張 咪，劉龍飛，季延濱，牛浩權(quán)，劉孝楊，方展明

天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392

高密度和集約化的養(yǎng)殖活動(dòng)導(dǎo)致了養(yǎng)殖水體中氨氮過度積累[1]。氨氮的大量積累不僅導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化和生態(tài)環(huán)境的破壞，還嚴(yán)重影響水質(zhì)，危及水生動(dòng)物的生命安全。研究人員發(fā)現(xiàn)了一些異養(yǎng)細(xì)菌，它們擁有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的特性，能更快速地處理氨氮，甚至比硝化細(xì)菌更為高效[2]。異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（HN-AD）細(xì)菌是一種同時(shí)能在異養(yǎng)條件下進(jìn)行硝化和在好氧條件下進(jìn)行反硝化的微生物[3]。在HN-AD 過程中，細(xì)菌首先將有機(jī)氮或銨鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，然后在好氧條件下將硝酸鹽還原為氮?dú)?。由于其簡化和高效的特性，利用HN-AD 細(xì)菌的污水處理技術(shù)在設(shè)計(jì)和操作成本上具有明顯優(yōu)勢(shì)[4]。為了解決養(yǎng)殖中氨氮去除的問題，尋找本土的HN-AD 細(xì)菌變得尤為重要。本文旨在從養(yǎng)殖沉積物中找到這種菌群，優(yōu)化其處理效果，為其在調(diào)控和凈化養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

從天津市某對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中采集底泥樣本，放入密封袋中0 ℃運(yùn)輸至天津農(nóng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，-80℃冷凍保存，用于分離菌株。

1.2 反硝化細(xì)菌MF1 的分離、篩選和鑒定

將底泥樣品轉(zhuǎn)移至裝有100 mL 無菌LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖勻以獲得均勻的懸浮液，放置于恒溫水域搖床上，以25 ℃、100 r/min 的條件培養(yǎng)24 h 后，取0.1 mL 菌液涂布于BTB 固體培養(yǎng)基上，稀釋系數(shù)范圍為8～12 次方。將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng)24 h，并根據(jù)菌落的狀態(tài)進(jìn)行觀察[5]。選取目標(biāo)菌落，對(duì)其進(jìn)行純化，連續(xù)進(jìn)行3 次，每次間隔24 h。選取經(jīng)純化的藍(lán)色或帶有藍(lán)色光暈的好氧反硝化細(xì)菌菌落[6]，將最終篩選的菌株放入凍存管中與0.25 mol/L 甘油等量混合，即1∶1（V∶V）比例，后將凍存管放入-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存，供下一步分析[7]。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

單因素實(shí)驗(yàn)以NH4Cl 為氮源，在不同變量（碳源、溫度、C/N 比、轉(zhuǎn)速和pH）下進(jìn)行。在碳源實(shí)驗(yàn)中，丙酮酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、DL-蘋果酸被用作唯一碳源[8]。在C/N 比實(shí)驗(yàn)中，改變碳源濃度，將C/N 比調(diào)整為5、10、15 和20。在溫度實(shí)驗(yàn)中，溫度設(shè)置為20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃。在pH 實(shí)驗(yàn)中，使用0.1 m HCL 或0.1 m NaOH 將初始培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至6、7、8 和9。在轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)速設(shè)置為50、100、150 和200 r/min 來改變DO 濃度。在所有單因素實(shí)驗(yàn)中，除變量外的所有其他因素都控制在最佳條件下（丙酮酸鈉作為碳源，C/N 比10，pH 7.5，溫度27 °C，140 r/min，P/N 比0.26）。樣品離心后取上清液測(cè)定氨氮（NH4+-N）和總氮（TN）。

1.4 分析方法

用紫外分光光度計(jì)（UH5300，HITACHI）在波長600 nm 處測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物的吸光度。NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN、PO43--P 的測(cè)定采用納氏試劑光度法、麝香草酚分光光度法、重氮-偶氮光度法、堿性過硫酸鉀法、鉬銻抗法[9]。不同因素對(duì)目的菌株生長影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（平均值±SD，n=3）表示，并且使用Origin 2022 軟件設(shè)計(jì)圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株MF1 的鑒定

從天津市某對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥中分離出數(shù)株可同時(shí)具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株。MF1菌株，因其具有最先進(jìn)的脫氮能力容量，所以被選擇用于以下分析。菌株MF1 在瓊脂平板上的菌落大小具有以下特點(diǎn)：菌落大小顯著，顏色淡黃色，圓形，邊緣完整，表面光滑，黏稠狀，具有嚴(yán)格的異養(yǎng)特性。采用硅基質(zhì)吸附柱法從菌體樣本中抽提DNA，使用2×Taq Master Mix 對(duì)所提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序（雙向測(cè)序）。擴(kuò)增并測(cè)序長度為1 402 bp 的RNA 基因片段，將其提交至GenBank 核苷酸數(shù)據(jù)庫。BLAST 結(jié)果表明，菌株MF1 與密歇根克雷伯氏菌親緣關(guān)系較近，相似度高達(dá)100%。在此基礎(chǔ)上，利用NJ 法（Neighbor-Joining Algorithm）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步鑒定菌株MF1為Klebsiella michiganensis（圖1）。

圖1 基于菌株MF4 的16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同環(huán)境因素對(duì)菌株MF1 生長及脫氮性能的影響

2.2.1 不同碳源對(duì)菌株MF1 生長及脫氮性能的影響

如圖2，經(jīng)過24 h 不間斷的培養(yǎng)，丙酮酸鈉顯著促進(jìn)菌MF1 的生長，尤其是在第9～12 h 之間，菌株MF1 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，且OD600值開始明顯高于其他碳源。同時(shí)，氨氮為唯一氮源條件下，培養(yǎng)基添加不同碳源對(duì)其總氮降解率及氨氮降解率的影響如圖2 所示，丙酮酸鈉為碳源時(shí)，菌株MF1 對(duì)總氮、氨氮的降解率分別為83.68%與84.98%，均顯著高于其他三組。

圖2 不同碳源對(duì)菌株MF1 生長及氨氮、總氮去除效果的影響

2.2.2 最適碳源篩選結(jié)果

在對(duì)碳源進(jìn)行篩選的過程中，丙酮酸鈉被鑒定為菌MF1 的最適碳源。經(jīng)過生長曲線監(jiān)測(cè)與脫氮性能的定量分析，菌株MF1 在丙酮酸鈉為唯一碳源的條件下展現(xiàn)最為優(yōu)越的生長性能和代謝活性。總氮、氨氮的去除效率也在丙酮酸鈉條件下達(dá)到最優(yōu)。

2.2.3 不同環(huán)境因素對(duì)菌株MF1 脫氮性能的影響

在最適碳源的條件下，溫度對(duì)菌株MF1 脫氮性能的影響如圖3 所示。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，菌株MF1展現(xiàn)最為優(yōu)越的生長性能，同時(shí)氨氮降解率、總氮降解率最高，分別為95.68%及94.55%。從圖3 可以看出C/N 比例為20 時(shí)，菌株MF1 的生長性能最優(yōu)，在C/N 比例為10 時(shí)，氨氮降解率、總氮降解率最高，分別為95.69%及94.4%。轉(zhuǎn)速對(duì)菌株MF1 脫氮性能的影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min 時(shí)，菌株MF1 展現(xiàn)最為優(yōu)越的生長性能，同時(shí)氨氮降解率、總氮降解率最高，分別為95.71%及94.35%。pH 對(duì)菌株MF1 脫氮性能的影響，當(dāng)pH 為7 時(shí)，菌株MF1 展現(xiàn)最為優(yōu)越的生長性能，同時(shí)氨氮降解率、總氮降解率最高，分別為95.73%及94.20%。

圖3 不同環(huán)境因素對(duì)菌株MF1 的生長及氨氮、總氮去除效果的影響

2.2.4 菌株MF1 脫氮性能的影響因素

溫度30 °C 為菌株MF1 的最佳生長溫度，并且在此溫度下脫氮性能達(dá)到最佳，說明MF1 在適中的溫度下活性最高，這可能與其酶活性和細(xì)胞代謝的最佳狀態(tài)有關(guān)。菌株MF1 在中性pH 下展現(xiàn)最佳的生長和脫氮性能。這表明MF1 可能是一個(gè)中性菌，中性環(huán)境有利于其酶的活性和細(xì)胞生長。轉(zhuǎn)速為100 r/min 時(shí)，菌株MF1 的脫氮性能最佳。C/N 比例為20 時(shí)，生長性能最優(yōu)，為了達(dá)到最佳的脫氮性能，需要C/N 比例為10。

3 結(jié)論

從某對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘采集的底泥中篩出一株菌株MF1，經(jīng)16S rDNA 鑒定為Klebsiella michiganensis（密歇根克雷伯氏菌）。各菌株生長至24 h 左右時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，至24 h 氨氮培養(yǎng)基中菌株MF1 脫氮反應(yīng)結(jié)束，丙酮酸鈉對(duì)菌株MF1 生長及脫氮性能的促進(jìn)效果最好。菌株MF1 的脫氮性能與環(huán)境因素密切相關(guān)。菌株MF1 在溫度30 ℃、pH7、轉(zhuǎn)速100 r/min 及C/N 比例為10 的條件下表現(xiàn)最佳的脫氮性能。