劉文東,張嘉麟,余紫丹 （. 惠州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 惠州 5600；. 惠州市第三人民醫(yī)院康復(fù)中心，廣東 惠州 5600）

膽管癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，治療后易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者5年生存率低于30%，因而探究膽管癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因?qū)τ诟纳苹颊哳A(yù)后至關(guān)重要[1-2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在膽管癌中表達(dá)異常，以微小RNA（microRNA,miRNA）的分子海綿對膽管瘤細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控[3-4]。研究顯示，lncRNA MIR4435-2HG（以下簡稱MIR4435-2HG）在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并可通過激活Wnt/β-catenin 通路，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移[5]。但MIR4435-2HG對膽管癌的影響尚不清楚。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，MIR4435-2HG與miR-376a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-376a-3p 在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，且miR-376a-3p低表達(dá)可通過上調(diào)KLF15 表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[6]。但MIR4435-2HG/miR-376a-3p 軸在膽管癌進(jìn)展過程中的作用尚不明確。故本研究就MIR4435-2HG是否可靶向調(diào)控miR-376a-3p 調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲展開探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpic 與人膽管癌細(xì)胞RBE 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；反轉(zhuǎn)錄試劑、qRT-PCR試劑與Lipofectamine 2000 購自美國Thermo Fisher；si-MIR4435-2HG（UGCUAGCUAUCGACGGU）及其陰性對照si-NC（AGUCAUCGUAGCU）、anti-miR-376a-3p（AUCGAUGCUAUCGAU）及其陰性對照anti-miR-NC（CGGUAGUUGAUCAAA）、miR-376a-3p mimics（ACG UCUAGUAUCUCCC）及其陰性對照miR-NC（GCG CUAGACAUCGUA）購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；Matrigel基質(zhì)膠、MTT、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen；兔抗人細(xì)胞周期蛋白CyclinD1，MMP-2、MMP-9 抗體與二抗購自美國Santa Cruz；Transwell小室購自美國Corning。

1.2 細(xì)胞分組

將HIBEpic 細(xì)胞和RBE 細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)期RBE 細(xì)胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板，用不含血清的培養(yǎng)基分別稀釋si-NC、si-MIR4435-2HG、miR-NC、miR-376a-3p mimics、si-MIR4435-2HG聯(lián)合anti-miR-NC、si-MIR4435-2HG 聯(lián)合anti-miR-376a-3p 后室溫孵育5 min（A 液），用不含血清的培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑充分混合（B 液），A 液與B 液充分混勻，室溫孵育20 min 后加入6 孔板的RBE 細(xì)胞中，設(shè)為si-NC 組、si-MIR4435-2HG 組、miR-NC 組、miR-376a-3p 組、si-MIR4435-2HG+antimiR-NC 組、si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p 組，6 h后替換為完全培養(yǎng)基，2 d 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將未轉(zhuǎn)染的RBE細(xì)胞作為NC組。

1.3 qRT-PCR檢測MIR4435-2HG、miR-376a-3p表達(dá)

采用Trizol 試劑提取HIBEpic 和RBE 細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板行qRT-PCR。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，快速逆轉(zhuǎn)錄試劑混合液10 μL，正反引物各1 μL，加RNase-free 雙蒸水至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。MIR4435-2HG 正向引物5'-GGAAGTGGTGGCTATGAGTCAG-3'，反向引物5'-TGTCAATTTGAAACTTAAAAAGCAG-3'；miR-376a-3p 正向引物5'-CCCAGGAGGACTGAAGCAACAA-3'，反向引物5'-GCTATCTCAGGGCTTGTTGCTTC-3'；U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AGGGGATCCACAGTCTTC-3'；β-actin 正向引物5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，反向引物5'-TGC TGTCACCTTCACCGTTC-3'。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析MIR4435-2HG、miR-376a-3p的表達(dá)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

取每組RBE 細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于96 孔板，各孔均加MTT 溶液20 μL，于37 ℃培養(yǎng)4 h，各孔加細(xì)胞冷凍液150 μL，振蕩混勻后孵育10～15 min，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔吸光度（A值）。

1.5 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力

取每組RBE 細(xì)胞（約5×104個(gè)）接種于小室上室（侵襲實(shí)驗(yàn)前5 h 加入Matrigel 基質(zhì)膠稀釋液40 μL），下室為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 d 后棄培養(yǎng)基，除去未遷移及侵襲的細(xì)胞，甲醇固定遷移及侵襲細(xì)胞20 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

取每組RBE 細(xì)胞（約5×106/mL），經(jīng)800 r/min 離心5 min，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS 清洗2 次，去除PBS 后加1×Binding Buffer 緩沖液100 μL，于冰上預(yù)冷，重懸后加Annexin V-FITC 染色液5 μL 與PI 5 μL，避光孵育10 min，上機(jī)前再加入1×Binding Buffer緩沖液400 μL，充分混勻后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MIR4435-2HG 與miR-376a-3p的靶向關(guān)系

采用Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測MIR4435-2HG 與miR-376a-3p 的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建MIR4435-2HG 野生型載體（WT-MIR4435-2HG），并將MIR4435-2HG 和miR-376a-3p 互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)突變構(gòu)建MIR4435-2HG 突變型載體（MUT-MIR4435-2HG），用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定其靶向關(guān)系。 將WT-MIR4435-2HG、MUTMIR4435-2HG 分別與miR-376a-3p mimics 或miR-NC共轉(zhuǎn)染至RBE 細(xì)胞后培養(yǎng)2 d，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。此外，將MIR4435-2HG 過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-MIR4435-2HG）及其陰性對照（pcDNA-NC）、si-MIR4435-2HG、si-NC 分別轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞，分別記為pcDNA-MIR4435-2HG組、pcDNA-NC組、si-MIR4435-2HG組和si-NC組。轉(zhuǎn)染2 d后收集細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測MIR4435-2HG、miR-376a-3p表達(dá)。

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

采用RIPA 裂解液提取各組RBE 細(xì)胞總蛋白，測定總蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液（每40 μL蛋白樣品加入10 μL 上樣緩沖液）煮沸變性。分別配制分離膠與濃縮膠后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（ 40 V/5 h），當(dāng)染料進(jìn)入玻璃板的底部后停止電泳，在冰上轉(zhuǎn)移至PVDF膜（100 V），然后于封閉液中封閉2 h。將PVDF膜與CyclinD1、MMP-2、MMP-9、β-actin 的一抗（均以1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育24 h，隨后加入二抗反應(yīng)液（1∶4 000 稀釋），37 ℃震蕩孵育1 h，ECL 顯色后采用Image J軟件分析CyclinD1、MMP-2、MMP-9灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，2 組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIR4435-2HG和miR-376a-3p的表達(dá)量

人膽管癌細(xì)胞系RBE 中MIR4435-2HG 的表達(dá)量高于人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpic（P＜0.001），而miR-376a-3p 的表達(dá)量低于HIBEpic 細(xì)胞（P＜0.001），見表1。

表1 各細(xì)胞系中miR-376a-3p和MIR4435-2HG表達(dá)量（x-±s）

2.2 低表達(dá)MIR4435-2HG對RBE細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

si-MIR4435-2HG 組MIR4435-2HG 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)低/少于si-NC 組（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平低于si-NC 組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率高于si-NC 組（P＜0.05），見圖1。

圖1 低表達(dá)MIR4435-2HG對RBE細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2.3 高表達(dá)miR-376a-3p 對RBE 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

miR-376a-3p 組細(xì)胞活力、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)低/少于miR-NC組（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平低于miR-NC 組（P＜0.05），miR-376a-3p 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組（P＜0.05），見圖2。

圖2 高表達(dá)miR-376a-3p對RBE膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2.4 MIR4435-2HG靶向調(diào)控miR-376a-3p表達(dá)

MIR4435-2HG 和miR-376a-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3a。轉(zhuǎn)染miR-376a-3p mimics 可降低WT-MIR4435-2HG 的熒光素酶活性（P＜0.05），而未能抑制MUTMIR4435-2HG 的熒光素酶活性，見圖3b。pcDNAMIR4435-2HG 組MIR4435-2HG 表達(dá)量高于pcDNANC 組，miR-376a-3p 的表達(dá)量低于pcDNA-NC 組（P＜0.05）；si-MIR4435-2HG 組MIR4435-2HG 表達(dá)量低于si-NC 組，miR-376a-3p 的表達(dá)量高于si-NC 組（P＜0.05），見圖3c。

圖3 MIR4435-2HG靶向調(diào)控miR-376a-3p表達(dá)

2.5 敲低miR-376a-3p 逆轉(zhuǎn)沉默MIR4435-2HG 對RBE細(xì)胞的影響

與si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC 組比較，si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p 組細(xì)胞活力、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)升高/增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（P＜0.05），miR-376a-3p 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖4。

3 討論

lncRNA 可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及侵襲等過程，既往研究顯示，lncRNA 在膽管癌的形成及轉(zhuǎn)移中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，如lncRNA TUG1 通過抑制miR-29a 促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[7]；lncRNA MEG3 可抑制膽管癌細(xì)胞增殖和侵襲[8]；lncRNA LINC01061 可充當(dāng)miR-612 的競爭性內(nèi)源性RNA 調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向因子4D從而促進(jìn)膽管癌的發(fā)生及發(fā)展[9]；敲低lncRNA SNHG20 可通過上調(diào)miR-520f-3p 抑制膽管癌細(xì)胞增殖[10]；lncRNA FENDRR 低表達(dá)可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性[11]。但lncRNA/miRNA/mRNA 分子軸在膽管癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明[12]。

MIR4435-2HG 在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，并可通過調(diào)控miR-513a-5p/KLF6 軸促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[13]。MIR4435-2HG 可通過miR-128-3p/CDK14 軸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，敲除MIR4435-2HG 可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移[14]。但MIR4435-2HG 在膽管癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，MIR4435-2HG 在膽管癌細(xì)胞中表達(dá)升高，敲低MIR4435-2HG 可明顯降低膽管癌細(xì)胞活力，并可抑制CyclinD1 的表達(dá)。研究表明，CyclinD1 可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期，細(xì)胞周期失控后可進(jìn)入無限增殖分化狀態(tài)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15]。細(xì)胞外基質(zhì)的異常降解與癌細(xì)胞遷移密切相關(guān)，高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9 可加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而提高癌細(xì)胞遷移能力[16-18]。本研究敲低MIR4435-2HG后RBE 細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)減少，MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，提示敲低MIR4435-2HG可抑制RBE細(xì)胞遷移及侵襲，促進(jìn)RBE細(xì)胞凋亡。

為探究敲低MIR4435-2HG 調(diào)控RBE 細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RBE 細(xì)胞中MIR4435-2HG 可與miR-376a-3p 靶向結(jié)合并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)。Shen 等[19]研究表明，lncRNA TTN-AS1可通過抑制miR-376a-3p 的表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-376a-3p表達(dá)減少可能與骨肉瘤進(jìn)展有關(guān)，miR-376a 可通過對SATB1 的直接靶向調(diào)控，顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲。本研究檢測到RBE 細(xì)胞中的miR-376a-3p 表達(dá)降低，其高表達(dá)能夠抑制RBE 細(xì)胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制miR-376a-3p 表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)敲低MIR4435-2HG 對RBE細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。

綜上，敲低MIR4435-2HG可通過上調(diào)miR-376a-3p而抑制RBE 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可促進(jìn)其凋亡，MIR4435-2HG/miR-376a-3p 軸在膽管癌形成及發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用，MIR4435-2HG 可能作為膽管癌的潛在分子治療靶點(diǎn)。但MIR4435-2HG/miR-376a-3p軸在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。