楊 帆,陳 靜,張 斌,李嬌嬌,張 麗,邊桂風(fēng),邊雅靜,郎曉燕 （河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像部，河北 張家口 075000）

乳腺癌是女性人群多發(fā)惡性腫瘤，由乳腺上皮細胞在各種刺激下異常增殖引發(fā)，發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首，且有升高趨勢，嚴重威脅患者生命[1-2]。乳腺癌治療以手術(shù)為主，放化療、分子靶向藥物治療為輔[3]。miR-4500可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移[4]及血管生成[5]，屬于抑癌因子。TargetScanHuman 數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-4500與神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）存在結(jié)合位點，NGF 屬于多功能生長因子，其可通過促進細胞膜上絡(luò)氨酸激酶活化促進癌細胞的增殖[6]。Bruno 等[7]研究顯示，NGF 由乳腺癌細胞合成及釋放，促NGF 信號傳導(dǎo)與乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，磁共振（magnetic resonance，MR）征象可為臨床提供無創(chuàng)、清晰的信息，反映乳腺病理變化，在乳腺疾病中有較好的應(yīng)用[8]。生物學(xué)分子水平變化與MR 征象的相關(guān)性對臨床乳腺癌診治有一定作用，但miR-4500、NGF表達與MR征象是否具有相關(guān)性尚不清楚。基于此，本研究通過分析乳腺癌患者術(shù)前MR征象與miR-4500、NGF的相關(guān)性，探討MR 征象與乳腺癌分子生物學(xué)特性的關(guān)系，以期為該病的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取本院2020 年1 月至2022 年1 月收治的乳腺癌患者105 例，分析其術(shù)前MR 及臨床資料。納入標(biāo)準：①術(shù)前MR 檢查資料完整；②行手術(shù)治療，術(shù)后留存癌組織及癌旁組織樣本；③MR 檢查與手術(shù)間隔期在2周及以上。排除標(biāo)準：①合并其他惡性腫瘤；②MR檢查前接受過手術(shù)治療或放化療。

1.2 術(shù)前MR掃描

患者取仰臥位足先進，通過3.0T MR 儀行雙側(cè)乳腺掃描。層厚/層間距為4 mm/0.5 mm；T1WI 參數(shù)：TE為500 ms，TR 為20 ms；T2WI 參數(shù)：TE 為5 300 ms，TR為80 ms；DWI 參數(shù)：TE 為8 400 ms，TR 為90 ms，擴散敏感梯度場參數(shù)b為0、800 s/mm2。

增強掃描：視野280 cm×340 cm，矩陣280×340，層厚/層間距為1 mm/0 mm，以2.5 mL/s 的流速注入釓噴酸葡甲胺鹽顯影劑（0.15 mL/kg）。采集MR征象，包括乳腺實質(zhì)背景強化、腺體類型、表觀彌散系數(shù)、強化曲線、環(huán)形強化、瘤周水腫等。

1.3 qRT-PCR法檢測miR-4500、NGF mRNA表達

收集乳腺癌組織及其癌旁組織標(biāo)本，通過RNA 試劑盒提取組織RNA，將部分RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR 儀進行擴增：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35 次。miR-4500 以U6 為內(nèi)參，NGF 以GAPDH 為內(nèi)參，2-△△Ct法測定組織中miR-4500、NGF mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 免疫組化法檢測NGF陽性表達

將石蠟保存的乳腺癌與癌旁組織標(biāo)本脫蠟、切片、修復(fù)抗原，然后室溫封閉；加入兔抗人NGF（稀釋比1∶500），4 ℃過夜孵育；添加羊抗兔二抗IgG（稀釋比1∶1 000）37 ℃孵育30 min，DAB染色試劑盒進行染色。染色強度評分：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞率評分：＜25%為0分，25%～50%為1 分，51%～75%為2 分，＞75%為3 分。由2名專業(yè)人員進行評分，兩項評分相乘，≤3分為陰性表達，＞3分為陽性表達。

1.5 觀察指標(biāo)

收集患者年齡、病理類型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分型、腫瘤直徑、腫瘤形態(tài)等臨床資料及MR征象。生物信息網(wǎng)站預(yù)測miR-4500 與NGF 的靶向關(guān)系，并分析二者表達的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，行t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-4500、NGF mRNA水平

與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miR-4500水平降低（P＜0.05），NGF mRNA 水平升高（P＜0.05），見表2。乳腺癌組織中NGF陽性表達率為76.3%，高于癌旁組織的23.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=57.619，P＜0.001）。

表2 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-4500、NGF mRNA 水平比較（x-±s，n=105）

2.2 乳腺癌組織中miR-4500、NGF 表達與臨床特征及MR征象的關(guān)系

NGF 陽性表達80 例，陰性表達25 例。以乳腺癌患者組織中miR-4500 表達的均值（0.35）為界，將其分為miR-4500 低表達組（＜0.35，52 例）與miR-4500 高表達組（≥0.35，53 例）。年齡、病理類型、腫瘤分型、實質(zhì)背景、表觀彌散系數(shù)、強化曲線在不同miR-4500表達及NGF表達間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、腫瘤形態(tài)、環(huán)形強化、瘤周水腫與miR-4500 表達及NGF 表達有關(guān)（P＜0.05），見表3～4。

表3 患者miR-4500、NGF表達與臨床特征的相關(guān)性[例（%）]

表4 患者miR-4500、NGF表達與MR征象的相關(guān)性

2.3 乳腺癌組織中miR-4500與NGF mRNA的相關(guān)性

生物信息網(wǎng)站預(yù)測顯示，miR-4500與NGF 存在結(jié)合位點（圖1）。乳腺癌組織中miR-4500與NGF mRNA表達呈負相關(guān)（r=-0.576，P＜0.05），見圖2。

圖1 生物信息網(wǎng)站預(yù)測miR-4500、NGF結(jié)合位點

圖2 miR-4500與NGF mRNA表達的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，2020年有226萬例乳腺癌病例，該疾病是全球女性癌癥死亡的主要原因[9]。MR 等影像學(xué)技術(shù)為乳腺癌提供了直觀圖像，為臨床患者的診治提供參考。影像學(xué)成像機制建立在臨床病變基礎(chǔ)上，而分子變化會導(dǎo)致臨床病變的發(fā)生，因此影像學(xué)檢查的研究具有重要的意義[10]。了解特異性分子異常表達與影像學(xué)變化的相關(guān)性，可為影像學(xué)特征的指向性提供參考，有助于臨床治療方案的制定。

NGF 是神經(jīng)營養(yǎng)素因子家族成員，其受體包括p75 NTR，而p75 NTR 屬于腫瘤壞死因子受體家族，在機體正常組織、病變組織中均可存在，NGF 可與p75 NTR 受體結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤的生長[11]。Vera 等[12]研究顯示，NGF/原肌球蛋白激酶通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子與cMYC 表達，促進卵巢癌細胞增殖、血管生成。Mazaki 等[13]研究顯示，乳腺癌細胞中NGF 可促進脊髓轉(zhuǎn)移模型大鼠軸索生長和降鈣素基因相關(guān)肽的表達。本研究生物信息學(xué)分析顯示，miR-4500與NGF 存在結(jié)合位點。miR-4500在非小細胞肺癌[14]、結(jié)直腸癌[15]、膀胱癌[16]中均發(fā)揮抑癌作用。咼月等[4]的研究顯示，miR-4500 可通過轉(zhuǎn)錄后下調(diào)LIN28B 基因表達抑制乳腺癌的進展與轉(zhuǎn)移。 本研究乳腺癌組織中NGF mRNA 與蛋白陽性表達率均高于癌旁組織，而miR-4500 水平低于癌旁組織，且NGF、miR-4500 表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級相關(guān)，提示NGF 在乳腺癌中發(fā)揮促癌作用，而miR-4500 發(fā)揮抑癌作用；miR-4500 與NGF mRNA 表達呈負相關(guān)，且二者存在靶向結(jié)合位點，推測miR-4500可能通過調(diào)控NGF發(fā)揮作用。miR-4500、NGF 可能通過激活患者體內(nèi)相關(guān)信號通路，促進癌細胞的快速增殖與擴散，腫瘤浸潤能力增強，從而導(dǎo)致癌癥進展。瘤周水腫是乳腺癌惡性程度的重要MR 參數(shù)，癌細胞增殖迅猛時通常伴新生血管生成，而新生血管較薄，通透性高，容易在腫瘤周圍形成水腫[17]。研究發(fā)現(xiàn)，瘤周水腫也是乳腺癌預(yù)后不良的重要參數(shù)[18]。本研究中miR-4500、NGF 表達與瘤周水腫相關(guān)，提示NGF 可作為反映乳腺癌進展的重要指標(biāo)，患者出現(xiàn)瘤周水腫征象時，可能病理表現(xiàn)為NGF 高表達，miR-4500 低表達。MR 環(huán)形強化是乳腺癌侵襲過程中新生血管在對比劑填充下呈環(huán)狀帶，可反映疾病的進展，是乳腺癌患者復(fù)發(fā)及預(yù)后不良的危險因素[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，NGF、miR-4500 表達與MR 環(huán)形強化亦具有相關(guān)性，進一步提示了NGF、miR-4500 參與乳腺癌的進展，也為MR 環(huán)形強化的形成提供了分子依據(jù)。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-4500 低表達、NGF高表達與患者術(shù)前MR征象具有一定相關(guān)性，為MR征象提供了分子學(xué)依據(jù)。但本研究參數(shù)單一，且病例數(shù)相對較少，后續(xù)將展開多參數(shù)及大樣本的研究進一步驗證結(jié)論。