張 錚,韓佳雯,彭龍龍,聶 濤,鄒三明,張宇博 （.武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，湖北 孝感 4300；.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065）

成骨細(xì)胞的骨形成活性是維持骨骼健康最重要的合成代謝過程[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞譜系的分化功能障礙及成骨細(xì)胞的活力受損將引起多種代謝性骨病，如骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎等[2]。轉(zhuǎn)錄因子Runx2在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的濃度高低將影響其向成骨細(xì)胞分化的方向[3]。研究顯示，Runx2所在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)的變化受表觀遺傳學(xué)調(diào)控[4]。

DNA 甲基化和去甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制之一。其中CpG 島DNA 甲基化是通過招募抑制基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子或通過染色質(zhì)高度凝集阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA 的結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。而DNA 甲基胞嘧啶雙加氧酶1（tet methylcytosine dioxygenase 1，TET1）可識(shí)別并與CpG 島結(jié)合，啟動(dòng)DNA 去甲基化程序，從而維持基因組甲基化穩(wěn)態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)表觀遺傳學(xué)的動(dòng)態(tài)調(diào)控[5]。

研究顯示，白藜蘆醇、蘿卜硫素（sulforaphane，Sul）和花青素等多種天然化合物能夠改善骨骼健康指數(shù)[6]，且已被證明能夠增加成骨細(xì)胞的新骨形成，特別是Sul[7]。然而，關(guān)于Sul 的骨保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)探討Sul 促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）向成骨分化是否通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)，以期深入了解Sul 的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

BMSCs 購自武漢普諾賽生物技術(shù)有限公司。人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2；批號(hào)：023J5430）購自美國Sigma Aldrich 公司。Protein A/G-agarose beads（批號(hào)：YD360327）、甲基化敏感限制性內(nèi)切酶HpaⅡ酶（批號(hào)：2642215）、甲基化非敏感限制性內(nèi)切酶MspⅠ酶（批號(hào)：2658767）購自美國Thermo Fisher 公司。兔抗小鼠Runx2（批號(hào)：236639）、GAPDH（批號(hào)：824500）、TET1（批號(hào)：191698）、TET2（批號(hào)：213369）、TET3（批號(hào)：231785）、IgG（批號(hào)：172730）單抗，兔抗小鼠Histone H3 多抗（批號(hào)：179101）購自美國Abcam 公司。HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)：YH00010456）購自上海研卉生物。Bioruptor水浴超聲儀購自美國Diagenode公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)小鼠BMSCs 向成骨細(xì)胞分化 誘導(dǎo)組：向6 孔板中每孔加入0.1%無菌明膠1 mL，室溫下包被30 min。然后棄明膠，以5×103/孔接種BMSCs，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為60%～70%時(shí)，開始誘導(dǎo)向成骨分化。加入含300 ng/mL BMP2的完全DMEM 培養(yǎng)液，每2 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)1周后，收集部分細(xì)胞進(jìn)行下游染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）實(shí)驗(yàn)和甲基化敏感限制性內(nèi)切酶相關(guān)指標(biāo)的測定；其余細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2 周后進(jìn)行茜素紅染色、qPCR、Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理方式 對(duì)照組：BMSCs 不做任何處理，僅單純維持培養(yǎng)；誘導(dǎo)組：誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化，連續(xù)培養(yǎng)1 周；誘導(dǎo)+Sul 組：成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入40 μmol/L Sul，連續(xù)培養(yǎng)1 周[7]。shRNAMock 組、shRNA-TET1 組、shRNA-TET2 組、shRNATET3 組：分別向BMSCs 轉(zhuǎn)染腺病毒-shRNA-Mock、-shRNA-TET1、-shRNA-TET2、-shRNA-TET3。使用腺病毒載體pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。shRNA-Mock（5'-3'）：GACAGAGCATATGAGATACTA；shRNA-TET1（5'-3'）:TTTCCTACTCTGTAGCTATGT；shRNA-TET2（5'-3'）：GGAAAAAGCACTCTGAATGGT；shRNA-TET3（5'-3'）：GGGCCGTGGGGACAAGGAGCG。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照各組要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，隨后進(jìn)行下游指標(biāo)的測定。誘導(dǎo)+Sul+shRNA-TET1組、誘導(dǎo)+Sul+shRNA-TET2組、誘導(dǎo)+Sul+shRNA-TET3組、誘導(dǎo)+Sul+shRNA-Mock 組：BMSCs 于含成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液+40 μmol/L Sul的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)染腺病 毒 -shRNA-TET1、-shRNA-TET2、-shRNA-TET3、-shRNA-Mock，連續(xù)培養(yǎng)1周。

1.2.3 qPCR 向6 孔板每孔細(xì)胞中加入1 mL TRIzol 裂解液裂解細(xì)胞。使用RNA Easy Fast 動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA 提取試劑盒提取總RNA。使用Fast-King cDNA 第一鏈合成試劑盒（去基因組）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Fast Fire 快速熒光定量PCR 預(yù)混試劑（SYBRGreen）進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。qPCR特異性引物為Runx2 F-Primer（5'-3'）為CGCCTCACAAACAACCACAG，Runx2 R-Primer（5'-3'）為TCACTGTGCTGAAGAGGCTG；GAPDH F-Primer（5'-3'）為CCTGCGGTAGAGCGGCCG，GAPDH R-Primer（5'-3'）為CTCCACCCATCGAGGCAGGA。qPCR 擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法對(duì)靶基因進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.4 Western blot 向6 孔板每孔細(xì)胞中加入含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。每個(gè)樣本取10 μg 進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。采用半干轉(zhuǎn)印法（4 ℃，100 mA 恒流，轉(zhuǎn)印2 h）將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。使用含有5% BSA 的TBS-T 緩沖液，在室溫下封閉PVDF 膜1 h。向膜上滴加一抗工作液，在4 ℃下使其與膜共同孵育過夜。次日，向膜上滴加二抗工作液，在室溫下使其與膜共同孵育1 h。Runx2抗體（1∶1 500 稀釋）、TET1 抗體（1∶2 000 稀釋）、TET2抗體（1∶1 000 稀釋）、TET3 抗體（1∶1 000 稀釋）、GAPDH 抗體（1∶1 500 稀釋）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶6 000 稀釋）。然后滴加ECL 化學(xué)發(fā)光底物，對(duì)目的條帶進(jìn)行顯影。使用Image J v1.8.0 軟件分析并定量條帶灰度值。

1.2.5 ChIP 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞于室溫培養(yǎng)，使用含1%甲醛的PBS 孵育10 min 進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。然后加入10×甘氨酸溶液（1.25 mol/L）終止。交聯(lián)后的細(xì)胞重懸于5 倍體積的細(xì)胞裂解緩沖液中，并使用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)化處理。收集細(xì)胞提取物，以3 000 r/min 離心5 min，重懸沉淀于500 μL 超聲緩沖液中，在Bioruptor 水浴超聲儀高功率下超聲處理5 min×3 次，獲得200～500 bp DNA 片段。于4 ℃以12 500 r/min 離心15 min，收集上清液，為交聯(lián)染色質(zhì)提取物。

免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）：取25 μg 交聯(lián)染色質(zhì)提取物，加入2 μg IgG 和50 μL Protein A/G-agarose beads，于4 ℃共同孵育1 h。然后4 000 r/min離心5 min，收集染色質(zhì)，而上清液則于4 ℃與兔抗小鼠Histone H3 特異性抗體或IgG（Isotype control）孵育過夜，為免疫沉淀復(fù)合物。隨后，添加Protein A/G-agarose beads，并于4 ℃孵育1 h 以復(fù)蘇免疫沉淀復(fù)合物。然后加入洗脫緩沖液，于65 ℃孵育15 min。以12 500 r/min 離心5 min，收集上清液。采用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，從樣品中回收DNA。通過qPCR 法相對(duì)定量免疫沉淀的Runx2 啟動(dòng)子區(qū)（-118～+59，片段大小178 bp）DNA 的水平，并計(jì)算“標(biāo)準(zhǔn)化處理后的富集度”。相對(duì)定量免疫沉淀的靶基因DNA 水平計(jì)算方法：以IP 開始時(shí)加入的交聯(lián)染色質(zhì)提取物的含量作為分母（25 μg）（Input）進(jìn)行百分比（%）計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的富集度計(jì)算方法：以未經(jīng)任何實(shí)驗(yàn)處理的對(duì)照組細(xì)胞ChIP 實(shí)驗(yàn)獲得的DNA 定量數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)組DNA 定量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。Runx2 啟動(dòng)子區(qū)qPCR 特異性引物序列：Runx2-F Primer（5'-3'）為CCAGCTCATTATTGTAGTATT，Runx2-R Primer（5'-3'）為GCTACGAATCTCTAATCTTAA。

1.2.6 甲基化敏感限制性內(nèi)切酶分析Runx2 啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài) 提取各組細(xì)胞基因組DNA。將每管基因組DNA 分成2 份，每份5 μg，分別加入20 U的HpaⅡ酶或MspⅠ酶，在37 ℃恒溫水浴中消化2 h。消化結(jié)束后，每個(gè)樣本取200 ng DNA，對(duì)Runx2啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。通過1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測qPCR擴(kuò)增后的片段大小和相對(duì)濃度。

1.2.7 茜素紅染色 使用4%多聚甲醛于4 ℃固定細(xì)胞培養(yǎng)物30 min 后，向細(xì)胞樣品中加入0.2%茜素紅染色液，室溫染色5 min。PBS洗滌2次，去除多余染色液。光學(xué)顯微鏡下鏡檢、拍照。使用Image Pro Plus 6.0 軟件對(duì)各組進(jìn)行細(xì)胞茜素紅染色紅光像素值分析，計(jì)算相對(duì)定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism v8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間差異分析采用t檢驗(yàn)；多組間差異分析采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用事后Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sul 上調(diào)BMSCs 內(nèi)成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)

qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05）；與誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)+Sul 組Runx2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05），見圖1。

圖1 BMSCs內(nèi)成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達(dá)水平

2.2 BMSCs 向成骨細(xì)胞分化后Runx2 啟動(dòng)子區(qū)去甲基化水平

ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用抗IgG 抗體，所有分組下拉的Runx2 DNA 含量在Input的總DNA 中所占相對(duì)百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而使用抗Histone H3 抗體，與誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)+Sul 組上述指標(biāo)明顯升高（P＜0.05），見圖2a。經(jīng)HpaⅡ酶消化后，與誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)+Sul 組Runx2 啟動(dòng)子區(qū)DNA 含量明顯降低（P＜0.05）；經(jīng)MspⅠ酶消化后，對(duì)照組、誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)+Sul組Runx2啟動(dòng)子區(qū)DNA均被完全消化，見圖2b。

圖2 BMSCs向成骨細(xì)胞分化后Runx2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平

2.3 Sul通過TET1上調(diào)Runx2 DNA去甲基化

Western blot 結(jié)果顯示，與shRNA-Mock 組相比，shRNA-TET 組TET1、TET2 和TET3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖3a。ChIP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用抗Histone H3 抗體進(jìn)行免疫共沉淀后，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)+Sul 組下拉的Runx2 DNA 含量在Input 中所占相對(duì)百分比明顯升高（P＜0.05）；與誘導(dǎo)+Sul 組相比，僅誘導(dǎo)+Sul+shRNA-TET1 組上述指標(biāo)明顯降低（P＜0.05），見圖3b。經(jīng)HpaⅡ酶消化后，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)+Sul組Runx2 啟動(dòng)子區(qū)DNA 含量降低（P＜0.05）；與誘導(dǎo)+Sul 組相比，誘導(dǎo)+Sul+shRNA-TET1 組上述指標(biāo)升高（P＜0.05）；經(jīng)MspⅠ酶消化后，所有分組Runx2啟動(dòng)子區(qū)DNA均被完全消化，見圖3c、d。

圖3 TET1、TET2、TET3對(duì)Sul促進(jìn)Runx2 DNA去甲基化的影響

2.4 敲低TET1抑制Sul促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化

茜素紅染色結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)+Sul組茜素紅染色評(píng)分明顯上升（P＜0.05）；與誘導(dǎo)+Sul 組相比，誘導(dǎo)+Sul+shRNA-TET1 組茜素紅染色評(píng)分明顯降低（P＜0.05），而誘導(dǎo)+Sul+shRNA-Mock 組茜素紅染色評(píng)分無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 BMSCs向成骨細(xì)胞分化的水平測定

3 討論

Sul在癌癥領(lǐng)域已被廣泛研究，是一種安全、無毒、副作用小，且具有抗癌和抗氧化活性的天然化合物。核因子E2-相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種響應(yīng)氧化應(yīng)激而被激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示，Sul 能通過激活Nrf2，上調(diào)一系列細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期和血管生成，發(fā)揮抗癌作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sul 上調(diào)BMSCs 內(nèi)成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2 的表達(dá)。Runx2是骨形成和成骨細(xì)胞分化所必需的特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過直接調(diào)控hedgehog 基因產(chǎn)物、成纖維細(xì)胞生長因子、Wnt等信號(hào)通路來促進(jìn)成骨祖細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)化[9]。在BMSCs 向成骨細(xì)胞分化過程中，Runx2 甲基化水平降低[10]。而本研究結(jié)果顯示，BMSCs 向成骨細(xì)胞分化后Runx2 啟動(dòng)子區(qū)去甲基化水平升高，Sul則增強(qiáng)了這一過程。這說明了Sul促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞的分化。

DNA 甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制之一，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。DNA 甲基化是基因活性或功能的一種可遺傳變化，不改變DNA 序列。CpG 島DNA 甲基化可抑制基因的表達(dá)。DNA 去甲基化的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，分為主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化。主動(dòng)的DNA 去甲基化是指通過酶促作用從5mC中去除或修飾甲基的過程[5]。TET1是一種5-甲基胞嘧啶羥化酶，屬于人α-酮戊二酸加氧酶中的TET 蛋白家族。TET1 識(shí)別并結(jié)合CpG 島等DNA 區(qū)域，啟動(dòng)DNA去甲基化程序，在維持基因組甲基化動(dòng)態(tài)變化和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。其異常表達(dá)和/或功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、衰老相關(guān)慢性疾病等多種病理生理過程密切相關(guān)[11]。既往研究顯示，TET1 參與多種骨相關(guān)疾病的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。在骨癌慢性疼痛的病理機(jī)制中，骨癌組織TET1 表達(dá)上調(diào)，并通過啟動(dòng)子區(qū)去甲基化促進(jìn)瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族V 成員TRPV4 的表達(dá)而介導(dǎo)大鼠骨癌痛感，敲低TET1/TRPV4 軸可降低骨癌模型大鼠的痛感評(píng)分[12]。TET1基因拷貝數(shù)損失引起的DNA 去甲基化修飾能力受損參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。而且TET1 還在干細(xì)胞干性的自我維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。TET1 和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3A/B在胞內(nèi)具有互相拮抗和協(xié)同作用，共同維持人類胚胎干細(xì)胞基因調(diào)控區(qū)甲基化水平穩(wěn)態(tài)和正常的基因表達(dá)調(diào)控功能[15]。因此，TET1 對(duì)于干細(xì)胞功能的維持至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，Sul提高Runx2的去甲基化水平是通過TET1實(shí)現(xiàn)的。

既往關(guān)于Sul 的表觀遺傳學(xué)調(diào)控活性的研究，主要專注于癌癥領(lǐng)域。而本研究證實(shí)了Sul 的另一個(gè)表觀遺傳學(xué)作用靶點(diǎn)——TET1。本研究敲低TET1 后，Sul 無法促進(jìn)Runx2 的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)；且敲低TET1 后，Sul 處理的BMSCs 定向成骨分化的茜素紅染色評(píng)分明顯降低，說明TET1 的表達(dá)下調(diào)阻斷了Sul 促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞的定向分化。這對(duì)于Sul 促進(jìn)成骨分化的分子機(jī)制研究是一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)，即Sul 能夠通過TET1 上調(diào)Runx2 的表觀遺傳學(xué)表達(dá)，達(dá)到促成骨分化的目的[15-16]。

本研究初步證實(shí)了Sul能夠通過TET1 促進(jìn)Runx2啟動(dòng)子區(qū)DNA 去甲基化，促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。但本研究尚未深入探索Sul 與TET1 的作用方式是直接還是間接？如果是直接的相互作用，那么又是Sul分子中的哪些基團(tuán)與TET1結(jié)合？這將是我們下一步要重點(diǎn)關(guān)注和研究的領(lǐng)域。