張佳雯，王玉芳，張忠民，盧 寬，魯儀增，程仕偉*

1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院煙臺市生物發(fā)酵與分離工程實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264025；2. 煙臺職業(yè)學(xué)院，山東 煙臺 264670；3. 山東省林草種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250102

木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的可再生資源，占全球生物總量的80%以上，是自然界分布最廣、含量最多的一種多糖，纖維素酶可以將纖維素轉(zhuǎn)化成可利用性糖類，是開發(fā)利用木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵[1-2]。纖維素酶是一類可以水解β-1，4 葡萄糖苷鍵，使纖維素分解為纖維二糖和葡萄糖的酶系總稱，包括內(nèi)切葡萄糖苷酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4，又稱羧甲基纖維素酶）、外切葡萄糖苷酶（cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91，又稱微晶纖維素酶）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC 3.2.1.21）[3-4]。羧甲基纖維素酶（CMCase）是內(nèi)切型纖維素酶，作用于纖維素的β-1，4 糖苷鍵上，其活力會直接影響纖維素的水解效率[5]。

纖維素酶除了可用于木質(zhì)纖維素降解，在釀造、飼料、中藥提取、紡織、造紙、洗滌等行業(yè)領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用[6-8]。作為目前糖苷酶類中尚存在大量亟待解決問題的一類酶，如何提高酶的活力并研發(fā)適應(yīng)催化條件的纖維素酶成為了當(dāng)前的主要研究趨勢[9]。隨著億萬年的自然演化，眾多產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌、真菌和放線菌等被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[10-11]。作為芽孢桿菌類細(xì)菌來源的纖維素酶擁有耐熱、耐堿等優(yōu)良催化特性，近年來其在飼料添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用備受重視[12-13]。芽孢桿菌所產(chǎn)的纖維素酶以羧甲基纖維素酶為主[14]。本文通過對分離自近海土壤中能降解羧甲基纖維素的芽孢桿菌B55 培養(yǎng)優(yōu)化過程的研究，挖掘其產(chǎn)CMCase 的潛力，以期為后續(xù)的相關(guān)應(yīng)用性研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

分離篩選自山東煙臺近海土壤的芽孢桿菌（Bacillus sp.）B55，現(xiàn)保存于魯東大學(xué)應(yīng)用微生物研究所。羧甲基纖維素（CMC）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余所用試劑均為分析純或生物純。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

試管斜面保藏的Bacillus sp. B55 轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)至菌體渾濁?；罨囵B(yǎng)基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L氯化鈉，pH 6.5，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 培養(yǎng)優(yōu)化

將一定量的活化菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、200 r/min 的條件下，確定碳源、氮源和金屬鹽、CMC 添加量、接種量對菌種產(chǎn)CMCase 的影響，發(fā)酵培養(yǎng)24 h 后測定CMCase 的活力。根據(jù)影響因素的優(yōu)化結(jié)果，正交試驗(yàn)確定菌株B55 產(chǎn)CMCase 的最佳變量值，通過最佳培養(yǎng)工藝確定最佳產(chǎn)酶條件。

1.2.3 酶活和菌濃測定[15]

培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 去菌體后獲得上清酶液，取1 mL 適當(dāng)稀釋度的酶液，在其中添加1 mL1% CMC 底物溶液，45 ℃水浴保溫反應(yīng)20 min 后，加入3 mLDNS 試劑，沸水浴5 min 顯色并定容至25 mL 后，取4 mL 反應(yīng)樣液以8 000 r/min 離心5 min。取離心后的上清液，在540 nm 處測定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。以單位體積（mL）、單位時(shí)間（min）水解羧甲基纖維素所產(chǎn)生葡萄糖的μg 數(shù)為酶活力單位。

發(fā)酵培養(yǎng)液加純凈水稀釋至適當(dāng)濃度，并以純水作為空白對照，在600 nm 處測定吸光度，以O(shè)D600指示菌體濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對菌株B55 產(chǎn)CMCase 影響

采用發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L 碳源，2 g/L CMC，5 g/L酵母浸粉，10 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氫二鉀，3 g/L 磷酸二氫鈉，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，碳源對菌株產(chǎn)CMCase 活性影響見圖1。結(jié)果顯示，以甘油為碳源時(shí)獲得最大CMCase活性146.45 U/mL，其次為葡萄糖（130.27 U/mL）。

圖1 碳源對菌株產(chǎn)CMCase 的影響

2.2 氮源對菌株B55 產(chǎn)CMCase 影響

采用發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L 甘油，15 g/L 氮源，2 g/L CMC，3 g/L 磷酸氫二鉀，3 g/L 磷酸二氫鈉，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，氮源對菌株產(chǎn)CMCase 活性的影響見圖2。由圖中結(jié)果可知，最佳產(chǎn)酶氮源為大豆蛋白胨，產(chǎn)酶量為153.24 U/mL；酵母粉、尿素、磷酸氫二銨為氮源時(shí)，CMCase 產(chǎn)量也相對較高。

圖2 氮源對菌株產(chǎn)CMCase 的影響

2.3 金屬鹽對菌株B55 產(chǎn)CMCase 影響

選取發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，2 g/L CMC，3 g/L 磷酸氫二鉀，3 g/L 磷酸二氫鈉，3 g/L 金屬鹽，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，金屬鹽對菌株產(chǎn)CMCase 活性的影響見圖3。由圖3 可以看出，額外再添加金屬鹽會對菌株產(chǎn)CMCase 的活力產(chǎn)生負(fù)影響；與對照組相比，添加金屬鹽組的CMCase 活力均得到了不同程度的降低。

圖3 金屬鹽對菌株產(chǎn)CMCase 的影響

2.4 CMC 添加量對菌株B55 產(chǎn)CMCase 影響

纖維素酶屬于水解酶，多為誘導(dǎo)酶，合適的誘導(dǎo)物添加量可以顯著提升纖維素酶的產(chǎn)量[16]。選用發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氫二鉀，3 g/L 磷酸二氫鈉，不同濃度的CMC，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)物CMC 對菌株產(chǎn)CMCase 活性的影響見圖4。由圖4 可以看出，隨著底物CMC 添加量的增加，酶活性逐漸增加，當(dāng)誘導(dǎo)物添加至一定量時(shí)，即質(zhì)量濃度為2～4 g/L 時(shí)，酶產(chǎn)量相對穩(wěn)定，其中添加量為4 g/L CMC 時(shí)可獲得最大CMCase 活力，為166.69 U/mL。

圖4 CMC 量對菌株產(chǎn)CMCase 的影響

2.5 接種量對菌株B55 產(chǎn)CMCase 影響

選取如下培養(yǎng)基組分：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氫二鉀，3 g/L 磷酸二氫鈉，4 g/L CMC，pH 7.0。裝液量100 mL/500 mL 瓶，每瓶接種不同量的活化菌種，在30 ℃、200 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，確定接種量對菌株B55 產(chǎn)CMCase 的影響。由圖5 可以看出，菌株B55 產(chǎn)CMCase 的最佳接種量是4%（V/V），酶活力為167.24 U/mL。

圖5 接種量對菌株產(chǎn)CMcase 的影響

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)對菌種進(jìn)行單因素優(yōu)化所得出的結(jié)論，選取甘油、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、CMC、接種量、溫度等7 項(xiàng)變量進(jìn)行7 因素2 水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平 單位：g/L

根據(jù)所列的7 因素和2 水平的條件，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)極差R 值分析可知，在正交試驗(yàn)的7 個(gè)因素中，甘油對菌株CMCase 產(chǎn)量的影響最大，其次是酵母粉、接種量、培養(yǎng)溫度、大豆蛋白胨和葡萄糖。通過對k1、k2值的比較分析，確定7 個(gè)因素的最佳變量值分別為30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L CMC、4%（V/V）接種量和培養(yǎng)溫度32 ℃。

2.7 發(fā)酵培養(yǎng)曲線

結(jié)合培養(yǎng)因素對菌株產(chǎn)酶的影響和正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，確定Bacillus sp. B55 發(fā)酵生產(chǎn)CMCase 的最佳培養(yǎng)組分為30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L CMC、3 g/L 磷酸氫二鉀，3 g/L 磷酸二氫鈉，pH 7.0；最佳發(fā)酵條件為4%（V/V）接種量、培養(yǎng)溫度32 ℃、裝液量100 mL/500 mL。采用優(yōu)化過的培養(yǎng)工藝，Bacillus sp.B55 發(fā)酵生產(chǎn)羧甲基纖維素酶的培養(yǎng)曲線見圖6，在經(jīng)短暫停滯期后快速進(jìn)入對數(shù)生長期，在36 h 時(shí)菌體濃度達(dá)到最大，為45.32（OD600），隨后進(jìn)入靜止期，菌體濃度緩慢下降。

圖6 Bacillus sp. B55 發(fā)酵過程曲線

對CMCase 而言，在菌體快速增殖階段，酶表達(dá)量會隨菌體濃度增加而快速上升，當(dāng)菌體生長進(jìn)入靜止期后，酶活性仍呈增長趨勢，在發(fā)酵48 h 時(shí)獲得最大酶活性401.34 U/mL。因此，Bacillus sp. B55生產(chǎn)CMCase 的過程為非生長偶聯(lián)型（滯后合成型），會受到分解代謝物的阻遏。發(fā)酵時(shí)間超過66 h后，菌體開始自溶，酶活性快速降低。

3 結(jié)語

芽孢桿菌屬微生物具有較強(qiáng)的耐熱性，所產(chǎn)纖維素酶多為堿性纖維素酶，因此在飼料、洗滌、食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[17]。本研究首先優(yōu)化確定了Bacillus sp. B55 產(chǎn)CMCase 的影響因素，并在此基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)確定各變量因素的最佳變量值。研究結(jié)果顯示，使用優(yōu)化的培養(yǎng)工藝發(fā)酵生產(chǎn)CMCase，發(fā)酵36 h 可獲得最大菌體濃度45.32（OD600），48 h CMCase 活力為401.34 U/mL。該研究成果可為后續(xù)進(jìn)行規(guī)?；苽渑c催化特性研究提供良好的數(shù)據(jù)支撐。此外，本研究所用的產(chǎn)酶菌株為耐熱芽孢桿菌，屬于潛在益生菌，可將CMCase 和Bacillus sp. B55 菌體一并作為飼用微生態(tài)制劑用于飼料行業(yè)。