吳佳蓓,田恒旗,胡驍飛,孫亞寧,邢云瑞,王琳,王成賓,王耀*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng),471003) 2(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450002)

球蟲(chóng)病是指艾美爾球蟲(chóng)屬的傳染性單細(xì)胞原蟲(chóng)寄生于動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞所引起的一種寄生蟲(chóng)病,在家禽養(yǎng)殖中最為常見(jiàn),其次是兔、牛和羊等[1-2]?？骨蛳x(chóng)藥按照來(lái)源方式的不同可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是聚醚類(lèi)離子載體抗球蟲(chóng)藥,如莫能菌素、拉沙洛西等;另一類(lèi)是化學(xué)合成類(lèi)抗球蟲(chóng)藥,如常山酮、尼卡巴嗪類(lèi)等。聚醚類(lèi)抗球蟲(chóng)藥的作用機(jī)理是破壞球蟲(chóng)的細(xì)胞膜,使其失去調(diào)節(jié)滲透壓的能力,球蟲(chóng)細(xì)胞膜吸收過(guò)量的鈉、鉀離子后細(xì)胞破裂而死亡[3]。由于化學(xué)合成類(lèi)抗球蟲(chóng)藥的結(jié)構(gòu)不同,其抗球蟲(chóng)作用機(jī)理也不盡相同。例如三嗪類(lèi)抗球蟲(chóng)藥是通過(guò)抑制球蟲(chóng)體內(nèi)呼吸鏈酶的活性來(lái)抑制球蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖[4]?？骨蛳x(chóng)藥因具有低毒、價(jià)格低廉、防治球蟲(chóng)效果好等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè),但常有過(guò)量使用或不規(guī)范使用導(dǎo)致動(dòng)物性食品中藥物殘留超標(biāo)的情況。長(zhǎng)期食用藥物殘留超標(biāo)的食品,會(huì)引起人體慢性毒性作用,表現(xiàn)癥狀為多發(fā)性神經(jīng)病、橫紋肌溶解、高鈣血癥、呼吸衰竭等,甚至?xí){生命安全[5-8]。

近年來(lái),抗球蟲(chóng)藥在食品安全監(jiān)督抽檢中屢被檢出,向俊等[9]統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)2020年湖南多地區(qū)的肉類(lèi)樣品中檢出了磺胺類(lèi)藥物,其中雞肉類(lèi)樣品檢出率高達(dá)52.4%。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)中明確規(guī)定了抗球蟲(chóng)類(lèi)獸藥在食品中的最大殘留限量(表1)。因此,實(shí)現(xiàn)抗球蟲(chóng)藥殘留的快速高效檢測(cè)對(duì)保障食品安全,助力我國(guó)食品進(jìn)出口貿(mào)易都具有重大意義。目前,抗球蟲(chóng)藥殘留的檢測(cè)主要以高效液相色譜[10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[11](liquid chromatography-massspectrometry,LC-MS)和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[12](ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)等儀器分析方法為主。雖然儀器方法精密度、準(zhǔn)確度高,但儀器設(shè)備體積大,價(jià)格昂貴,樣品前處理復(fù)雜,僅適用于對(duì)準(zhǔn)確度和靈敏度要求較高的檢測(cè)和驗(yàn)證。免疫分析是一種利用標(biāo)記物(如酶、膠體金、熒光物質(zhì)等)標(biāo)記抗體或抗原并對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物進(jìn)行特異性識(shí)別,從而達(dá)到定性和定量分析的分析方法,具有靈敏、特異、快速的優(yōu)勢(shì),是快速檢測(cè)方法的主要技術(shù)支撐[13]。應(yīng)用免疫分析方法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分析方法的不足,實(shí)現(xiàn)低成本、高通量的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本文綜述了抗球蟲(chóng)藥人工抗原的合成方法和免疫分析方法研究進(jìn)展,以期為食品中抗球蟲(chóng)藥殘留的快速檢測(cè)提供參考。

表1 我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中常見(jiàn)抗球蟲(chóng)藥最大殘留限量的規(guī)定Table 1 The maximum residue limits of common coccidiostats in foods by China national standards

1 抗球蟲(chóng)藥的人工抗原合成

相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的小分子化合物具有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性,不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體,只能被稱(chēng)為半抗原(不完全抗原)[14]。只有小分子化合物與載體偶聯(lián)形成完全抗原后,才能誘導(dǎo)機(jī)體B細(xì)胞增殖分化,進(jìn)而產(chǎn)生特異性抗體用于免疫分析[15]。通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)改造方法,在半抗原分子結(jié)構(gòu)的特定位置進(jìn)行基團(tuán)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而引入連接臂,之后再與大分子載體共價(jià)結(jié)合,生成半抗原與載體的偶聯(lián)物,此偶聯(lián)物即為人工抗原[16]。因此半抗原的設(shè)計(jì)、改造和人工抗原的制備是制備抗球蟲(chóng)藥抗體,建立相應(yīng)的免疫分析方法的重要環(huán)節(jié)[17]。

1.1 半抗原的設(shè)計(jì)與改造

在合成抗球蟲(chóng)藥人工抗原的過(guò)程中,半抗原自身的分子結(jié)構(gòu)十分重要,應(yīng)具有一定的復(fù)雜性,否則難以產(chǎn)生抗體或產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低[18]。少數(shù)小分子結(jié)構(gòu)基本滿(mǎn)足抗體制備需要,且具有活性基團(tuán),如氨基、羧基、羥基等,可直接作為半抗原與載體偶聯(lián)[19]。一些抗球蟲(chóng)藥如鹽霉素、莫能菌素等,它們的分子結(jié)構(gòu)中均含活性基團(tuán)羧基,藥物分子便可直接作為半抗原與載體偶聯(lián),用于檢測(cè)相應(yīng)的抗球蟲(chóng)藥殘留。

大多數(shù)抗球蟲(chóng)藥的分子結(jié)構(gòu)中沒(méi)有能夠與載體直接共價(jià)結(jié)合的活性基團(tuán),或是與載體偶聯(lián)后半抗原的特征結(jié)構(gòu)被載體干擾屏蔽,或是活性基團(tuán)即為具有維持半抗原免疫功能的特征基團(tuán),一旦被破壞會(huì)導(dǎo)致藥物失效[20-21]。這些情況下必須對(duì)藥物分子進(jìn)行設(shè)計(jì)改造為新的半抗原。半抗原改造時(shí)需在保持原有分子結(jié)構(gòu)的前提上,使特征基團(tuán)暴露在人工抗原的表面,以便被動(dòng)物的免疫細(xì)胞所識(shí)別,刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫學(xué)特性良好的抗體。最常使用的改造半抗原的方法是在藥物分子上引入連接臂。楊小康等[22]用氨基丁酸與拉沙洛西反應(yīng)制備半抗原,氨基丁酸作為連接臂可使拉沙洛西的活性基團(tuán)羧基暴露于分子表面,便于與載體偶聯(lián)(表2)。在改造常山酮的半抗原時(shí),BAI等[25]發(fā)現(xiàn)分子含有仲胺基、羥基2種活性基團(tuán),由于羥基是常山酮具有抗球蟲(chóng)活性的特征結(jié)構(gòu),在改造常山酮結(jié)構(gòu)的同時(shí)應(yīng)保護(hù)羥基不受破壞,因此,加入三甲基碘硅烷保護(hù)羥基,同時(shí)采用琥珀酸酐與常山酮反應(yīng),構(gòu)建末端含有羧基的間隔臂,制備常山酮半抗原。這樣設(shè)計(jì)出的半抗原具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用。

表2 常見(jiàn)半抗原改造方法Table 2 Common haptens modification methods

針對(duì)沒(méi)有活性基團(tuán)的抗球蟲(chóng)藥,可以通過(guò)引入活性基團(tuán)的方式改造半抗原。CHAO等[23]使氯羥吡啶在堿性條件下與溴乙酸乙酯反應(yīng),得到了含酯鍵的氯羥吡啶衍生物,酯鍵水解后形成羧基,調(diào)pH形成酸性環(huán)境,得到含有羧基的氯羥吡啶半抗原(表2)。SHEN等[26]通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)地克珠利半抗原,在酸性條件下以地克珠利、羧甲基羥胺和吡咯烷為原料合成了含有羧基的地克珠利半抗原。WANG等[27]通過(guò)引入羧基的方式制備托曲珠利半抗原。先將托曲珠利(toltrazuril,TOL)和6-溴己酸芐酯反應(yīng)24 h,再將所得物質(zhì)干燥減壓濃縮,得到一種中間產(chǎn)物TOL-1,將TOL-1和鈀碳(鈀的含量為10%)在氫氣環(huán)境中混合反應(yīng),經(jīng)過(guò)純化得到和托曲珠利結(jié)構(gòu)相似且含有羧基的半抗原。

改造靶標(biāo)分子的代謝物、結(jié)構(gòu)類(lèi)似物也是一種常見(jiàn)的制備半抗原的方法。SHEN[24]等利用尼卡巴嗪的代謝物4,4′-二硝基羰酰替苯胺[1,3-bis(4-nitrophenyl)urea,4,6-dimethyl-1H-pyrimidin-2-one, DNC]設(shè)計(jì)半抗原,將DNC與5-氨基-2-硝基苯甲酸反應(yīng),在特定反應(yīng)條件下制得含有羧基的尼卡巴嗪的半抗原(表2)。LIU等[28]發(fā)現(xiàn)二硝托胺雖含有可直接與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)(酰胺基團(tuán)),但實(shí)驗(yàn)中以二硝托胺為半抗原時(shí)直接制備的抗體靈敏度不高,不能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。因此選擇二硝托胺的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物3,5-二硝基-2-甲基苯甲酸作為半抗原,該物質(zhì)含有羧基,可直接與蛋白偶聯(lián)。

1.2 完全抗原的合成

在制備人工完全抗原時(shí),蛋白質(zhì)、多聚肽等大分子化合物都可以作為與小分子偶聯(lián)的載體,其中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,免疫原性好,故一般采用蛋白質(zhì)作為載體。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可供連接的基團(tuán)主要為氨基、羧基等。蛋白質(zhì)類(lèi)載體中最為常用的是牛血清蛋白(bovine albumin,BSA)、雞卵清蛋白和鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)。

偶聯(lián)反應(yīng)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)完成,可以根據(jù)半抗原修飾物中的活性基團(tuán)的不同而選用不同的偶聯(lián)方法。對(duì)于含有羧基的半抗原,可用碳二亞胺法、活性酯法、混合酸酐法等方法將其與載體蛋白偶聯(lián);含有氨基的半抗原,可用戊二醛法或重氮化法將其與載體蛋白偶聯(lián);含羥基的半抗原,則可通過(guò)琥珀酸酐法、高碘酸鈉反應(yīng)法與載體蛋白偶聯(lián)。胡梅等[29]采用活潑酯法將含有羧基的莫能霉素、馬度米星銨分別與載體蛋白偶聯(lián),成功合成完全抗原。TIAN等[30]選擇通過(guò)活潑酯法將鹽霉素的羧基與BSA的氨基共價(jià)結(jié)合,制備完全抗原。BURKIN等[31]采用活潑酯法分別將含有羧基的鹽霉素、甲基鹽霉素與BSA成功偶聯(lián),制備出2種完全抗原,用于抗體制備。ZHANG等[32]將4-溴丁酸乙酯與地克珠利雜環(huán)上的仲銨反應(yīng),再加入氫氧化鈉使酯鍵水解,調(diào)節(jié)pH值,使酯鍵水解為羧基,形成新的半抗原。再通過(guò)活潑酯法半抗原連接到KLH合成完全抗原。LI等[33]用2種方式制備了乙氧酰胺苯甲酯的完全抗原。采取重氮化法使乙氧酰胺苯甲酯的氨基在酸性條件下與亞硝酸鈉反應(yīng),經(jīng)重氮化后,與BSA反應(yīng)生成完全抗原。采用戊二醛法使半抗原和BSA偶聯(lián),引入間隔臂并使二者連接在一起,合成完全抗原。人工抗原制備后,經(jīng)過(guò)鑒定,即可作為免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲取免疫學(xué)特性良好的抗體。

2 抗球蟲(chóng)藥殘留免疫分析方法

2.1 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)將酶的高效催化作用和抗原-抗體特異性識(shí)別相結(jié)合,用特定的酶標(biāo)記抗原或抗體,根據(jù)酶催化底物的顯色程度,對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量測(cè)定[34]?？骨蛳x(chóng)藥的ELISA方法已經(jīng)較為成熟,目前所報(bào)道的方法主要為直接競(jìng)爭(zhēng)法(direct competitive ELISA,dc-ELISA)和間接競(jìng)爭(zhēng)法(indirect competitive ELISA,ic-ELISA)?？骨蛳x(chóng)藥抗體多為單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)和多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb)也有所報(bào)道。

CHEN等[35]在單鏈抗體片段(single chain fragment variable, scFv)的基礎(chǔ)上首次構(gòu)建了抗拉沙洛西和鹽霉素的完整雙特異性單鏈抗體(bispecific single-chain diabody, scDb)。利用scDb建立的ic-ELISA法,可以同時(shí)檢測(cè)雞肉中的拉沙洛西和鹽霉素,IC50分別為3.5 ng/mL和4.1 ng/mL,該方法的靈敏度和特異性均優(yōu)于scFv親本抗體。HUANG等[36]制備了一種特性免疫磁珠,在其表面固定單鏈抗體,建立了一種簡(jiǎn)單、高效的免疫磁珠ic-ELISA法測(cè)定馬度米星銨殘留,檢出限為6.31 μg/kg。LIN等[37]首次制備出氯苯胍的單克隆抗體,以此開(kāi)發(fā)了基于單克隆抗體的ic-ELISA快速篩選樣品中氯苯胍的方法。該方法的IC50為0.927 ng/mL。檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS分析一致。SHEN等[24]基于針對(duì)尼卡巴嗪代謝產(chǎn)物DNC的特異性抗體,建立了一種ic-ELISA方法,可檢測(cè)尼卡巴嗪殘留,IC50為0.825 ng/mL,相比WU等[38]建立的檢測(cè)DNC的ic-ELISA方法(IC50為3.46 ng/mL),IC50有所降低,靈敏度更強(qiáng)。值得一提的是,BAI等[25]建立一種非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法用于雞肉中常山酮?dú)埩魴z測(cè),發(fā)現(xiàn)在使用抗體相同的情況下,非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析比競(jìng)爭(zhēng)形式靈敏度提高了3.5倍,檢出限為0.13 ng/mL,分析范圍提高5倍,該研究可為傳統(tǒng)的小分子競(jìng)爭(zhēng)分析提供新思路。

2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是在放射免疫分析方法和酶聯(lián)免疫分析方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種超高靈敏度的非放射性標(biāo)記的免疫分析方法[39]。目前常用的熒光標(biāo)記物有魯米諾、異魯米諾及其衍生物及吖啶酯類(lèi)。與抗體或抗原結(jié)合后,這些標(biāo)志物性質(zhì)穩(wěn)定,并保持較高的反應(yīng)能力和量子產(chǎn)率,對(duì)被標(biāo)記抗體或抗原的理化特性幾乎沒(méi)有影響[40]。近年來(lái)此方法已應(yīng)用于多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域,在抗球蟲(chóng)藥殘留檢測(cè)中也有所進(jìn)展。LI等[41]建立了一種基于生物素-鏈霉親和素體系的檢測(cè)雞肉中地克珠利的化學(xué)發(fā)光免疫分析法,通過(guò)制備生物素化的抗地克珠利抗體,結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素的專(zhuān)一性、多位點(diǎn)結(jié)合和信號(hào)放大作用,以及催化魯米諾-過(guò)氧化氫體系化學(xué)發(fā)光,最終實(shí)現(xiàn)特異性化學(xué)發(fā)光信號(hào)的讀出。用該方法檢測(cè)雞肉樣品中的地克珠利,靈敏度是ELISA法的4倍,IC50為0.48 μg/kg,檢出限為0.02 μg/kg,與HPLC-MS/MS相關(guān)性良好。ZHAO等[42]也采用了魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系,利用廣譜的磺胺單克隆抗體建立了一種快速競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光法,用于檢測(cè)雞肉中32種磺胺類(lèi)藥物。此方法的IC50為0.038～11.2 ng/g,檢測(cè)限為0.03～26 ng/g,可作為肉類(lèi)中磺胺類(lèi)藥物殘留的常規(guī)篩查工具。

2.3 免疫層析試紙法

免疫層析試紙法(immunochromatography assay,ICA)的原理是采用條狀纖維膜作為載體,利用吸水墊的毛細(xì)管虹吸作用,使待測(cè)樣抗原或抗體與層析膜上相應(yīng)的受體(抗體或抗原)結(jié)合,所形成的免疫復(fù)合物被截留在檢測(cè)帶,通過(guò)標(biāo)記物顯色,快速得到可視化結(jié)果[43]。常見(jiàn)的標(biāo)記物有磁性納米顆粒、彩色納米顆粒和熒光納米顆粒等,其中膠體金具有制備簡(jiǎn)易、性質(zhì)穩(wěn)定、顯色明顯的特點(diǎn),在抗球蟲(chóng)藥檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛。CHAO等[23]基于氯羥哌啶單克隆抗體,建立了膠體金免疫層析法,用于生雞樣品中氯羥哌啶的快速篩查。該方法檢出限為0.14 μg/kg,可以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。LIU等[28]基于制備的單抗,開(kāi)發(fā)了檢測(cè)雞肉中二硝托胺殘留的免疫層析檢測(cè)方法,檢出限為2.5 μg/kg。XU等[44]制備針對(duì)尼卡巴嗪的高靈敏度單克隆抗體與膠體金的復(fù)合物,組裝成間接競(jìng)爭(zhēng)型免疫層析試紙條,用于雞肉樣品中尼卡巴嗪的快速檢測(cè),檢出限為10 μg/kg(圖1)。與同一單克隆抗體建立的ic-ELISA法測(cè)定結(jié)果非常接近。LIN等[37]基于制備的氯苯胍單克隆抗體開(kāi)發(fā)了一種膠體金免疫層析試紙,該試紙能快速檢測(cè)蝦、雞胸肉和雞肝樣品中的氯苯胍殘留,檢出限分別為10、5、10 ng/g。經(jīng)驗(yàn)證,此免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS的結(jié)果一致,僅需10 min便得出定性結(jié)果,體現(xiàn)了免疫層析試紙法快速簡(jiǎn)便的分析優(yōu)勢(shì)。此外,FITZGERALD等[45]利用被動(dòng)吸附法使抗體與綠色羧化微球形成絡(luò)合物,并組裝免疫層析試紙,建立了一種基于圖像像素分析的可同時(shí)檢測(cè)多組分殘留的免疫層析方法,通過(guò)測(cè)量像素強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)了由一次定性到定量化的過(guò)程。該方法檢測(cè)常山酮的檢測(cè)限為10 ng/mL,對(duì)托曲珠利和地克珠利的檢測(cè)限為100 ng/mL。

a-試紙的組成;b-檢測(cè)結(jié)果示意圖圖1 尼卡巴嗪免疫層析試紙?jiān)韴D

2.4 熒光偏振免疫分析法

熒光偏振免疫分析法(fluoresce polarization immunoassay,FPIA)以競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析為基礎(chǔ),反應(yīng)體系內(nèi)除待測(cè)抗原外,同時(shí)加入一定量熒光素-抗原偶聯(lián)物(示蹤物,Tracer),使兩者與有限量的特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。熒光素-抗原偶聯(lián)物在結(jié)合抗體后熒光偏振值的變化能反映待測(cè)物濃度,熒光偏振值大小與待測(cè)抗原濃度呈反比關(guān)系[46]。小分子檢測(cè)中常用的傳統(tǒng)熒光素有異硫氰酸熒光素異構(gòu)體、羧基熒光素、氨基熒光素、鑭系元素等、新型熒光素有量子點(diǎn)、熒光鏈霉親和素偶聯(lián)物等。在FPIA過(guò)程中,多采用化學(xué)反應(yīng)合成Tracer,制備性能良好的Tracer是FPIA方法的關(guān)鍵[47]。傳統(tǒng)熒光素具有性質(zhì)穩(wěn)定、熒光壽命長(zhǎng)、成本低等優(yōu)勢(shì),在抗球蟲(chóng)藥的檢測(cè)中應(yīng)用較廣。CHEN等[48]合成磺胺甲氧基嘧啶-異硫氰酸酯為T(mén)racer,依靠廣特異性的單鏈抗體,建立了可以用于檢測(cè)牛奶樣品中13種磺胺類(lèi)藥物的熒光偏振免疫分析方法,該方法結(jié)合了熒光偏振免疫分析的優(yōu)點(diǎn)和單鏈抗體的廣譜敏感性,適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。ZHANG等[49]合成了25種長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光素標(biāo)記的DNC半抗原作為T(mén)racer,并對(duì)其進(jìn)行了表征,建立了一種基于單克隆抗體的快速檢測(cè)雞體內(nèi)DNC的熒光偏振免疫分析方法。該方法的檢出限為24.21 μg/kg,重復(fù)性較好,可用于雞肉中尼卡巴嗪的快速檢測(cè)。傳統(tǒng)熒光素價(jià)格低廉,使用廣泛,但存在受背景熒光干擾較大和靈敏度較低等缺陷。新型熒光素如量子點(diǎn)、熒光鏈霉親和素偶聯(lián)物等的光穩(wěn)定性和亮度更強(qiáng),且發(fā)射光譜窄,可顯著降低雜信號(hào),提高靈敏度,已廣泛應(yīng)用到獸藥殘留的檢測(cè)當(dāng)中,是未來(lái)抗球蟲(chóng)藥熒光偏振免疫分析研究的趨勢(shì)。

2.5 電化學(xué)免疫傳感器法

電化學(xué)免疫傳感器(electrochemical immunosensor,ECIA)的原理是將電化學(xué)和免疫分析相結(jié)合,通過(guò)檢測(cè)探針與抗原結(jié)合前后電信號(hào)的相對(duì)變化來(lái)定量靶標(biāo)的量(圖2)[50]。在電化學(xué)免疫分析中,碳納米顆粒、納米金剛石-石墨、氧化石墨烯等碳納米材料經(jīng)常被用來(lái)修飾玻碳電極的表面,增強(qiáng)電極的導(dǎo)電能力[51-52]。電化學(xué)免疫傳感器可在復(fù)雜基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)抗球蟲(chóng)藥殘留的快速檢測(cè)。HU等[53]合成了AuNPs/Zn/Ni-ZIF-8-800@graphene復(fù)合材料修飾玻碳電極,構(gòu)建了間接競(jìng)爭(zhēng)型電化學(xué)免疫傳感器,用于檢測(cè)牛奶中莫能菌素的殘留量。該傳感器具有優(yōu)異的電子傳導(dǎo)能力,極大地提高了傳感器的檢測(cè)靈敏度,檢出限為0.11 ng/mL?；谕辉?該團(tuán)隊(duì)[54]還合成了hemin@Fe-MIL-88 NH2/AuPt作為信號(hào)探針,制備了電化學(xué)免疫傳感器,通過(guò)多重信號(hào)放大作用實(shí)現(xiàn)對(duì)馬度米星銨的定量檢測(cè),檢出限為0.045 ng/mL。WANG等[55]合成了一種AuNPs/Ag-GO-NF納米復(fù)合材料作為有效底物固定抗體和放大電化學(xué)信號(hào),Ag-GO-NF結(jié)構(gòu)可以為金納米粒子提供更多暴露的活性中心。所研制的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)磺胺二甲氧嘧啶的檢出限為4 pg/mL。該免疫傳感器制備簡(jiǎn)單,兼具高靈敏性和穩(wěn)定性。該團(tuán)隊(duì)[56]還開(kāi)發(fā)了一種以銀納米粒子為氧化還原探針的電化學(xué)免疫傳感器,用于磺胺二甲嘧啶的特異性檢測(cè)。葡萄球菌蛋白A具有靶向功能,滴到電極上可以吸收磺胺二甲嘧啶單克隆抗體,可提高免疫反應(yīng)效率。在最佳條件下,此傳感器的檢出限為3 pg/mL。

3 總結(jié)與展望

抗球蟲(chóng)藥作為獸藥或者動(dòng)物飼料中的添加劑,在禽畜養(yǎng)殖中有著廣泛的應(yīng)用。隨著社會(huì)的不斷發(fā)展,世界各國(guó)對(duì)抗球蟲(chóng)藥允許的最大殘留限量正逐步下調(diào)。目前動(dòng)物性食品中抗球蟲(chóng)藥殘留超標(biāo)的情況仍有發(fā)生,人們對(duì)抗球蟲(chóng)藥的檢測(cè)要求將越來(lái)越高。免疫分析方法以其靈敏、快速、低成本等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在眾多檢測(cè)方法中脫穎而出,在抗球蟲(chóng)藥檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。本文綜述了免疫分析方法在抗球蟲(chóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用(表3)。酶聯(lián)免疫分析方法是現(xiàn)階段抗球蟲(chóng)藥免疫分析方法中最常見(jiàn)的一類(lèi),具有操作簡(jiǎn)單、靈敏快速、應(yīng)用廣泛的優(yōu)勢(shì),但有大量手動(dòng)加樣步驟,易出現(xiàn)人為誤差?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法無(wú)輻射、標(biāo)記物有效期長(zhǎng)、自動(dòng)化程度高,但抗原或抗體被標(biāo)記過(guò)發(fā)光物質(zhì)后會(huì)改變免疫反應(yīng)性能,且發(fā)光劑標(biāo)記率重現(xiàn)性較差。免疫層析試紙法體積小而便攜、結(jié)果判定簡(jiǎn)單直觀(guān),可實(shí)現(xiàn)大批量快速篩查,但靈敏度和精確度普遍偏低,多用于定性及半定量檢測(cè)。熒光偏振免疫分析法無(wú)需洗滌,適用于快速篩選,不受樣品顏色以及儀器條件影響,但該方法靈敏度低于ELISA法,需要熒光偏振檢測(cè)設(shè)備,儀器成本較高。電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)靈敏,但穩(wěn)定性差,用特殊材料修飾的電極只能滿(mǎn)足單個(gè)樣品的測(cè)試。

抗球蟲(chóng)藥殘留免疫分析方法應(yīng)在以下幾方面不斷完善。一是個(gè)別抗球蟲(chóng)藥的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,無(wú)法合成完全抗原,缺乏特異性抗體,從而無(wú)法建立免疫檢測(cè)方法。如癸氧喹酯、氨丙啉等還沒(méi)有半抗原合成及免疫分析方法的報(bào)道。針對(duì)未有免疫檢測(cè)方法或抗體的抗球蟲(chóng)藥,應(yīng)探究其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、基團(tuán)活性等,設(shè)計(jì)合成人工抗原,擴(kuò)大抗球蟲(chóng)藥抗體庫(kù),提高抗體的靈敏度和特異性。二是檢測(cè)方法庫(kù)還有待完善和均衡發(fā)展。仍有部分抗球蟲(chóng)藥的免疫檢測(cè)方法研究較少、檢測(cè)模式單一、靈敏度較低,如拉沙洛西、乙氧酰胺苯甲酯、氯苯胍等。針對(duì)該點(diǎn),今后的研究方向可以結(jié)合質(zhì)譜分析、量子點(diǎn)、生物傳感器、免疫芯片等新技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)更為靈敏、便捷的高通量免疫檢測(cè)方法,提高檢測(cè)靈敏度,縮短檢測(cè)時(shí)間。三是單克隆抗體的制備周期較長(zhǎng),批間差別較大,缺乏大批量生產(chǎn)的條件。可以探索開(kāi)發(fā)性能更穩(wěn)定、能大批量制備、批次間差異小的新型優(yōu)質(zhì)抗體,如單鏈抗體、基因工程抗體,或核酸適配體、受體蛋白等抗體代替物。四是人工抗原的制備均是一種載體蛋白偶聯(lián)一種半抗原,其制備出的抗體特異性高,但也存在一定局限性,所建立的免疫分析方法只能檢測(cè)某一種或結(jié)構(gòu)極其相似的抗球蟲(chóng)藥,無(wú)法像儀器方法一樣能夠同時(shí)對(duì)多種抗球蟲(chóng)藥殘留進(jìn)行多殘留檢測(cè)。因此,開(kāi)發(fā)能夠同時(shí)快速檢測(cè)多種抗球蟲(chóng)藥殘留的免疫分析方法也將是免疫分析方法的發(fā)展趨勢(shì)。可將免疫分析與人工智能、云計(jì)算、大數(shù)據(jù)等技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性食品生產(chǎn)加工全過(guò)程中抗球蟲(chóng)藥殘留的智能化和動(dòng)態(tài)化監(jiān)測(cè)。