陳 兵,馮 浩,鄒成功,唐 輝 （南充市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 南充 637000）

腦膠質(zhì)瘤是起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高[1]。目前治療方案以手術(shù)切除為主，并輔以放療、化療等。然而腦膠質(zhì)瘤難以根治，治療效果欠佳，易復(fù)發(fā)，患者預(yù)后差[2]。因此，迫切需要從分子層面深入研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病和發(fā)展機(jī)制[3]。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類由共價閉環(huán)形成的新型內(nèi)源性非編碼RNA 分子，有共價閉環(huán)的特征和基因調(diào)控潛力[4]，沒有編碼蛋白的能力[5-6]。circRNA 的重要生理功能包括miRNA 海綿、蛋白質(zhì)翻譯和基因表達(dá)調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 的異常表達(dá)在腫瘤的生長、疾病的診斷和治療等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控與靶向作用[7-8]。circRNA TRIM33-12（circ-TRIM33-12）的下調(diào)與肝癌惡性特征顯著相關(guān)，是影響肝癌患者術(shù)后總生存率和無復(fù)發(fā)生存率的獨(dú)立危險因素[9]。但circTRIM33-12在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)和生物學(xué)功能目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，miR-191在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮了重要作用[10]；還有研究通過分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化發(fā)現(xiàn)，DAB2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[11]，表明miR-191與DAB2 在膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有研究報道，在肝癌細(xì)胞中，circTRIM33-12與miR-191具有直接的靶向作用[11]；在乳腺癌細(xì)胞中，miR-191 與DAB2 具有靶向作用[12]。但在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，是否通過相同的作用靶點(diǎn)發(fā)揮作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是細(xì)胞發(fā)育過程中的生理性重編程現(xiàn)象，在此過程中，上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，細(xì)胞運(yùn)動性和遷移能力增強(qiáng)，與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，激活EMT 是腦膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程[13]。因此，本研究旨在分析circ-TRIM33-12 通過miR-191/DAB2 軸對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和EMT的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞和試劑

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5、人正常腦膠質(zhì)上皮細(xì)胞HEB 購自上海弘順生物科技有限公司，SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司，點(diǎn)突變試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，siRNA NC、circ-TRIM33-12 siRNA、miR-191 inhibitor、miR-191 mimics、DAB2 siRNA 等質(zhì)粒由上海Genepharma 公司合成，雙熒光素酶活性檢測試劑盒、RIPA 裂解液購自英國Abcam 公司，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，Turbofect購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

CHG-5 細(xì)胞和HEB 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中生長并傳代培養(yǎng)。顯微鏡下觀察CHG-5 細(xì)胞密度為70%～80%時，加入10% 胎牛血清的DMEM 稀釋細(xì)胞并接種于12 孔板，Turbofect 試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：①siRNA NC 組、circTRIM33-12 siRNA 組、DAB2 siRNA 組；②mimics NC 組、miR-191 mimics 組；③circ-TRIM33-12 WT+mimics NC 組、circTRIM33-12 WT+miR-191 mimics組、circTRIM33-12 MUT+mimics NC組、circTRIM33-12 MUT+miR-191 mimics組；④inhibitor NC組、miR-191 inhibitor 組；⑤pcDNA+mimics NC 組、pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 組、pcDNA+miR-191 mimics 組、pcDNA-TRIM33-12+miR-191 mimics 組；⑥D(zhuǎn)AB2 WT+mimics NC組、DAB2 WT+miR-191 mimics組、DAB2 MUT+mimics NC 組、DAB2 MUT+miR-191 mimics組。

1.3 CCK-8測定CHG-5細(xì)胞活力

CHG-5 細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM 稀釋，置于96 孔板上，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，用Turbofect 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒細(xì)胞。于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，常規(guī)孵育4～6 h后，在450 nm 波長處檢測每孔細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測熒光素酶活性

TargetScan 預(yù) 測 circTRIM33-12 與 miR-191、miR-191 與DAB2 的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建circTRIM33-12 WT、DAB2 WT、circTRIM33-12 MUT 和DAB2 MUT 載體。通過Turbofect將circTRIM33-12 WT、circTRIM33-12 MUT 分別與miR-191 mimics、mimics NC 質(zhì)粒，DAB2 WT、DAB2 MUT 分別與miR-191 mimics、mimics NC 共轉(zhuǎn)染至CHG-5 細(xì)胞，并進(jìn)行雙熒光素酶報告基因活性檢測。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

CHG-5細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后以900 r/min離心5 min，用PBS清洗沉淀3次，細(xì)胞稀釋至1×106/mL，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，輕輕混勻后在暗室中孵育15 min，每管加入400 μL 1×Binding Buffer后檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 RT-qPCR檢測相關(guān)基因表達(dá)

TRIzol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA，使用Prime-ScriptTMIV 1st Strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，配置相應(yīng)的體系，每組設(shè)置3個復(fù)孔，進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，39 個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法分析。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液進(jìn)行蛋白裂解，使用BCA 法測定蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，濃縮膠75 V 30 min，分離膠120 V 90 min。將蛋白在80 V 濕轉(zhuǎn)2 h 到PVDF 膜上，室溫封閉3 h 后，將PVDF膜和特異性一抗在4 ℃孵育12 h，與相應(yīng)二抗置于室溫孵育90 min，清洗5 次，滴加ECL 反應(yīng)液進(jìn)行蛋白顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算E-cadherin和N-cadherin表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad prism 軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHG-5 細(xì)胞和HEB 細(xì)胞中circTRIM33-12、miR-191、DAB2的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，HEB細(xì)胞中的circTRIM33-12、DAB2 mRNA 表達(dá)高于CHG-5 細(xì)胞，miR-191 表達(dá)低于CHG-5細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各細(xì)胞中circTRIM33-12、miR-191、DAB2 mRNA表達(dá)

2.2 下調(diào)circTRIM33-12 表達(dá)對CHG-5 細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響

siRNA NC 組CHG-5 細(xì)胞circTRIM33-12 表達(dá)高于circTRIM33-12 siRNA 組（P＜0.01），見圖2a。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，circTRIM33-12 siRNA 組CHG-5細(xì)胞凋亡率明顯低于siRNA NC 組（P＜0.01），見圖2b。下調(diào)circTRIM33-12 表達(dá)促進(jìn)了CHG-5 細(xì)胞增殖（P＜0.05），見圖2c。Western blot 結(jié)果顯示，下調(diào)circ-TRIM33-12 表達(dá)后，N-cadherin 表達(dá)升高（P＜0.01），而E-cadherin表達(dá)降低（P＜0.01），見圖2d。

圖2 下調(diào)circTRIM33-12表達(dá)對CHG-5細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響

2.3 circTRIM33-12 與miR-191 靶向關(guān)系的預(yù)測和驗(yàn)證

circTRIM33-12 可與miR-191 靶向結(jié)合（圖3a）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，mimics NC 組與miR-191 mimics 組中miR-191 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見

圖3 circTRIM33-12與miR-191結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測和驗(yàn)證

2.4 miR-191影響CHG-5細(xì)胞的增殖、凋亡及EMT

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-191 inhibitor 組CHG-5細(xì)胞增殖能力明顯低于inhibitor NC 組(P＜0.05)，見圖4a。Western blot 結(jié)果顯示，下調(diào)miR-191 表達(dá)后，E-cadherin 表達(dá)升高（P＜0.01），N-cadherin 表達(dá)降低（P＜0.01），見圖4b。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表示，miR-191 inhibitor 組CHG-5 細(xì)胞凋亡率明顯高于inhibitor NC組(P＜0.05)，見圖4c。

圖4 miR-191影響CHG-5細(xì)胞的增殖、凋亡及EMT

2.5 上調(diào)circTRIM33-12 通過miR-191 對CHG-5 細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響

pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 組CHG-5 細(xì)胞中circTRIM33-12表達(dá)顯著高于pcDNA+mimics NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與pcDNA+mimics NC 組相比，pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 組CHG-5 細(xì)胞增殖圖3b。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與circ-TRIM33-12 WT+mimics NC 組比較，circTRIM33-12 WT+miR-191 mimics 組熒光素酶活性顯著降低(P＜0.01)；與circTRIM33-12 MUT+mimics NC 組比較，circTRIM33-12 MUT+miR-191 mimics 組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3c。能力和N-cadherin表達(dá)降低（P＜0.01），E-cadherin表達(dá)和細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)；而pcDNA+miR-191 mimics 組CHG-5 細(xì)胞增殖能力和N-cadherin 表達(dá)升高（P＜0.01），E-cadherin 表達(dá)和細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.01)。與pcDNA+miR-191 mimics 組相比，pcDNATRIM33-12+miR-191 mimics 組CHG-5 細(xì)胞增殖能力和N-cadherin表達(dá)降低（P＜0.01），E-cadherin表達(dá)和細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.01)，見圖5。

圖5 上調(diào)circTRIM33-12通過miR-191對CHG-5細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響

2.6 miR-191與DAB2之間的關(guān)系

miR-191 可與DAB2 靶向結(jié)合（圖6a）。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，DAB2 WT+miR-191 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性低于DAB2 WT+mimics NC 組(P＜0.01)；與DAB2 MUT+mimics NC 組比較，DAB2 MUT+miR-191 mimics 組細(xì)胞熒光素酶活性無變化(P＞0.05)，見圖6b。

圖6 miR-191與DAB2結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測和驗(yàn)證

2.7 下調(diào)DAB2表達(dá)對CHG-5細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響

與siRNA NC 組相比，DAB2 siRNA 組CHG-5 細(xì)胞增殖活力升高（P＜0.05），見圖7a。Western blot結(jié)果顯示，下調(diào)DAB2 后，E-cadherin 表達(dá)降低（P＜0.05)，N-cadherin 表達(dá)升高（P＜0.05），見圖7b。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表示，與siRNA NC 相比，DAB2 siRNA 組CHG-5細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），見圖7c。

圖7 下調(diào)DAB2表達(dá)對CHG-5細(xì)胞增殖、凋亡及EMT的影響

2.8 上調(diào)circTRIM33-12 靶向miR-191 對DAB2 表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，pcDNA-TRIM33-12+mimics NC 組中DAB2 表達(dá)明顯高于pcDNA+mimics NC 組(P＜0.01)，表明circTRIM33-12 與DAB2 存在正調(diào)控關(guān)系。與pcDNA+mimics NC 組比較，pcDNA+miR-191 mimics 組DAB2 表達(dá)降低(P＜0.01)，表明miR-191 與DAB2 存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。pcDNA-TRIM33-12+miR-191 mimics 組中DAB2 表達(dá)明顯高于pcDNA+miR-191 mimics 組(P＜0.01)，表明circTRIM33-12 能夠通過miR-191調(diào)控DAB2表達(dá)，見圖8。

圖8 RT-qPCR檢測circTRIM33-12靶向miR-191對DAB2表達(dá)的影響

3 討論

目前，circRNA 在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的作用已引起廣泛關(guān)注。有研究報道，circMTO1是肝癌細(xì)胞中通過miR-9發(fā)揮作用的腫瘤相關(guān)分子[14]；circBCBM1 通過調(diào)控miR-125a/BRD4 軸促進(jìn)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[15]；circDLGAP4通過調(diào)控microRNA-143/CDK1 軸參與肺癌的發(fā)展[16]。因此，circRNA 可能作為具有特異性的生物標(biāo)志物用于癌癥的臨床診斷。為了研究circTRIM33-12 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)和生物學(xué)功能，本研究采用RT-qPCR 檢測腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中circTRIM33-12 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，circTRIM33-12在CHG-5 細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低。circTRIM33-12 的異常表達(dá)提示該分子可能參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展。研究表明，EMT 參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，在癌細(xì)胞EMT過程中，E-cadherin 和β-catenin 表達(dá)降低[17]，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin 及fibronectin 表達(dá)增高[18]。因此，可以通過檢測EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)來反映腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，circTRIM33-12能夠促進(jìn)CHG-5 細(xì)胞增殖和EMT，抑制細(xì)胞凋亡，提示circTRIM33-12 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。Zhang 等[11]的研究表明，circTRIM33-12 在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮了明顯的抑癌作用，本研究結(jié)果與之一致，且本研究揭示了circTRIM33-12在腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入了解腦膠質(zhì)瘤的致病機(jī)理提供了新的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-191 能夠識別circTRIM33-12 并與之結(jié)合，但不會促進(jìn)circTRIM33-12 的降解。miR-191 是一種癌基因，在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控乳腺癌發(fā)展[19]；同時，miR-191 可通過TET1 介導(dǎo)的APC 表觀遺傳調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長[20]；另外，miR-191 還與宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，miR-191 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5 中發(fā)揮了明顯的癌基因功能；Xue 等[9]研究表明，miR-191 通過直接靶向NDST1 在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮癌基因的作用，本研究結(jié)果與之相符，進(jìn)一步證實(shí)了miR-191 在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的關(guān)鍵作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circTRIM33-12 通過下調(diào)miR-191 表達(dá)抑制CHG-5 細(xì)胞的增殖和EMT，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步表明circTRIM33-12 對CHG-5 細(xì)胞增殖、凋亡及EMT 的調(diào)控作用是通過其作用靶點(diǎn)miR-191實(shí)現(xiàn)的。有研究表明，miR-191 在癌細(xì)胞中可能通過mRNA 發(fā)揮作用，如miR-191 通過靶向DICER1 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[22]。miR-19a-3p 通過PTEN 調(diào)節(jié)人胃癌細(xì)胞增殖水平[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，DAB2 3'UTR 與miR-191 特異性結(jié)合，且DAB2 在CHG-5 細(xì)胞中表達(dá)降低。DAB2 又稱DOC2，是卵巢癌中的抑癌基因。越來越多的證據(jù)表明，DAB2 在結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌、食管鱗狀癌和乳腺癌中亦表達(dá)下調(diào)[12，24-25]。如DAB2 在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤組織分化及細(xì)胞增殖遷移有關(guān)[26]。DAB2 通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 和Hippo-YAP信號通路抑制胃癌細(xì)胞遷移[27]。然而，目前DAB2 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能還尚不明確。本研究結(jié)果表明，下調(diào)DAB2 顯著提高了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG-5 的細(xì)胞活力，抑制了癌細(xì)胞凋亡。同時，circTRIM33-12 能夠通過miR-191 調(diào)控DAB2 表達(dá)。本研究中DAB2 在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮的抑癌作用與其在前列腺癌、膀胱癌等腫瘤中發(fā)揮的作用一致，進(jìn)一步豐富了DAB2 的生物學(xué)功能，為腦膠質(zhì)瘤患者提供了一個潛在的診斷生物標(biāo)志物，也為改善腦膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)。

綜上，本研究揭示了circTRIM33-12在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中通過miR-191/DAB2 軸調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和EMT。