張麗君,嚴(yán)偉恒,黃國慶,孫充洲 （電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院/綿陽市中心醫(yī)院燒傷整形外科，四川 綿陽 621000）

惡性黑色素瘤（malignant melanoma,MM）為侵襲性強(qiáng)的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚、黏膜等組織，易轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差[1]。皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma,CMM）為原發(fā)灶在皮膚的MM，發(fā)病率占全身惡性腫瘤的1%～3%，且呈上升趨勢[2]。雖然醫(yī)療診斷技術(shù)不斷改進(jìn)，但多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。故尋找新型有效的治療靶點(diǎn)成為臨床研究熱點(diǎn)。miRNAs 為非編碼小分子RNA，參與生命活動(dòng)的調(diào)控過程，尤其是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。miRNAs 在不同組織中有不同生物學(xué)作用，不同miRNAs 可靶向調(diào)控不同信號(hào)通路，發(fā)揮基因調(diào)控作用[4]。miR-205是在多物種間高度保守的miRNA，具有抑制腫瘤的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-205在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]中表達(dá)下調(diào)。miR-367 位于4 號(hào)染色體q25區(qū)，其在腫瘤、心血管疾病等中具有重要調(diào)控功能，在不同疾病中可通過靶向調(diào)節(jié)靶基因發(fā)揮不同生物學(xué)作用，其可增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞增殖能力，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。但關(guān)于miR-367 在CMM 組織中的作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。因此，本研究通過分析miR-205、miR-367 在CMM 組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年5月至2019年12月我院收治的85例CMM 患者，以莫氏手術(shù)術(shù)中切除的腫瘤組織為CMM組。其中男48 例，女37 例；年齡29～77 歲，平均（56.68±2.31）歲；腫瘤位置：四肢39 例，非肢端46 例；美國癌癥聯(lián)合會(huì)第7 版腫瘤分期[9]：Ⅰ期27 例，Ⅱ期33 例，ⅢA～B 期25 例；潰瘍33 例，無潰瘍52 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例，未轉(zhuǎn)移49 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國黑色素瘤診治指南（2011 版）》中CMM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，且經(jīng)病理檢查確診；②臨床分期為ⅠA～ⅢB 期，具有手術(shù)指征；③術(shù)前無放療、激光治療等；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重慢性病；②合并其他惡性腫瘤；③原發(fā)灶于皮膚外；④存在活動(dòng)性病毒或細(xì)菌感染；⑤合并精神疾病。另選取同期于本院治療的80 例皮膚良性色素痣患者的痣組織標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男45 例，女35 例；年齡27～76 歲，平均（56.73±2.46）歲；發(fā)病位置：四肢41 例，非肢端39 例。2 組患者性別、年齡、發(fā)病位置比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2013 倫（審）N0406011]，患者對(duì)本研究知情同意。

1.2 臨床資料收集

收集CMM 患者性別、年齡、潰瘍、腫瘤直徑、臨床分期、腫瘤侵襲性、Karnofsky 功能狀態(tài)（Karnofsky performance status,KPS）評(píng)分（總分0～100 分，得分越低表示患者健康狀態(tài)越差）、原發(fā)灶厚度、Clark 分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料。CMM 患者術(shù)后定期電話或門診隨訪3 年，隨訪截止時(shí)間為2022 年12 月31 日或患者死亡；統(tǒng)計(jì)患者總生存時(shí)間，即從出院后至死亡或隨訪結(jié)束的時(shí)間。

1.3 qRT-PCR檢測miR-205、miR-367的相對(duì)表達(dá)量

按TRIzol 試劑盒說明書提取組織總RNA，按mRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按SYBR Green PCR master mix 試劑說明書配置反應(yīng)體系，加樣。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 10 μL、cDNA 2.0 μL、上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μL、ddH2O 6.0 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40 個(gè)循環(huán)，然后72 ℃反應(yīng)10 min。以GAPDH 為內(nèi)參。 miR-205 正向引物5' -AG AACTTATACTGAGTGAGG-3'，反向引物5'-GAAGTC AAGATCGAATTG-3'；miR-367 正向引物5'-TTCTCCG AACTTGTCACGTTT-3'，反向引物5'-ACGTGACACGT TCGGAGAATT-3'；GAPDH 正向引物5'-GAAGGTGA AGGTCGCAGTC3'，反向引物5'-GAAGATGGTGATG GGATTTC-3'。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，分析獲得的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-205、miR-367 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)分析生存率；COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析預(yù)后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織miR-205、miR-367表達(dá)水平的比較

CMM 組患者miR-205 表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），miR-367 表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 不同組織miR-205、miR-367表達(dá)水平的比較（±s）

表1 不同組織miR-205、miR-367表達(dá)水平的比較（±s）

組別對(duì)照組CMM組n 80 85 tP miR-205 1.02±0.15 0.46±0.07 34.648＜0.001 miR-367 1.12±0.20 2.23±0.53 19.319＜0.001

2.2 患者miR-205、miR-367表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

以miR-205、miR-367 在CMM 組織中表達(dá)水平的均數(shù)為臨界值，將患者分為miR-205低表達(dá)組（≤0.46，52 例）、高表達(dá)組（＞0.46，33 例）及miR-367 高表達(dá)組（≥2.23，59例）、低表達(dá)組（＜2.23，26例）。

miR-205 低表達(dá)組患者潰瘍、臨床分期高、腫瘤侵襲、KPS 評(píng)分低、原發(fā)灶厚、Clark 分級(jí)高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例高于miR-205 高表達(dá)組（P＜0.05），miR-367 高表達(dá)組患者以上指標(biāo)比例高于miR-367 低表達(dá)組（P＜0.05）；miR-205、miR-367 表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 患者miR-205、miR-367表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 患者生存分析

患者術(shù)后隨訪3 年，中位時(shí)間為28.3 個(gè)月，失訪1 例。Kaplan-Meier生存曲線顯示，miR-205 高表達(dá)組患者3 年生存率為69.70%（23/33），高于低表達(dá)組患者的50.98%（26/51）；miR-367 低表達(dá)組患者3 年生存率為69.23%（18/26），高于高表達(dá)組患者的53.45%（31/58），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線

2.4 患者預(yù)后的影響因素分析

單因素分析顯示，臨床分期、腫瘤侵襲性、KPS 評(píng)分、原發(fā)灶厚度、Clark 分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-205、miR-367為預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。COX多因素分析顯示，臨床分期高、KPS 評(píng)分低、Clark 分級(jí)高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-367 升高為影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），miR-205 升高為其保護(hù)因素（P＜0.05），見表3。

表3 患者預(yù)后的單因素與多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

CMM 為來源于皮膚黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，隱匿性及惡性程度較高，易發(fā)生血管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且病情發(fā)展迅速，嚴(yán)重威脅患者的健康[11-12]。CMM 的臨床治療以手術(shù)為主，患者確診后應(yīng)盡快行原發(fā)灶擴(kuò)大切除手術(shù)，臨床分期Ⅲ期的患者在擴(kuò)大切除的基礎(chǔ)上還應(yīng)實(shí)施區(qū)域淋巴結(jié)清掃；化療也是其常用的治療方式，但僅少部分患者對(duì)化療敏感；靶向治療為近年來快速發(fā)展的方法，針對(duì)性較強(qiáng)，故CMM 靶向基因突變成為目前臨床研究的熱點(diǎn)[13]。

miRNAs 為具有基因調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可直接切割mRNA 或直接翻譯抑制其目標(biāo)蛋白編碼基因[14]。特定miRNAs 與多種生理、病理過程有關(guān)[14]。miRNAs 對(duì)癌癥的影響取決于其靶基因的功能性質(zhì)，可分別通過靶基因的功能性質(zhì)產(chǎn)生抑癌或致癌效果[15]。miR-205 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等多種功能，在癌癥中其表達(dá)發(fā)生改變[7]。當(dāng)miR-205表達(dá)下調(diào)時(shí)，鑒定其靶基因可能有助于判斷CMM 轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的分子途徑，該途徑可以為阻斷CMM的轉(zhuǎn)移提供新的潛在治療靶點(diǎn)[16]。研究指出，miR-205 在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)后能抑制癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移等過程[7]。據(jù)報(bào)道，miR-367 參與了不同癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，起促癌或抑癌作用[17-18]。研究顯示，miR-367 過表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長，與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后相關(guān)[18]。目前，臨床研究中關(guān)于miR-205、miR-367 在CMM 中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，CMM 組患者miR-205表達(dá)水平低于對(duì)照組，miR-367表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示miR-205、miR-367 與CMM 的發(fā)生有關(guān)，可能是miR-205、miR-367 參與調(diào)控CMM 細(xì)胞增殖過程。研究顯示，miR-205 能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程[19]，miR-205 表達(dá)下調(diào)可促使CMM 的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，縮短患者的生存時(shí)間；miR-367 在CMM 細(xì)胞中一個(gè)重要的靶點(diǎn)為PTEN，通過靶向PTEN 基因發(fā)揮促癌作用，參與癌細(xì)胞的增殖、遷移等惡性行為[20]。

本研究結(jié)果顯示，miR-205、miR-367 表達(dá)與患者潰瘍、臨床分期高、腫瘤侵襲、KPS 評(píng)分低、原發(fā)灶厚、Clark分級(jí)高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，提示miR-205、miR-367 可能參與CMM 的發(fā)生、發(fā)展過程；Kaplan-Meier生存曲線顯示，miR-205 高表達(dá)組患者3 年生存率高于miR-205 低表達(dá)組，miR-367 低表達(dá)組患者3 年生存率高于miR-367 高表達(dá)組，miR-205 升高為患者預(yù)后的保護(hù)因素，miR-367 升高為患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示miR-205、miR-367 表達(dá)與CMM 患者預(yù)后有關(guān)，推測miR-205 具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[21]，miR-205 表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)CMM 進(jìn)展。miR-367 高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，并抑制其靶基因PTEN表達(dá)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，進(jìn)而導(dǎo)致患者預(yù)后不良[22]。提示miR-367 可能通過調(diào)節(jié)靶基因PTEN 表達(dá)以促進(jìn)CMM發(fā)展。

本研究COX回歸模型顯示，臨床分期高、KPS 評(píng)分低、Clark 分級(jí)高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。研究顯示，KPS 評(píng)分＜80 分的患者無法獨(dú)立正常工作，分?jǐn)?shù)越低，其狀態(tài)越差，預(yù)后也較差[23]。Clark分級(jí)越高表示浸潤程度越深[24]，腫瘤侵襲性越強(qiáng)，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)也越大。因此，對(duì)于具有以上特征的患者，臨床應(yīng)提前做好風(fēng)險(xiǎn)預(yù)防措施。

綜上，在CMM 組織中miR-205低表達(dá)，miR-367高表達(dá)，且與患者潰瘍、臨床分期低、腫瘤侵襲、KPS評(píng)分低、原發(fā)灶厚、Clark 分級(jí)高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且miR-205 高表達(dá)、miR-367 低表達(dá)的患者生存率更高，可作為評(píng)估CMM預(yù)后的潛在標(biāo)志物，具體作用機(jī)制需結(jié)合細(xì)胞或動(dòng)物模型進(jìn)一步研究。