王晗，朱蓮，唐靚，楊亞冬，趙思雨，張文元

（杭州醫(yī)學(xué)院 1.公共衛(wèi)生學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；3.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310013 ）

前列腺癌是老年男性常見疾病，正嚴(yán)重影響著我國男性患者的健康，尋求精準(zhǔn)的藥物治療很重要［1］。目前，超過90%的潛在抗癌藥物在臨床試驗(yàn)中失敗，主要原因是目前用于藥物開發(fā)和個(gè)性化治療的臨床前模型不準(zhǔn)確［2］，使用了過于簡(jiǎn)化的體外模型，缺乏對(duì)腫瘤微環(huán)境的模擬。雖然2D 培養(yǎng)系統(tǒng)仍然是良好的高通量基礎(chǔ)研究的選擇，但它忽視了細(xì)胞自然的3D 微環(huán)境，難以達(dá)到高水平的生物學(xué)復(fù)雜性［3］。因而很有可能會(huì)提供治療效果的不準(zhǔn)確信息，使得假陽性化合物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在2D 培養(yǎng)條件下篩選為有效藥物，而臨床應(yīng)用往往無效［4］，導(dǎo)致高退出率，浪費(fèi)時(shí)間和金錢。體內(nèi)模型雖然更能反應(yīng)腫瘤的發(fā)生和行為機(jī)制以及藥物代謝，但是這些模型使用和維護(hù)更加昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)涉及倫理問題。由于2D 培養(yǎng)的局限性和體內(nèi)模型的復(fù)雜性，刺激了體外三維腫瘤模型的開發(fā)［5］。3D 細(xì)胞培養(yǎng)可克服2D培養(yǎng)的限制，提高診療效果［6］，正在成為藥物研究中有力的新型手段，成為介于二維培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的一種折中方法［7］，以彌合兩者之間的鴻溝［8-9］，可提高對(duì)生理或病理過程、藥物發(fā)現(xiàn)和篩選的認(rèn)識(shí)［10］。從而提高臨床前藥物研究的預(yù)測(cè)能力，改善藥物臨床轉(zhuǎn)化［11］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）中的人基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、人基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）降解Ⅳ型膠原，在腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移灶的形成中起重要作用［12］。為了改善晚期前列腺癌和骨骼受累患者的預(yù)后，需要更好地了解這一過程是如何啟動(dòng)和調(diào)節(jié)的。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)含量變化，可更全面地捕捉前列腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征及機(jī)制［13］。

3D 生物打印技術(shù)為建立模擬異質(zhì)腫瘤微環(huán)境模型提供了可能性，可以精確定位包括水凝膠、細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)在內(nèi)的生物墨水，以創(chuàng)建3D 體外培養(yǎng)環(huán)境［14］。臨床上前列腺癌患者常采取手術(shù)治療及放療、化療［15］。唑來膦酸是臨床上被廣泛應(yīng)用的化療藥物［16］。本實(shí)驗(yàn)采用唑來膦酸作為藥敏試驗(yàn)藥物。本實(shí)驗(yàn)通過3D 生物打印技術(shù)構(gòu)建前列腺癌PC-3 細(xì)胞3D 模型，并進(jìn)行唑來膦酸藥敏試驗(yàn)，并與2D 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行比較，利用ELISA 法測(cè)定培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)含量變化。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

前列腺癌PC-3 細(xì)胞（賽百慷）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Procell）；海藻酸鈉（Sigma），明膠（Sigma），鈣黃綠素-AM（Solarbio），碘化丙啶（Solarbio）。唑來膦酸（Macklin），先用少量完全培養(yǎng)基溶解，并用0.22 μm 濾膜過濾后，再用完全培養(yǎng)基配置為工作濃度。人基質(zhì)MMP-2、MMP-9 兩種ELISA 試劑盒（晶美生物工程有限公司）；3D 生物打印機(jī)（BioScaffolder2.1，德國GESIM 公司）；熒光倒置顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀（上海普丹光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 前列腺癌細(xì)胞于2D 培養(yǎng)下藥敏試驗(yàn) 前列腺癌PC-3 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的PC-3 細(xì)胞，制成5×104cells/mL 細(xì)胞懸液，100 μL/孔均勻接種于96 孔板。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，棄上清，分別加入不同濃度的唑來膦酸（25、50、100 μmol/L），100 μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔滴加10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處OD 值。細(xì)胞存活率=（加藥處理OD 值/未加藥處理OD 值）×100%。

1.2.2 3D 生物打印構(gòu)建前列腺癌模型 將1.2 g明膠粉末、1.6 g 海藻酸鈉粉末分別溶于10 mL 0.9% NaCl 溶液中。每天70 ℃、30 min 水浴1 次，連續(xù)3 d，對(duì)兩種溶液進(jìn)行滅菌。將PC-3 細(xì)胞制成1×106cells/mL 細(xì)胞懸液，與明膠溶液和海藻酸鈉溶液以1∶2∶2 的體積比均勻混合為前列腺癌細(xì)胞/水凝膠，裝入無菌打印筒，2 000 r/min 離心2 min 消除氣泡，37 ℃水浴加熱5 min，連接內(nèi)徑0.17 mm 的打印槍頭，安裝到3D 生物打印機(jī)上。打印內(nèi)部結(jié)構(gòu)為網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)體，為10 mm×10 mm×0.8 mm。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體由圓柱狀微絲逐層交錯(cuò)堆積形成。料桶溫度37 ℃，氣壓150 kPa，打印速度15 mm/s，無菌操作下擠壓制造。將打印好的前列腺癌細(xì)胞/水凝膠結(jié)構(gòu)體立即滴加5% CaCl2化學(xué)交聯(lián)5 min，即為3D 前列腺癌模型。PBS 輕輕洗滌2～3 次，放入24 孔板中培養(yǎng)，每孔含1 mL 培養(yǎng)基，隔天換液。

1.2.3 3D 條件下檢測(cè)PC-3 細(xì)胞的藥物敏感性上述3D 前列腺癌模型培養(yǎng)1 d 后，棄上清，分別加入不同濃度的唑來膦酸（25、50、100 μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，將Live/Dead 雙熒光染色劑4 μmol/L 鈣黃綠素-AM 和2 μmol/L 碘化丙啶混合并通過0.22 μm 過濾器過濾后，均勻滴加于3D 前列腺癌模型上，于37 ℃黑暗環(huán)境下孵育30 min，PBS 洗滌3 次。熒光倒置顯微鏡分別在488 nm（鈣黃綠素-AM 的激發(fā)波長(zhǎng)）和543 nm（碘化丙啶的激發(fā)波長(zhǎng)）處進(jìn)行圖像采集。每個(gè)樣本選擇3 個(gè)隨機(jī)位置，同一位置、深度拍攝細(xì)胞，綠色為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞，并合并活/死圖像。細(xì)胞存活率=（綠色染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.4 ELISA 試劑盒檢測(cè)2D/3D 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2 和MMP-9 的蛋白濃度 取對(duì)數(shù)期PC-3細(xì)胞，以2.5×104個(gè)/mL 的密度種于24 孔板中，1 mL/孔均勻接種，作為2D 前列腺癌模型。將1.2.2項(xiàng)通過3D 打印技術(shù)構(gòu)建的模型作為3D 前列腺癌模型將上述2D/3D 前列腺癌模型培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入不同終濃度唑來膦酸0、5、10、20 μmol/L，加藥完畢后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。收集細(xì)胞上清液3 000 r/min 離心15 min，小心吸取上清液，分裝后凍存于-80 ℃。每個(gè)濃度均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)上清液中MMP-2 和MMP-9 的蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2D 培養(yǎng)條件下唑來膦酸對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響

當(dāng)唑來膦酸濃度25 μmol/L 作用于PC-3 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞受到一定程度的抑制。當(dāng)濃度50 μmol/L時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯抑制。當(dāng)濃度100 μmol/L 時(shí)，PC-3 細(xì)胞大量死亡。見圖1 及表1。

表1 2D/3D 培養(yǎng)條件下不同濃度唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞存活率的影響（n=3,,%）

表1 2D/3D 培養(yǎng)條件下不同濃度唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞存活率的影響（n=3,,%）

2.2 3D 條件下唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖2 表明，不同濃度唑來膦酸對(duì)3D 條件下前列腺癌細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體中PC-3 細(xì)胞增殖活性，隨著藥物唑來膦酸濃度的遞增，PC-3 活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，死細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。結(jié)果顯示當(dāng)唑來膦酸50 μmol/L 時(shí)，PC-3 死亡細(xì)胞數(shù)量有所增多。當(dāng)唑來膦酸濃度100 μmol/L 作用時(shí)，PC-3 死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。見圖2 及表1。

圖2 不同濃度唑來膦酸對(duì)3D 培養(yǎng)前列腺癌PC-3 細(xì)胞存活的影響（×100）

2.3 2D/3D 條件下唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞存活率影響的比較

與2D 培養(yǎng)條件下相比，不同濃度的唑來膦酸對(duì)3D 培養(yǎng)條件下對(duì)PC-3 前列腺癌細(xì)胞的整體藥物敏感性顯著低于2D 培養(yǎng)條件下的藥物敏感性。即與2D 培養(yǎng)相比，3D 細(xì)胞培養(yǎng)的整體耐藥性顯著增加。見表1。

2.4 2D/3D 條件下唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影響

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度唑來膦酸于2D/3D 條件下作用于PC-3 細(xì)胞36 h，均可導(dǎo)致MMP-2 和MMP-9 的分泌減少，并呈劑量依賴關(guān)系。與空白0 μmol/L 相比，各濃度組MMP-2 和MMP-9 的分泌減少。3D 培養(yǎng)上清液MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌濃度的下降速度均明顯慢于2D 培養(yǎng)模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9 蛋白分泌的影響（n=5,,ng/mL）

表2 唑來膦酸對(duì)PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9 蛋白分泌的影響（n=5,,ng/mL）

注：1）與0 μmol/L 相比，P＜0.05；2）與2D 比較，P＜0.05。

3 討論

盡管在癌癥研究和藥物發(fā)現(xiàn)/開發(fā)方面有重大投資，但新癌癥藥物批準(zhǔn)率≤5%，大多數(shù)轉(zhuǎn)移性癌癥仍然無法治愈。絕大多數(shù)的癌癥新藥在臨床開發(fā)中失敗，因?yàn)槿狈χ委熜Ч?或不可接受的毒性?？拱┧幬镩_發(fā)成功率低的主要原因之一是臨床前模型未能充分概括人類癌癥的復(fù)雜性和異質(zhì)性。在體內(nèi)測(cè)試之前，大多數(shù)癌癥生物學(xué)家仍然依賴傳統(tǒng)的2D 單層培養(yǎng)技術(shù)，在體外測(cè)試抗腫瘤藥物［17］。盡管易于處理，2D 培養(yǎng)的結(jié)果往往不能有效地轉(zhuǎn)化為體內(nèi)臨床前研究，絕大多數(shù)有前景的臨床前藥物對(duì)真正的腫瘤患者無效，從而延誤了成功治療方法的發(fā)現(xiàn)。這是因?yàn)?D 培養(yǎng)缺乏細(xì)胞與細(xì)胞、以及細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的接觸，這在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)和藥物反應(yīng)中很重要，從而導(dǎo)致與真實(shí)腫瘤相比惡性表型減少［18］。無論是2D 癌細(xì)胞培養(yǎng)，還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，都難以破解其藥物測(cè)試的局限性［19］。生物工程的進(jìn)步尤其令人鼓舞的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的3D 技術(shù)快速發(fā)展，具體而言，三維培養(yǎng)最近獲得了腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞模型，在模擬癌癥生態(tài)位和腫瘤微環(huán)境，以及與其之間的相互作用方面顯示了巨大的潛力。從這個(gè)意義上說，更好地重現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境的癌細(xì)胞3D 培養(yǎng)成為科學(xué)上準(zhǔn)確和低成本的癌癥模型，用于臨床前篩選和測(cè)試新藥候選藥物，然后再轉(zhuǎn)向昂貴和耗時(shí)的動(dòng)物模型［20］。此外，盡管動(dòng)物模型是臨床前研究的關(guān)鍵，但已經(jīng)實(shí)施了更嚴(yán)格的指令，以促進(jìn)替代生物系統(tǒng)的使用。在此背景下，3D 腫瘤模型的開發(fā)和整合到臨床前研究工作流程尤其具有吸引力，在減少體內(nèi)模型數(shù)量的同時(shí)，促進(jìn)臨床試驗(yàn)治療學(xué)的進(jìn)步和成功［21］。3D 腫瘤模型彌合了2D 細(xì)胞培養(yǎng)模型和體內(nèi)模型之間的一些差異，其中包括形態(tài)、極性、藥物滲透性和基因表達(dá)?？商岣咝滦椭委熕幬锏念A(yù)測(cè)性能，并為個(gè)性化治療提供機(jī)會(huì)［22］。

3D 模式下藥物可能無法完全穿透3D 系統(tǒng)到達(dá)核心附近的癌細(xì)胞，與2D 培養(yǎng)系統(tǒng)相比，這些細(xì)胞對(duì)藥物具有更強(qiáng)的抵抗力，往往更好地預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物反應(yīng)［23］。3D 模型通常顯示的藥物反應(yīng)行為比2D 培養(yǎng)更接近實(shí)際腫瘤［24］。因此，為癌癥研究增加另一個(gè)維度既不會(huì)取代現(xiàn)有的2D 細(xì)胞培養(yǎng)，也不會(huì)取代動(dòng)物試驗(yàn)，但它肯定會(huì)有助于提高療效的可預(yù)測(cè)性［25-26］。由于化療藥物研發(fā)具有高成本和所需時(shí)間長(zhǎng)的特性，應(yīng)繼續(xù)研發(fā)更加精準(zhǔn)的篩選平臺(tái)。利用3D 打印機(jī)構(gòu)建的3D 在腫瘤細(xì)胞模型，精準(zhǔn)性高，可重復(fù)連續(xù)打印，耗時(shí)短且開發(fā)成本較為低廉［27］。利用3D 生物打印機(jī)構(gòu)建的腫瘤模型有望成為2D 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)支架的橋梁。3D 生物打印水凝膠的優(yōu)勢(shì)在于能夠更為準(zhǔn)確地模仿細(xì)胞外基質(zhì)［28］。3D 環(huán)境中的前列腺癌細(xì)胞埋藏于不同層次的前列腺癌模型中，大部分細(xì)胞生長(zhǎng)階段不同，處于3D 條件下的前列腺癌細(xì)胞與正常體內(nèi)癌細(xì)胞更為接近［17］。

3D 生物打印水凝膠前列腺癌模型為癌細(xì)胞提供了廣闊的空間，3D 前列腺癌模型中的腫瘤細(xì)胞成多層結(jié)構(gòu)，可使癌細(xì)胞持續(xù)增長(zhǎng)。同時(shí)3D 前列腺癌模型充分模擬了細(xì)胞外基質(zhì)與癌細(xì)胞之間的通訊功能，并造成細(xì)胞缺氧狀態(tài)，增加了癌細(xì)胞增殖時(shí)間［21］。與2D 細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)估藥物敏感性相比，3D 生物打印技術(shù)的使用使研究人員獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。但當(dāng)前的3D 打印生物打印仍然受細(xì)胞類型和模型設(shè)計(jì)的限制，需要進(jìn)一步的工作開發(fā)生物材料和打印方法來構(gòu)建可以更好地模仿動(dòng)態(tài)生化和機(jī)械環(huán)境的腫瘤模型。

考慮到超過25 μmol/L 唑來膦酸對(duì)2D 培養(yǎng)的PC-3 細(xì)胞有較大的損傷，所以本實(shí)驗(yàn)采用≤20 μmol/L唑來膦酸檢測(cè)其在2D/3D 條件下對(duì)PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著唑來膦酸濃度的升高，PC-3 細(xì)胞存活率成下降趨勢(shì)。唑來膦酸的藥敏性在2D 和3D 條件下有顯著差異，在3D 環(huán)境中前列腺癌細(xì)胞的存活率顯著高于2D 環(huán)境。隨著唑來膦酸濃度的升高，3D 細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的下降速度均明顯慢于2D 培養(yǎng)模型?？赡苁且?yàn)?D 培養(yǎng)方法在能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下，允許細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，可能更好地反映了真實(shí)的腫瘤微環(huán)境，比單層細(xì)胞培養(yǎng)更類似于體內(nèi)生長(zhǎng)的形態(tài)。

綜上所述，使用3D 生物打印技術(shù)構(gòu)建的PC-3 前列腺癌細(xì)胞水凝膠結(jié)構(gòu)體（3D 前列腺癌模型）具有比2D 培養(yǎng)更高的耐藥性，細(xì)胞培養(yǎng)的空間維度及其與基質(zhì)之間的相互作用對(duì)藥物的耐藥性評(píng)估有顯著影響。