徐杰,徐雯晴,孫欽秀,2,3*,王澤富,3,高加龍,3,吉宏武,3,劉書成,3

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室,廣東 湛江,524088) 2(江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇海洋大學(xué),江蘇 連云港,222005) 3(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)

金鯧魚(Trachinotusovatus)是中國五大海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一,富含蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]。但是由于金鯧魚含有較高的水分含量以及自身所含酶類使蛋白質(zhì)降解成小分子產(chǎn)物,這有助于微生物快速繁殖發(fā)生腐敗變質(zhì),通過殺菌技術(shù)可以延緩金鯧魚品質(zhì)劣變,延長貨架期[2]。目前食品中常見的殺菌技術(shù)主要包括熱殺菌技術(shù)和非熱殺菌技術(shù)。傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)雖然能夠有效殺滅食品中的微生物,但高溫也會對食品的感官特性和風(fēng)味等產(chǎn)生不良影響[3]。

低溫等離子體(cold plasma,CP)被稱為固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)之外的物質(zhì)第四態(tài),是由活性物質(zhì)(活性氮和活性氧等)、帶電粒子、自由電子等組成的一種電離氣體[4]。CP作為新型非熱加工技術(shù),具有作用溫度低、不含化學(xué)物質(zhì)、環(huán)保、操作成本低等優(yōu)點,在殺滅各類常見微生物、延長食品貨架期、替代食品添加劑等方面具有重要作用[5-7]。

目前,CP已廣泛應(yīng)用于食品保鮮,如亞洲鱸魚、帶魚、南美白對蝦以及豬肉等[7-8]。本研究前期發(fā)現(xiàn),CP處理金鯧魚可以有效抑制腐敗微生物的生長,且電壓越高,抑菌效果越好,但過高電壓會導(dǎo)致肌肉品質(zhì)劣變。這可能是因為CP體系中含有的活性氮、活性氧等物質(zhì)使蛋白發(fā)生氧化,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性,進(jìn)而影響食品品質(zhì)[8]。PéREZ-ANDRéS等[9]發(fā)現(xiàn)CP處理可以加速鯖魚中羰基的形成,造成蛋白質(zhì)不可逆損傷。但也有研究指出,對蛋白質(zhì)進(jìn)行適度氧化修飾,可能會改善肉品的加工特性和品質(zhì),如提升肉品在人體的消化吸收率、產(chǎn)生特定風(fēng)味以及提升嫩度和保水性等[10]。

因此,本研究以金鯧魚為研究對象,探究不同低溫等離子體電壓(10、20、30 kV)處理對金鯧魚肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MP)的Ca2+-ATP酶活性、肌原纖維小片化指數(shù)(myofibrillary fragmentation index,MFI)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶解肽、總氨基酸含量、二級結(jié)構(gòu)變化(紅外光譜)、三級結(jié)構(gòu)變化(表面疏水性、紫外吸收光譜)等的影響,結(jié)合SDS-PAGE電泳分析,綜合評價CP處理對金鯧魚肉MP結(jié)構(gòu)特性的影響,以期為金鯧魚冰鮮產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鯧魚,鮮活,體表無傷,體質(zhì)量為(500±50) g,湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場。

Tris-緩沖液(1 mol/L)、10×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、PM2610蛋白marker,北京酷來搏科技有限公司;溴酚藍(lán)(bromophenol blue,BPB,分析純),上海麥克林生化科技有限公司;溴化鉀(紅外光譜測定用),上海安譜實驗科技股份有限公司;A070-4 Ca2+-ATP酶測試劑盒,南京建成生物工程研究所;BC1575氨基酸含量檢測試劑盒、PC0030 Lowry蛋白濃度測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;P0006 Bradford蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CTP-2000S型等離子體處理裝置,南京蘇曼等離子科技有限公司;T25型高速均質(zhì)機(jī),德國IKA集團(tuán);Varioskan Flash型酶標(biāo)儀,美國Thermo Fisher公司;3-30KS型高速冷凍離心機(jī),德國Sigma Laborzentrifugen公司;TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker公司;Cary 60型紫外分光光度計,美國Agilent公司;GelDoc EZ G型凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

金鯧魚充氧運輸至實驗室后冰浴猝死,潔凈水洗凈,拭干,取背部肌肉,去骨、皮,切成4 cm×3 cm×1 cm塊狀(大約20 g)。將所有樣品隨機(jī)分為4組,一組為未處理組(0 kV),其余3組在頻率9 kHz、極板間距20 mm、處理時間45 s的條件下對魚肉進(jìn)行不同CP電壓處理(10、20、30 kV)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考LI等[11]的方法略有修改。向2 g攪碎的魚肉中加入20 mL 20 mmol/L Tris-緩沖液A(0.05 mol/L KCl,pH 7.0),冰水浴10 000 r/min均質(zhì)30 s后,在4 ℃下10 000 r/min離心15 min,棄上清液,收集沉淀,重復(fù)2次。向得到的沉淀中加入20 mL 20 mmol/L Tris-緩沖液B(0.6 mol/L KCl,pH 7.0),相同條件均質(zhì)后靜置1 h,在4 ℃下10 000 r/min離心15 min后過濾,得到的上清液即為MP,濃度用雙縮脲法測定。

1.3.3 Ca2+-ATP酶活性測定

Ca2+-ATP酶活性用測試劑盒測定,ATP酶分解ATP產(chǎn)生ADP和磷,通過測定磷的量來計算Ca2+-ATP酶活性,結(jié)果表示為μmol Pi/(mg prot·h)。

1.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)測定

參考MOTTER等[12]的方法,采用Bradford法將調(diào)節(jié)MP溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,在540 nm處測定MP溶液的吸光度。計算如公式(1)所示：

MFI=A540×150

(1)

1.3.5 TCA溶解肽測定

參考SAENGSUK等[13]的方法略有修改。向2 g攪碎的魚肉中加入18 mL 5%的TCA溶液,冰水浴下12 000 r/min均質(zhì)1 min,靜置1 h后在4 ℃下10 000 r/min離心10 min,測定上清液中酪氨酸(tyrosine,Tyr)的含量,結(jié)果表示為μmol Try/g肉。

1.3.6 總氨基酸含量測定

氨基酸含量用試劑盒方法進(jìn)行測定,氨基酸的α-氨基與水合茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生在570 nm處有特征吸收峰的藍(lán)紫色化合物,通過測定其含量來計算氨基酸含量,結(jié)果表示為μmol/g肉。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜

參考藍(lán)蔚青等[14]的方法略有修改。將MP溶液冷凍干燥制成凍干粉末。將凍干粉與溴化鉀(1∶150,質(zhì)量比)混合,混勻、研磨、壓片,進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描。參數(shù)為：重復(fù)掃描64次,分辨率為4 cm-1,在400～4 000 cm-1進(jìn)行掃描。

1.3.8 表面疏水性測定

參考WANG等[15]的方法略有修改。向2 g攪碎的魚肉中加入20 mL 20 mmol/L PBS緩沖液(pH 6.0),冰水浴下12 000 r/min均質(zhì)1 min,靜置1 h,調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度至5 mg/mL。取1 mL稀釋后的溶液加入200 μL 1 mg/mL BPB,避光混勻10 min后 4 ℃下4 700 r/min離心15 min,取上清液,稀釋10倍,于595 nm處測定吸光度,記為A1。同時以PBS溶液代替蛋白溶液重復(fù)上述操作,記為A0,結(jié)果以BPB結(jié)合量表示,計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.9 紫外吸收光譜

調(diào)節(jié)MP質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,進(jìn)行紫外光譜掃描。參數(shù)為掃描速度為600 nm/min,間隔為1 nm,在270～350 nm進(jìn)行掃描。

1.3.10 SDS-PAGE電泳實驗

調(diào)節(jié)MP質(zhì)量濃度為1 mg/mL,與上樣緩沖液(5×)以體積比4∶1混合,沸水浴6 min。冷卻后使用15%分離度的膠在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析,上樣量為15 μL,電壓120 V。結(jié)束后利用考馬斯亮藍(lán) G-250進(jìn)行染色2 h,再使用脫色液V(醋酸)∶V(乙醇)∶V(水)=2∶3∶5,脫色至條帶清晰并進(jìn)行成像分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗重復(fù)3次,試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;用JMP16 pro軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,并用Tukey SD多重評估差異顯著性,95%置信區(qū)間為P<0.05;采用Origin 2021b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CP對金鯧魚肉Ca2+-ATP酶活性的影響

圖1 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚Ca2+-ATP酶活性的影響

2.2 CP對金鯧魚肉MFI的影響

MFI反映肌原纖維及其骨架蛋白完整度,MFI值越大,則MP內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重[18]。由圖2可知,當(dāng)CP電壓≤ 20 kV時,MFI與未處理組無顯著差異,這可能是由于CP在較低電壓時產(chǎn)生的活性物質(zhì)(活性氮和活性氧等)不足以使金鯧魚肌原纖維及其骨架嚴(yán)重破壞。但當(dāng)電壓為30 kV時,MFI顯著升高(P<0.05),是未處理組的1.23倍,這可能是由于CP產(chǎn)生的活性物質(zhì)(活性氮和活性氧等)以及帶電粒子導(dǎo)致肌節(jié)中z線破壞,肌原纖維間隙變大,破壞魚肉蛋白質(zhì)的完整性,從而增大了MFI[19]。唐玲玲[20]研究了CP處理后凡納濱對蝦的MFI,發(fā)現(xiàn)其MFI也隨著電壓的升高的而增加,這與CP產(chǎn)生活性粒子對MP的轟擊有關(guān)。同時,MFI也是肉嫩度的一種標(biāo)志[19],CP處理增加了MP降解的可能性,通過破壞MP緊密結(jié)構(gòu),提高肌肉嫩度,使肉制品具有更好的口感。

圖2 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)的影響

2.3 CP對金鯧魚肉TCA溶解肽的影響

TCA溶解肽作為魚類蛋白質(zhì)降解的指標(biāo),包括小肽、游離氨基酸和其他非蛋白含氮物質(zhì)(如嘧啶、吡啶和核酸等)[13]。CP處理對金鯧魚肉TCA溶解肽的影響如圖3所示。未處理組TCA溶解肽含量為0.80 μmol Tyr/g肉,隨處理電壓的上升,TCA溶解肽顯著升高(P<0.05),30 kV組比未處理組升高0.37 μmol Tyr/g肉,說明CP處理促使蛋白質(zhì)發(fā)生降解和變性。這與OLATUNDE等[21]的研究相一致,CP處理后鱸魚片TCA溶解肽含量因蛋白質(zhì)氧化發(fā)生降解而上升,經(jīng)過不同處理氣體的CP(A：90% Ar2和10% O2;B：60% CO2,30% Ar2,10% O2)處理后TCA溶解肽升高0.5～0.7 μmol Tyr/g肉(P<0.05)。這可能是由于CP產(chǎn)生的活性物質(zhì)(活性氮和活性氧等)以及帶電粒子使MP發(fā)生氧化和降解,從而導(dǎo)致小肽、游離氨基酸和其他非蛋白含氮物質(zhì)含量增加[22]。

圖3 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚TCA溶解肽的影響

2.4 CP對金鯧魚肉總氨基酸含量的影響

氨基酸含量的變化一定程度上可以反映蛋白質(zhì)的變性和降解情況[20]。由圖4可知,CP處理促使總氨基酸含量增加。但是當(dāng)電壓低于20 kV時,總氨基酸含量與未處理組差異不顯著,而電壓達(dá)到30 kV時,總氨基酸含量顯著增加(P<0.05)。這與LIN等[23]研究相似,他們發(fā)現(xiàn)生腌泥螺的總氨基酸含量經(jīng)CP處理后增加,這可能是由于CP產(chǎn)生的活性粒子與蛋白質(zhì)或者多肽等作用,使其發(fā)生變性。雖然總氨基酸含量增多,證明蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的降解,但是作為食品中的營養(yǎng)元素,氨基酸種類和數(shù)量能夠影響食品的風(fēng)味。LIN等[23]發(fā)現(xiàn)了CP處理后泥螺的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等含量顯著增加,其中谷氨酸、天冬氨酸作為重要的鮮味來源,有助于泥螺產(chǎn)生特殊風(fēng)味。綜上,CP處理雖然會引起蛋白質(zhì)氧化,但也有改善金鯧魚風(fēng)味的潛在可能性。結(jié)合圖2和圖3,CP處理一定程度上增加了小肽以及游離氨基酸等具有功能特性的物質(zhì)的含量。雖然,這些較低分子質(zhì)量的物質(zhì)不利于貯藏,但是將處理電壓控制在合理范圍內(nèi)(≤20 kV),既有改善品質(zhì)的可能性,又能防止過度氧化帶來的品質(zhì)劣化。

圖4 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚氨基酸總量的影響

2.5 CP對金鯧魚肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

圖5 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚紅外吸收光譜的影響

2.6 CP對金鯧魚肉表面疏水性的影響

表面疏水性反映了蛋白質(zhì)的變性程度,蛋白質(zhì)變性后結(jié)構(gòu)中的疏水性殘基暴露,導(dǎo)致表面疏水性升高[15]。如圖6所示,隨著CP處理電壓的升高,樣品的表面疏水性先顯著增加(電壓≤10 kV)(P<0.05),隨后趨于平緩,這可能是因為低電壓CP處理導(dǎo)致金鯧魚MP中的疏水性殘基基本完全暴露。EKEZIE等[25]同樣發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦經(jīng)CP處理30 min后表面疏水性顯著升高,這可能是由于CP處理后蛋白質(zhì)氧化,MP結(jié)構(gòu)展開,苯丙氨酸以及色氨酸等疏水性基團(tuán)暴露。然而,劉昊天等[10]認(rèn)為蛋白質(zhì)的適度氧化,會使其發(fā)生去折疊現(xiàn)象,疏水基團(tuán)的暴露增加了風(fēng)味物質(zhì)吸附在蛋白質(zhì)表面的可能性,有利于揮發(fā)性風(fēng)味的保持。

圖6 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚表面疏水性的影響

2.7 CP對金鯧魚肉紫外吸收光譜的影響

紫外光譜反映了蛋白質(zhì)發(fā)色基團(tuán)對紫外光的吸收作用,可以表征蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。如圖7所示,CP處理后金鯧魚MP的吸收強(qiáng)度高于未處理組,且隨著電壓的升高,吸光度越高且略有右移。這可能是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨著CP處理電壓的升高進(jìn)一步展開,更多酪氨酸和色氨酸殘基等芳香族氨基酸暴露,紫外吸收強(qiáng)度上升[25],這與表面疏水性結(jié)果一致,都表明蛋白質(zhì)經(jīng)過CP處理后發(fā)生一定程度的舒展。QIAN等[24]用CP活化水處理雞肉MP凝膠后發(fā)現(xiàn)CP活化水能夠促進(jìn)疏水基團(tuán)的暴露,紫外吸收強(qiáng)度上升。同時也有研究表明280 nm處的吸收強(qiáng)度上升可能與氨基酸殘基修飾有關(guān),CP產(chǎn)生的活性物質(zhì)(活性氧和活性氮等)可能可以誘導(dǎo)酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸發(fā)生羥基化以及誘導(dǎo)色氨酸和苯丙氨酸硝化[26]。

圖7 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚紫外光譜的影響

2.8 CP對金鯧魚肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

SDS-PAGE可以表征CP處理后金鯧魚肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化[25]。如圖8所示,MP主要集中在10～245 kDa,包括肌球蛋白重鏈(220 kDa)、肌動蛋白(43 kDa)、原肌球蛋白(35 kDa)等,其中肌球蛋白重鏈?zhǔn)侵饕牡鞍踪|(zhì)。經(jīng)CP處理后蛋白質(zhì)條帶數(shù)量以及強(qiáng)度未產(chǎn)生明顯變化,這說明CP對肽鍵的影響不顯著。實驗結(jié)果與KODDY等[27]對帶魚肌肉進(jìn)行50 kV CP處理(<60 s)時相似,他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過帶魚經(jīng)過CP處理后,蛋白質(zhì)條帶變化輕微。此外EKEZIE等[25]也發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦MP經(jīng)CP射流處理后,電泳條帶沒有發(fā)生明顯變化,這可能是CP處理不會改變MP分子量或使MP發(fā)生降解。但KODDY等[27]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)長時間CP處理時,蛋白質(zhì)會發(fā)生共價鍵交聯(lián)以及發(fā)生氧化而聚集,從而增強(qiáng)肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶強(qiáng)度。綜合紅外光譜(圖5)結(jié)果,說明CP短時間處理,不足以引起MP一、二級結(jié)構(gòu)的顯著變化。

圖8 不同低溫等離子體電壓處理對金鯧魚SDS-PAGE電泳的影響

3 結(jié)論

隨著CP處理電壓的增加,金鯧魚肉MFI、TCA溶解肽和總氨基酸含量升高,Ca2+-ATP酶活力下降。此外,色氨酸等疏水性基團(tuán)暴露,表面疏水性和紫外吸收強(qiáng)度增加,這表明蛋白質(zhì)發(fā)生的一定程度舒展。但是金鯧魚MP的紅外光譜和SDS-PAGE說明CP處理后蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。綜上所述,說明CP處理能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)變性,使蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,且隨著處理電壓升高,蛋白質(zhì)變性越來越嚴(yán)重。因此,在利用CP對水產(chǎn)品進(jìn)行殺菌時,應(yīng)控制處理條件,避免過高電壓導(dǎo)致的水產(chǎn)品蛋白質(zhì)的變性,減小其對魚肉品質(zhì)不利影響。同時,未來仍需深入了解CP作用機(jī)制,選擇更加合理的處理條件,以最大程度減少對食品的不良影響;還應(yīng)該對CP進(jìn)行安全性評估,使其更加安全可靠地運用于食物保存。