測定，以AFB1質量濃度來計算，RSD 為1.50%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率考察 取無菌發(fā)酵液9 份，精密加入50、150、300 ng/mL 的對照品溶液（各3 份），得到高、中、低不同加標質量濃度的樣品，依“2.2.2”項方法進行樣品處理，進樣檢測含量。

再用甲醇制備相應質量濃度的對照品溶液，進樣分析，檢測含量。以發(fā)酵液為基質，測得低、中、高3 個質量濃度水平時AFB1的平均加樣回收率分別為98.51%、96.70%、96.76%，RSD 分別為0.47%、2.13%、1.19%。

2.2.8 AFB1降解率分析 AFB1降解實驗中部分待測菌的UPLC-MS/MS 色譜圖見圖3，結果顯示，各待測菌發(fā)酵產物對AFB1均有一定降解作用，其降解率大小依次為JC2＞Xd1＞9R3＞JD2；15 株待測菌發(fā)酵產物對AFB1降解率在2.74%～57.87%，JC2為真菌中最強，Xd1 為細菌中最強。結果見表2。

圖3 AFB1 降解作用液質色譜圖Fig.3 UPLC/MS/MS chromatogram of AFB1 degradation

綜上，15 株產γ-氨基丁酸微生物對產毒黃曲霉菌均有一定的拮抗能力，根據它們對產毒標準株生長的抑制效果以及對AFB1降解率，綜合篩選出具有高效拮抗作用的真菌和細菌各1 株（JC2 和Xd1）。

2.3 高效拮抗菌對產毒標準株的菌絲生長以及AFT 合成關鍵基因mRNA 表達的影響

篩選出高效拮抗菌（JC2、Xd1）之后，用菌絲干重法檢測其發(fā)酵產物對產毒標準株菌絲干重的抑制情況；利用RT-qPCR 法檢測其對AFT 合成關鍵基因mRNA 表達的影響。

2.3.1 菌絲干重法 于20 mL PDB 培養(yǎng)基中接種1 mL 1×106CFU/mL 的產毒標準株孢子液，按“2.1.2”項下方法制備高效拮抗菌發(fā)酵產物，分別按0、250、500、1 000、1 500、2 000 μL 加入到PDB 中，28 ℃培養(yǎng)5 d 至產毒中期。無菌紗布濾過，收集菌絲體于60 ℃烘至恒定質量，測定菌絲體干質量，每組3個平行，以僅接種1 mL 1×106CFU/mL 的產毒標準株孢子液為對照組，計算抑制率。結果見圖4，JC2 與Xd1 發(fā)酵產物對產毒標準株菌絲生長均有顯著抑制作用，隨著發(fā)酵產物加入量的增加，抑制率逐漸上升，當加入量達到2 000 μL 時，JC2 和Xd1菌絲生長抑制率分別為73.82%和63.34%，抑制作用良好，表明JC2 和Xd1 發(fā)酵產物能明顯抑制產毒黃曲霉菌生長。

圖4 高效拮抗菌發(fā)酵產物對產毒標準株菌絲干重的影響Fig.4 Effect of highly efficient antagonistic microorganisms fermentation products on mycelia dry weight of toxigenic A.flavus

抑制率＝(對照組菌絲體干質量－實驗組菌絲體干質量)/對照組菌絲體干質量

2.3.2 RT-qPCR 法

（1）總RNA 的提?。喊础?.3.1”項下條件培養(yǎng)產毒標準株至產毒中期，分別取加入了500、1 000、2 000 μL 高效拮抗菌發(fā)酵產物的黃曲霉菌絲，抽濾，于液氮中迅速冷凍，?80 ℃冰箱保存。再取未加入高效拮抗菌發(fā)酵產物的黃曲霉菌絲作為空白組進行同樣操作。提取RNA 所用的玻璃器皿、研缽等用0.1% DEPC 水37 ℃浸泡12 h，121 ℃滅菌30 min，稱取凍存的新鮮菌絲100 mg，液氮研磨法進行RNA提取，具體方法參見M5 Plant RNeasy Plus Mini Kit試劑盒說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，超微量分光光度計檢測RNA 質量濃度。所提取的總RNA 其A260/A280比值在1.8～2.0，完整性好，無降解，可用于后續(xù)反應。

（2）去DNA 反應：對樣品中可能存在的DNA進行去除，向除酶管中加入total RNA 1 μg，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，補Rnase free dH2O 至10 μL，在PCR 儀中42 ℃ 2 min反應，4 ℃下保存。

（3）cDNA 的合成：采用TaKaRa 反轉錄試劑盒進行。反應體系：總RNA 10 μL，Rnase free dH2O 4 μL，5×Prime Script Buffer 4 μL，RT Prime MTX 1 μL，Prime Script RT Engme MTXⅠ 1 μL。反轉錄條件：37 ℃、15 min；85 ℃、5 s；1 個循環(huán)。

（4）RT-qPCR 檢測基因的表達情況：方法要求設計引物的合成片段不宜過大（50～200 bp），選用18S rRNA（F: 3’-GCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGG-5’；R: 3’-CGCTATTGGAGCTGGAATTACC-5’）作為內參基因，其他所用引物為aflR（F: 3’-GATAGCTGTACGAGTTGTGC-5’；R: 3’-CAGCCCAGCGGGGCGTGGGG-5’）[10]，aflD（F: 3’-ACCGCTACGCCGGCACTCTCGGCAC-5’；R: 3’-GTTGGCCGCCAGCTTCGACACTCCG-5’）[10]，aflM（F: 3’-GTGGGCCTCCCTGTGGAT-5’；R: 3’-CACTTACCCATTCGGCTGTGT-5’）[11]、aflP（F: 3’-CACGCTTTCAGAGCAGGTAA-5’；R: 3’-TTCGGTGGAGGAGGGAGTT-5’）[12]。采用TaKaRa 公司的TB Green?Premix Ex TaqTM進行RT-qPCR 反應，反應體系：稀釋后的cDNA 溶液2 μL，TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，dH2O 6.8 μL，反應設1 復孔，以2 μL dH2O 取代cDNA 作為空白對照。每組3 個平行。反應條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 循環(huán)；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s。

（5）引物特異性：將4 對特異性引物進行實時熒光定量PCR 反應，觀察熔解曲線是否為單一峰，以判斷引物的特異性，結果見圖5。4 對引物的熔解曲線均為單一峰，可見設計的引物特異性良好。

圖5 熒光定量PCR 4 對引物熔解曲線Fig.5 RT-qPCR four-pair primer dissolution curve

（6）數據分析：反應結束后，用2?ΔΔCt法計算不同樣品中各基因的相對表達量，結果見表3。隨著發(fā)酵產物加入量的增加，2 株高效拮抗菌對毒素合成4個關鍵基因的mRNA 表達水平下調趨勢逐漸顯著，當JC2 發(fā)酵產物加入量為2 000 μL 時，aflR表達下調最為明顯，依次為aflD、aflM、aflP；當Xd1 發(fā)酵產物加入2 000 μL 時4 個基因下調程度由高到低依次為aflD、aflR、aflP、aflM。

表3 高效拮抗菌發(fā)酵產物對黃曲霉菌毒素合成關鍵基因mRNA 表達量的影響 (±s, n = 3)Table 3 Effect of highly efficient antagonistic fermentation products on mRNA expression of key genes in aflatoxin synthesis(±s, n = 3)

表3 高效拮抗菌發(fā)酵產物對黃曲霉菌毒素合成關鍵基因mRNA 表達量的影響 (±s, n = 3)Table 3 Effect of highly efficient antagonistic fermentation products on mRNA expression of key genes in aflatoxin synthesis(±s, n = 3)

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。*P < 0.05 **P < 0.01 vs blank group.

組別 發(fā)酵產物加入量/μL基因mRNA 相對表達量（2?ΔΔCt）aflR aflD aflM aflP空白 0 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 JC2 500 0.426±0.008** 0.858±0.035** 0.437±0.012** 0.841±0.045**1 000 0.242±0.032** 0.380±0.049** 0.405±0.045** 0.560±0.019**2 000 0.098±0.005** 0.220±0.021** 0.263±0.025** 0.266±0.003**Xd1 500 0.566±0.036** 0.228±0.017** 0.697±0.018** 0.482±0.028**1 000 0.415±0.026** 0.107±0.009** 0.367±0.040** 0.349±0.010**2 000 0.144±0.017** 0.075±0.003** 0.245±0.042** 0.176±0.005**

ΔΔCt＝(Ct靶基因－Ct內參)試驗組－(Ct靶基因－Ct內參)空白組

Ct表示在反映中cDNA 樣本熒光信號達到設定閾值所需的循環(huán)數

3 討論

目前，AFT 的去除方法主要包括物理法、化學法和生物法。生物法降解AFT 相比于常規(guī)的物理、化學法更加溫和、安全和經濟。本實驗從15 株產γ-氨基丁酸微生物中篩選出具有抑制產毒黃曲霉菌生長和降解AFB1的高效拮抗菌——黑曲霉菌（JC2）和枯草芽孢桿菌（Xd1），黑曲霉菌不僅可以有效抑制產毒黃曲霉菌的生長，使其生長速度減慢，還可以有效降解培養(yǎng)基中已經產生的AFB1，它是通過直接代謝和分泌胞外酶（主要方式）2 種途徑共同降解AFB1的[13]。

有學者[14]從黑曲霉發(fā)酵產物中分離出了一種能明顯干擾AFT 毒素合成信號傳導途徑、抑制黃曲霉生長的抗真菌肽（antifungal peptide，AFP），認為黑曲霉抑制黃曲霉菌的活性成分可能主要為其分泌具有半胱氨酸的抗真菌肽；此外，枯草芽孢桿菌也主要通過分泌胞外活性物質來抑制產毒黃曲霉菌生長和降解黃曲霉毒素，這些化合物，尤其是脂肽和蛋白酶，是抑制黃曲霉菌生長和脫除AFT 的有效因子[15]。其機制可能是拮抗物質使菌絲細胞壁出現消融，降低孢子萌發(fā)率來實現[16]。另外，目前國內外已有將黑曲霉菌[17]、枯草芽孢桿菌[18]作為生防菌防控AFT 的應用研究。

近年來，隨著AFT 合成及調控機制的研究深入，已經確定位于黃曲霉菌3 號染色體端粒上的一段包含30 個基因的基因簇影響著AFT 合成，它們的mRNA 表達水平直接影響AFT 的合成水平[19]。其中，aflR編碼一個具有鋅指結構的DNA 結合蛋白（AfLR），該蛋白可以結合AFT 途徑基因啟動子區(qū)的回文序列（5’-TCGN5CGA-3’）從而激活基因的表達，因此aflR基因對AFT 合成來說是必需的，有研究表明：aflR基因轉錄水平在產毒黃曲霉菌中很明顯，在不產毒黃曲霉菌株中，aflR基因的轉錄卻受到了明顯的抑制，甚至不表達[20]。合成AFT 至少經歷18 個酶促反應，而位于毒素合成基因簇上的aflD、aflM、aflP所表達的AFLD、AFLM 和AFLP蛋白分別在AFT 合成早、中、晚期起著至關重要的催化作用[21]。它們的表達直接調控著產AFT 微生物毒素合成代謝路徑上多個關鍵物質的轉化[22-24]。

本實驗發(fā)現，JC2、Xd1 發(fā)酵產物在PDB 中具有很強的抑制產毒黃曲霉標準株菌絲生長作用；不同濃度發(fā)酵產物作用后，提取菌絲RNA 進行實時熒光定量PCR，它們對黃曲霉毒素合成激活基因及毒素合成的早、中、晚期催化基因的mRNA 表達量均有明顯抑制，JC2 發(fā)酵產物對aflR基因的mRNA表達下調最為明顯，而Xd1 對aflD基因的mRNA表達下調最明顯，推測JC2 可能主要通過下調毒素合成激活基因的表達，而Xd1 可能主要通過限制毒素合成早期諾素羅瑞尼克酸（NOR）的轉化[22]。

本實驗篩選的高效拮抗菌JC2、Xd1，在其安全性達標之后，通過混菌發(fā)酵[25]等方法不僅能為提高淡豆豉γ-氨基丁酸含量提供有潛力的候選菌株，也將為防控淡豆豉的AFT 污染、揭示“再悶”后期AFT 降解機制提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突