馮雪 歐陽汝欣 馮蕾

(衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 衡水 053000)

紅葉石楠(Photinia×fraseri)是一種常綠的小喬木或灌木，屬于石楠科石楠屬，常見品種包括紅羅賓、紅唇等，在春秋兩季會(huì)展現(xiàn)出鮮紅的新葉，色彩艷麗持久，極具生機(jī)。紅葉石楠具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐旱耐貧瘠、抗病蟲害等優(yōu)點(diǎn)，因其美麗的顏色和獨(dú)特的形態(tài)被廣泛種植于園林和城市綠化中，有“紅葉之王”“綠葉之王”之稱。近年來，對(duì)衡水市區(qū)紅葉石楠病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，葉斑病發(fā)展迅速且呈嚴(yán)重態(tài)勢(shì)，其病原菌孢霉主要侵染紅葉石楠老葉，常發(fā)生在春季相對(duì)溫暖的天氣，通常在6月上旬開始出現(xiàn)。發(fā)病初期，葉表面會(huì)出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，呈環(huán)狀褐色暈環(huán)，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)白粉和棕粉斑點(diǎn)等大量沉淀物，葉邊緣出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)，葉斑病后期葉片會(huì)呈褐色斑點(diǎn)病變，直至全葉皺縮枯黃。紅葉石楠葉斑病病原菌可以多次侵染，反復(fù)發(fā)生，嚴(yán)重影響了紅葉石楠的觀賞和應(yīng)用價(jià)值[1]。為此，有必要對(duì)其病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究，預(yù)測(cè)紅葉石楠葉斑病病害的發(fā)生規(guī)律，并有效防治其發(fā)生。

目前，圍繞著紅葉石楠的生態(tài)保護(hù)、園林應(yīng)用、繁殖技術(shù)、基因資源、藥用價(jià)值和文化價(jià)值等方面展開了大量研究，但對(duì)于紅葉石楠病害方面的研究基本空白。因此，本課題以在植物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定得到的紅葉石楠葉斑病病原菌為供試菌株，從溫度、pH值、碳源、氮源等4個(gè)影響因素入手，系統(tǒng)研究該病原菌的生物學(xué)特性，包括菌絲生長和產(chǎn)孢量等，為紅葉石楠葉斑病病害的正確診斷和及時(shí)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)奠定了理論基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

供試菌株：園林植物和微生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離鑒定得到的紅葉石楠葉斑病病原菌；供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、察氏培養(yǎng)基(Czapek)；試驗(yàn)時(shí)間：2022年9月—2023年6月；試驗(yàn)地點(diǎn)：微生物實(shí)驗(yàn)室、園林植物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑

所用儀器：立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、生物顯微鏡；所用試劑：果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、尿素、甘氨酸、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、瓊脂等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同溫度對(duì)紅葉石楠病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

設(shè)置5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃共7個(gè)溫度梯度，使用5mm打孔器在PDA培養(yǎng)基上接種紅葉石楠葉斑病病原菌菌餅。置于7個(gè)恒溫培養(yǎng)箱中，并分別設(shè)置以上7個(gè)溫度梯度恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。以上7個(gè)溫度處理在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，拍照記錄菌絲生長情況，并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)8d后，用10mL無菌水洗滌培養(yǎng)基表面且用毛筆刷下菌絲體，將其倒入90mL無菌水中，置于恒溫振蕩器中振蕩24h后，每皿取5μL菌懸液，共取3次，在顯微鏡下鏡檢記錄孢子數(shù)量，取3次孢子數(shù)平均值[3]。

1.2.2 不同pH值對(duì)葉斑病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

用鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9，接種方法與數(shù)據(jù)處理同1.2.1，每個(gè)處理重復(fù)3次。以上5個(gè)處理在培養(yǎng)5d后，拍照記錄菌絲生長情況，并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，再培養(yǎng)3d后，用10mL無菌水洗滌培養(yǎng)基表面且用毛筆刷下菌絲體，將其倒入90mL無菌水中，置于恒溫振蕩器中振蕩24h后，每皿取5μL菌懸液，共取3次，在顯微鏡下鏡檢記錄孢子數(shù)量，取3次孢子數(shù)平均值[4]。

1.2.3 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以等量的果糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇替換Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，分別配制成含5種不同碳源的培養(yǎng)基，以剔除蔗糖的Czapek培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。接種方法與數(shù)據(jù)處理同1.2.1，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。測(cè)定不同碳源對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢的影響。

1.2.4 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以等量的氯化銨、蛋白胨、甘氨酸、尿素替換Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，分別配制成含5種不同氮源的培養(yǎng)基，以剔除硝酸鈉的Czapek培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。接種方法與數(shù)據(jù)處理同1.2.1，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。測(cè)定不同氮源對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢的影響。

1.2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析對(duì)不同溫度、pH值、碳氮源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異的顯著性檢驗(yàn)，采用Microsoft Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

由表1可知，紅葉石楠葉斑病病原菌在不同溫度條件下菌絲產(chǎn)孢量和生長速度差異明顯。在10～35℃范圍內(nèi)均可生長和產(chǎn)孢，菌絲最適生長溫度為25℃，此時(shí)該菌的生長速度最快，產(chǎn)孢量也最大，達(dá)2.08×106個(gè)/皿，菌絲長勢(shì)良好，菌絲潔白且致密[5]；30℃次之；20℃和35℃時(shí)，病原菌的生長速度接近，長勢(shì)中等；10℃時(shí)生長速度較慢，菌絲長勢(shì)較差；溫度為5℃時(shí)無菌落生長。菌落的生長速度和產(chǎn)孢量的排序均為25℃>30℃>20℃>15℃>10℃>35℃>5℃，可見，紅葉石楠葉斑病病原菌孢子對(duì)于溫度的產(chǎn)孢最適條件為25℃。

表1 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.2 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

由表2可知，pH在4～9范圍內(nèi)時(shí)紅葉石楠葉斑病病原菌均可生長和產(chǎn)孢。當(dāng)pH在7左右時(shí)，菌絲繁殖速度較快，產(chǎn)孢量也較大，當(dāng)pH趨于堿性或趨于酸性時(shí)，菌絲生長量及產(chǎn)孢量均呈現(xiàn)為下降趨勢(shì)。當(dāng)pH為7時(shí)，菌絲長勢(shì)良好，顏色雪白且有密集的紋理，菌落直徑和產(chǎn)孢量最大分別為80.65mm和5.12×106個(gè)/皿。當(dāng)pH為8時(shí)，菌絲生長速度較快，顏色白色，也有可見的細(xì)密紋理。pH為6和9時(shí)，菌絲生長速度非常接近都呈中等水平，菌絲也有較為細(xì)密的紋理。pH為4和5時(shí)生長速度較慢，菌絲顏色淺白且文理不清晰。菌落的生長速度和產(chǎn)孢量的排序均為pH7>pH8>pH6>pH9>pH5>pH4?？梢?，該葉斑病病原菌孢子最適生長pH為7。

表2 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.3 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

由表3可知，以果糖為碳源時(shí)，葉斑病病原菌生長速度最快，菌落直徑最大，可達(dá)73.95mm，菌絲長勢(shì)良好，顏色雪白且有可見的細(xì)密紋理，產(chǎn)孢量最大，最多達(dá)5.13×105個(gè)/皿。以蔗糖為碳源時(shí)的菌絲生長速度較快，顏色白色且呈現(xiàn)出較為細(xì)密的紋理。以果糖或甘露醇為碳源時(shí)，生長速度中等，長勢(shì)良好。山梨醇為碳源時(shí)生長速度較慢，菌絲顏色淺白且長勢(shì)較差。在空白對(duì)照的PDA培養(yǎng)基上也可生長，但菌落極稀薄且不產(chǎn)孢?？梢姡t葉石楠葉斑病病原菌孢子對(duì)各種碳源的吸收都比較好。該病原菌的生長速度和產(chǎn)孢量的排序均為果糖>蔗糖>葡萄糖>甘露醇>山梨醇>空白對(duì)照，最適碳源為果糖。

表3 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.4 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

由表4可知，氮源為硝酸鈉時(shí)生長速度最快，菌落直徑最大，可達(dá)82.23mm，菌絲潔白致密，長勢(shì)良好。產(chǎn)孢量也最大，最多達(dá)1.67×106個(gè)/皿。以甘氨酸為碳源時(shí)生長速度較快，產(chǎn)孢量也較多，長勢(shì)良好。蛋白胨和氯化銨作為碳源時(shí)，生長速度接近，長勢(shì)中等。尿素為碳源時(shí)生長速度較慢，菌絲顏色淺白且長勢(shì)較差。在空白對(duì)照的PDA培養(yǎng)基上，病原菌可生長，菌落極稀薄，不產(chǎn)孢。菌落的生長速度和產(chǎn)孢量的排序均為硝酸鈉>甘氨酸>蛋白胨>氯化銨>空白對(duì)照>尿素?？梢?，硝酸鈉最利于病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢，即最適氮源。

表4 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

3 結(jié)論與討論

研究植物病害病原物在植物保護(hù)、環(huán)境保護(hù)、生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)和發(fā)展以及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展等多方面均有重要意義，本研究首次系統(tǒng)地研究了衡水市紅葉石楠葉斑病的病原菌在不同pH值、溫度、碳源和氮源等因素下對(duì)其菌落生長和產(chǎn)孢量的影響，明確了該菌生長所需要的環(huán)境條件和營養(yǎng)條件，在一定程度上，可以深入了解紅葉石楠葉斑病的發(fā)病規(guī)律，對(duì)于防治該病害的發(fā)生提供了一定的理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，紅葉石楠葉斑病病原菌菌絲的最適生長溫度為20～30℃，在25℃時(shí)繁殖條件最佳，而在低于5℃或高于35℃時(shí)繁殖受到遏制，最適生長pH值為7。研究發(fā)現(xiàn)，該病原菌對(duì)碳源的適應(yīng)性比較強(qiáng)，對(duì)各種碳源的吸收均較好，其中以果糖為最適產(chǎn)孢條件，這與文獻(xiàn)中該類病原菌對(duì)碳源的適應(yīng)性一致[6]。氮源主要為該菌提供氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)，該菌對(duì)氮源的吸收有顯著的差異，其中最適氮源為硝酸鈉。由此可知，病原菌的生物學(xué)特性與病害發(fā)生和流行規(guī)律有著密切的關(guān)系。

由于研究時(shí)間的限制，本課題只對(duì)紅葉石楠葉斑病病原菌產(chǎn)孢影響因素進(jìn)行了基礎(chǔ)的研究，除了小孢擬盤多毛孢之外，還存在一些其他的病原真菌，這些病原真菌的具體類型和它們之間存在某些關(guān)系，不同的培養(yǎng)基類型對(duì)各種病原菌產(chǎn)孢量是否有影響以及各種病原菌的盛發(fā)期均有待深入研究。在此基礎(chǔ)上，還需進(jìn)行殺菌劑、致病力以及紅葉石楠品種抗性鑒定試驗(yàn)，篩選出可有效防治衡水地區(qū)紅葉石楠葉斑病病原菌的化學(xué)藥劑以及抗病品種，以期為綜合防治提供一定的參考。