耿肖涵

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

以第二代、第三代為主要研究的基礎(chǔ)：混合細(xì)胞測(cè)序（Bulk cell Sequencing）技術(shù)，是一項(xiàng)檢測(cè)細(xì)胞群體信息的整體技術(shù)，無法準(zhǔn)確定位到每一細(xì)胞的具體變化[1]。于是，單細(xì)胞技術(shù)隨之誕生。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是從細(xì)胞水平上對(duì)生物體的細(xì)胞遺傳物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序。

2 單細(xì)胞分離與獲取

目前，獲取單細(xì)胞的技術(shù)種類較多，其中有限稀釋技術(shù)（Limited dilution technology）和顯微分離操作技術(shù)（Micromanipulator technology），在組織學(xué)與個(gè)體發(fā)育的研究中發(fā)揮重要的作用。但隨著計(jì)算機(jī)的引入，上述兩種技術(shù)的使用率已經(jīng)下降。激光顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）是在顯微鏡下發(fā)射高激光，利用細(xì)胞群與轉(zhuǎn)運(yùn)膜緊密結(jié)合而特異性地捕獲細(xì)胞，從而獲得一定范圍內(nèi)同種來源的細(xì)胞。熒光激活細(xì)胞分選（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）是在流式細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上，使用光學(xué)系統(tǒng)對(duì)具有可識(shí)別抗體的細(xì)胞進(jìn)行定位，將異質(zhì)性的細(xì)胞收集到不同的裝置中，此技術(shù)準(zhǔn)確度高、通量高。微流控技術(shù)（Microfluidics）是在細(xì)胞級(jí)尺度下對(duì)細(xì)胞流體進(jìn)行操控，在小體積封閉系統(tǒng)內(nèi)將細(xì)胞分離，是生物學(xué)、計(jì)算機(jī)、物理學(xué)等多學(xué)科交叉形成的技術(shù)，因其操作簡單、成本與技術(shù)難度低、樣品消耗小、獲得效率高和通量高等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[2]。

3 單細(xì)胞測(cè)序類型

由于細(xì)胞類群與研究目的的不同，研究者需要從不同角度與層面揭示細(xì)胞類群的差異，這就要求使用不同的手段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。其中，單細(xì)胞測(cè)序包括單細(xì)胞全基因組測(cè)序（Whole -genome amplification，WGA）、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Single cell RNA sequencing, scRNA-seq）、單細(xì)胞表觀組測(cè)序（Single cell epigenome sequencing）和單細(xì)胞多組學(xué)研究（single cell multi-omics sequencing）。這些不同的測(cè)序技術(shù)基本上可以滿足目前對(duì)生物組織和細(xì)胞生命的研究。

3.1 單細(xì)胞全基因組測(cè)序

WGA 技術(shù)常用來證明細(xì)胞類群的不同，分析單個(gè)細(xì)胞的點(diǎn)突變位置與其他基因突變，可以精準(zhǔn)地獲取單細(xì)胞的突變來源及基因突變的頻率，解釋類細(xì)胞在生命體內(nèi)的功能、細(xì)胞類群演化及發(fā)育過程，可以準(zhǔn)確地測(cè)出細(xì)胞的全部遺傳物質(zhì)，但難以有效獲取高保真的細(xì)胞基因擴(kuò)增產(chǎn)物。WGA 技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳信息最為基礎(chǔ)的一個(gè)手段，所延伸的方法類型也相對(duì)較多，包括簡并寡核苷酸引物PCR（Degenerate Oligonucleotide -Primed Polymerase Chain Reaction ，DOP-PCR），原理是在引物的3’末端插入6 bp 的隨機(jī)核酸序列，與細(xì)胞遺傳物質(zhì)結(jié)合[3]；多位點(diǎn)置換擴(kuò)增（Multiple Displacement Amplification ，MDA）使用phi29DNA 聚合酶，在體系中與外源性的六聚體發(fā)生結(jié)合，反應(yīng)可以得到50～100 kb 大小的DNA 片段。除此之外，在MDA 技術(shù)的基礎(chǔ)上與傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)結(jié)合形成MALBACs（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycle），原理是利用堿基的簡并性，設(shè)計(jì)特異性的引物片段與DNA 模板結(jié)合，在DNA 鏈置換酶的環(huán)境下進(jìn)行體外擴(kuò)增，在3’端產(chǎn)生具有特異性標(biāo)記的中間產(chǎn)物，隨后在新一輪的擴(kuò)增中，于5’端產(chǎn)生與3’端互補(bǔ)的末端，在一輪擴(kuò)增結(jié)束后單鏈成環(huán)，最終不斷擴(kuò)增得到產(chǎn)物。

3.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

scRNA-seq 指從組織器官或生物體液中分離出細(xì)胞，進(jìn)行高精度、無偏差、高分辨率的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得信息并建庫，最終對(duì)整個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[4]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在生殖系統(tǒng)、組織器官發(fā)育、動(dòng)物育種，以及神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤生物等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用。

3.2.1 生殖系統(tǒng)發(fā)育研究

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序最早應(yīng)用于對(duì)生殖系統(tǒng)的研究，主要包括生殖腺體與生殖細(xì)胞，同時(shí)也包括受精卵細(xì)胞，但迄今為止仍然有較多的結(jié)論需要被證實(shí)。研究人員對(duì)小鼠的新生雌性胎鼠（P0.5）卵巢中單個(gè)生殖細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 分析，建立卵母細(xì)胞發(fā)育的整體通路。

3.2.2 組織、器官發(fā)育研究

Seow 等人利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了5 種不同類型的肝細(xì)胞的近30 萬個(gè)單細(xì)胞，從而確定COVID-19 在肝臟中的入侵類型，報(bào)道COVID-19在進(jìn)入肝臟組織后，TROP2+肝祖細(xì)胞的一系列癥狀與反應(yīng)。Jia 等人[5]利用單細(xì)胞組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)分離出糖尿病成年小鼠腎臟中腎小球細(xì)胞，并實(shí)時(shí)關(guān)注和記錄動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)測(cè)定多種類型的腎臟細(xì)胞，驗(yàn)證腎小球細(xì)胞的特異性基因，也發(fā)現(xiàn)多個(gè)腎小球的內(nèi)在標(biāo)志基因。scRNA-seq 技術(shù)在腎臟中的大量研究，推動(dòng)了人類疾病模型的建模和損傷系統(tǒng)修復(fù)研究的進(jìn)程，對(duì)現(xiàn)今的研究有著重要的意義[6]。

3.2.3 神經(jīng)系統(tǒng)方面

Lake 等人[7]針對(duì)人腦的特異性結(jié)構(gòu)，對(duì)微流體單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)（snDrop-seq）及單細(xì)胞轉(zhuǎn)座體超敏性位點(diǎn)測(cè)序技術(shù)（scTHS-seq）進(jìn)行技術(shù)革新，并對(duì)人大腦中的視覺皮層細(xì)胞群和額葉皮層細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞分析，鮮明地展示了組成人腦不同位置的細(xì)胞的共同點(diǎn)和差異，其中包括轉(zhuǎn)錄因子與多種轉(zhuǎn)錄元件，同時(shí)將人腦不同的細(xì)胞群與相關(guān)疾病相互映射，為人腦的相關(guān)疾病提供依據(jù)。

3.2.4 動(dòng)物育種方面

種公畜在種群的遺傳性狀與種群優(yōu)勢(shì)中發(fā)揮著較大的作用。因此，需要對(duì)種公畜的生殖能力與精子以及生殖器官的質(zhì)量進(jìn)行特別關(guān)注。在公畜的生殖組織上進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，以對(duì)其發(fā)育過程和生殖細(xì)胞發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行探究，這對(duì)選取高價(jià)值、高產(chǎn)能的畜種具有較為關(guān)鍵的作用。高源等[8]利用scRNA-seq技術(shù)對(duì)性功能發(fā)育完成前、后的牛睪丸細(xì)胞群進(jìn)行測(cè)序，并通過差異分析，把牛睪丸分為12 個(gè)差異類群，其中有9 類體細(xì)胞與3 類生殖細(xì)胞，同時(shí)篩查出牛睪丸的特異性基因，如Ccl21、Esx1 和Gas1 等。

4 展望

單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序是目前展示生物體發(fā)育的關(guān)鍵技術(shù)，從多維度、多層面直接反映細(xì)胞的基本特性。相比傳統(tǒng)的組織學(xué)、腫瘤等領(lǐng)域，目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在畜牧科學(xué)、物種培育與轉(zhuǎn)基因物種的篩查中的應(yīng)用相對(duì)較少，這也是未來發(fā)展不可忽視的一個(gè)部分。

對(duì)于細(xì)胞的生命歷程及異質(zhì)性細(xì)胞在生物發(fā)展的不同階段所承擔(dān)的功能的研究正處于快速發(fā)展時(shí)期。隨著技術(shù)的創(chuàng)新和進(jìn)步，計(jì)算機(jī)與更多學(xué)科相融。要想決定哪種測(cè)序技術(shù)最有利于實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)，應(yīng)更多地分析不同測(cè)序技術(shù)與測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)缺點(diǎn)。獲得單細(xì)胞信息的方法沒有“一刀切”的標(biāo)準(zhǔn)，每種技術(shù)都有優(yōu)點(diǎn)和局限性。目前，用于冷凍或固定標(biāo)本的樣品處理方法，或用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的原位或體內(nèi)分析的技術(shù)模式亟待開發(fā)。