史春輝,藺建平,吳 超 （. 寶雞市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，陜西 寶雞 7000；. 寶雞市中醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 寶雞 7000；. 西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 70000）

肺癌是全球癌癥死亡的最常見原因，預(yù)計到2050年，全球癌癥發(fā)生率將翻倍，而肺癌居首位[1-2]，其總體發(fā)病率、病死率均居我國惡性腫瘤首位，故肺癌的早期診斷至關(guān)重要[3]。 環(huán)狀RNAs（circular RNAs,circRNAs）包含一類具有共價閉合單鏈環(huán)構(gòu)象的調(diào)節(jié)RNA，由外顯子5～7 的前體mRNA 反向剪接產(chǎn)生[4]。circRNAs 參與多種生物學(xué)過程，如自身免疫性疾病、大腦發(fā)育等[5]。circRNAs 的作用已在各種類型的癌癥中證實，因此其可能是潛在的治療靶點或生物標(biāo)志物，而circDCUN1D4 作為circRNAs 中的一員，在癌癥中的作用少見報道[6]。微小RNA（microRNA,miRNA）主要通過與mRNA 的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合進而誘導(dǎo)mRNA 降解或抑制翻譯[7]。miR-18a-5p 在卵巢癌等癌癥中異常表達，且研究顯示，果糖-1,6-二磷酸酶1（fructose-1,6-bisphosphatase 1,FBP1）為miR-18a-5p 的下游靶基因，但miR-18a-5p 能否通過調(diào)節(jié)FBP1 表達在肺癌中發(fā)揮作用尚不清楚[8]。因此，本研究探討circDCUN1D4 調(diào)節(jié)miR-18a-5p/FBP1 軸對肺癌細胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影響，以期為肺癌的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

人肺癌細胞系（H1975、H1650、A549 和SPCA-1）和人正常肺表皮細胞系HPL-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑、儀器

circDCUN1D4 過表達質(zhì)粒（circDCUN1D4）及過表達質(zhì)粒陰性對照（NC）購自上海漢恒生物科技有限公司；miR-18a-5p 模擬物陰性對照（mimics NC）、miR-18a-5p 模擬物（miR-18a-5p mimics）購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol 試劑購自上海生工生物科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix 檢測試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自日本Takara Biotech公司；CCK-8測定試劑盒購自日本Dojindo 公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD Pharmingen公司；雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega 公司；Invitrogen LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Life Technologies公司；RIPA 裂解緩沖液購自江蘇康為世紀(jì)生物公司；FBP1、caspase-3、Ki67、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）及程序性死亡分子配體-1（programmed death-ligand 1, PD-L1）一抗購自英國Abcam公司。

FLx8 多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek 公司；MoFlo XDP流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染

H1975、H1650、A549、HPL-1、SPCA-1 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)胰蛋白酶消化后，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的A549 細胞，采用Invitrogen LipofectamineTM2000 進行轉(zhuǎn)染，然后分為空白組（不轉(zhuǎn)染）、NC 組（轉(zhuǎn)染NC）、circDCUN1D4 組（轉(zhuǎn)染circDCUN1D4）、circDCUN1D4+mimics NC 組（共轉(zhuǎn)染circDCUN1D4 和mimics NC）、circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics 組（共轉(zhuǎn)染circDCUN1D4 和miR-18a-5p mimics），轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞用于后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR 檢測circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA表達水平

使用TRIzol 試劑分離總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix 試劑盒對circRNA、miRNA、mRNA 進行定量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進行qRT-PCR。使用ABI 7500 qPCR 儀檢測circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA 表達，其中circDCUN1D4、FBP1 mRNA 以GAPDH 為內(nèi)參；miR-18a-5p以U6為內(nèi)參，均采用2-ΔΔCt法進行計算。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8法檢測細胞活力

將各組細胞接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，然后與10 μL CCK-8 共孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測0 h、24 h、48 h時450 nm波長處的OD值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平

細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細胞，并與PI、Annexin VFITC 室溫避光孵育20 min。然后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 驗證miR-18a-5p 分別與circDCUN1D4、FBP1 的靶向關(guān)系

通過Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-18a-5p 分別與circDCUN1D4、FBP1的結(jié)合位點。細胞接種于96孔板中，將構(gòu)建的circDCUN1D4、FBP1 野生（WT）及突變（MUT）報告質(zhì)粒分別與miR-18a-5p mimics 或mimics NC共轉(zhuǎn)染到A549細胞中，48 h后檢測熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

收集細胞，并在預(yù)冷的細胞裂解緩沖液中裂解，然后在4 ℃下以13 000 r/min 離心10 min。取上清液進行BCA 蛋白定量。將上樣緩沖液添加到等量的蛋白樣品中并煮沸5 min。樣品于 SDS-PAGE 進行凝膠電泳分離（120 mV），隨后用半干法進行電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h，然后與FBP1（1∶1 000）、caspase-3（1∶1 000）、Ki67（1∶2 000）、PCNA（1∶1 000）、PD-L1（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，室溫下與二抗（1∶2 000）孵育1 h。通過電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)對蛋白條帶進行可視化，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件測量灰度值以評估蛋白相對表達。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA表達水平

與人正常肺表皮細胞HPL-1 相比，人肺癌細胞系（H1975、H1650、A549、SPCA-1）中circDCUN1D4、FBP1表達顯著降低（P＜0.05），miR-18a-5p 表達顯著增加（P＜0.05），其中A549 細胞差異最顯著，故選擇其進行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 各細胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA 表達水平比較

2.2 各組A549 細胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1表達水平

與空白組、NC 組相比，circDCUN1D4 組細胞中circDCUN1D4、FBP1表達顯著增加（P＜0.05），miR-18a-5p表達顯著降低（P＜0.05）；與circDCUN1D4+mimics NC組相比，circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics 組細胞中circDCUN1D4、FBP1表達顯著降低（P＜0.05），miR-18a-5p表達顯著增加（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組A549 細胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 表達水平比較

2.3 各組A549細胞的增殖活性

與空白組、NC組相比，circDCUN1D4組細胞中24 h、48 h 的OD 值顯著降低（P＜0.05）；與circDCUN1D4+mimics NC 組相比，circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics組細胞中24 h、48 h 的OD 值顯著增加（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組A549細胞在0 h、24 h、48 h的OD值比較

2.4 各組A549細胞的凋亡情況

與空白組、NC 組相比，circDCUN1D4 組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與circDCUN1D4+mimics NC 組相比，circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics 組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細胞凋亡變化

2.5 miR-18a-5p與circDCUN1D4的靶向關(guān)系

miR-18a-5p與circDCUN1D4存在結(jié)合位點，見圖5a。與mimics NC+circDCUN1D4 WT 組相比，miR-18a-5p mimics+circDCUN1D4 WT 組細胞相對熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與mimics NC+circDCUN1D4 MUT 組相比，miR-18a-5p mimics+circDCUN1D4 MUT 組細胞相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5b。

圖5 miR-18a-5p與circDCUN1D4的靶向關(guān)系

2.6 miR-18a-5p與FBP1的靶向關(guān)系

miR-18a-5p 與FBP1 存在結(jié)合位點，見圖6a。與mimics NC+FBP1 WT 組相比，miR-18a-5p mimics+FBP1 WT 組細胞相對熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與mimics NC+FBP1 MUT 組相比，miR-18a-5p mimics+FBP1 MUT 組細胞相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6b。

圖6 miR-18a-5p與FBP1的靶向關(guān)系

2.7 各組細胞相關(guān)蛋白表達

與空白組、NC 組相比，circDCUN1D4 組細胞Ki67、PCNA、PD-L1 表達顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)BP1、caspase-3 表達顯著增加（P＜0.05）；與circDCUN1D4+mimics NC 組相比，circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics組細胞Ki67、PCNA、PD-L1 表達顯著增加（P＜0.05），F(xiàn)BP1、caspase-3表達顯著降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 Western blot檢測各組細胞相關(guān)蛋白表達

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥和癌癥患者死亡的主要原因[9]，其5 年生存率約為19%[10]。由于大部分肺癌患者診斷時已為晚期，難以采用手術(shù)治療；基于分子和基因水平的精準(zhǔn)治療成為目前肺癌治療的研究熱點。因此，了解肺癌的發(fā)生機制及找到潛在的治療靶點對于疾病的精準(zhǔn)治療至關(guān)重要[11]。

circRNAs 是一類新發(fā)現(xiàn)的在真核細胞中廣泛表達的RNA，通過非規(guī)范剪接形成，可對抗外切酶降解[12]。circRNAs 與各種疾病的發(fā)展密切相關(guān)，尤其是癌癥[13]。研究表明，circRNA-002178 在肺腺癌組織及細胞中表達上調(diào)，其可作為肺腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物[14]。circDCUN1D4 來源于DCUN1D4 基因的外顯子區(qū)域。Liang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，circDCUN1D4 在腫瘤樣本中下調(diào)，其通過穩(wěn)定TXNIP mRNA抑制肺腺癌中的糖酵解和腫瘤轉(zhuǎn)移，可作為肺腺癌的治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，人肺癌細胞系中circDCUN1D4 表達較人正常肺表皮細胞顯著降低，與Liang 等[15]研究結(jié)果一致，表明circDCUN1D4 的下調(diào)與肺癌的發(fā)展密切相關(guān)；過表達circDCUN1D4 后，細胞增殖活力及增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA 顯著降低，細胞凋亡率及促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 顯著升高，表明上調(diào)circDCUN1D4 可以抑制肺癌細胞增殖，促進其凋亡，其可能是肺癌的潛在治療靶點。

miRNAs 參與調(diào)節(jié)細胞分化、代謝和腫瘤發(fā)生等過程[16]。如miR-18a-5p在多種腫瘤中異常表達。在肝癌細胞中miR-18a-5p 顯著高表達，轉(zhuǎn)染miR-18a-5p mimics 后可促進肝癌的進展，而抑制miR-18a-5p 表達后，肝癌細胞的生長亦受到抑制[17]。Guo 等[18]研究表明，在黑色素瘤組織和細胞系中miR-18a-5p 表達顯著升高，并通過靶向抑制EPHA7表達促進黑色素瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡及自噬。FBP1 是糖異生的關(guān)鍵酶，可將1,6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，且FBP1 在各種癌癥中發(fā)揮著重要作用[19]。Zhang 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1在肺癌組織和細胞中下調(diào)，上調(diào)其表達抑制了體外缺氧條件下肺癌細胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR-18a-5p 與circDCUN1D4、FBP1 都存在結(jié)合點，并經(jīng)雙熒光素酶實驗驗證了其靶向關(guān)系；肺癌細胞系中FBP1 mRNA 表達下降，miR-18a-5p表達顯著增加；經(jīng)circDCUN1D4 過表達處理細胞后逆轉(zhuǎn)了FBP1 mRNA、miR-18a-5p 的表達，表明circDCUN1D4 可以抑制肺癌細胞生長，可能與抑制miR-18a-5p 表達，促進FBP1表達有關(guān)。為證明該猜想，本實驗以miR-18a-5p mimics 進行反向驗證發(fā)現(xiàn)，過表達miR-18a-5p 逆轉(zhuǎn)了circDCUN1D4 對肺癌細胞惡性行為的抑制作用。PD-L1 是一種重要的免疫檢查點分子，作為一種跨膜蛋白，在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和肺癌等多種癌癥中表達，可通過其受體程序性細胞死亡-1 幫助癌細胞逃避免疫監(jiān)視[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)circDCUN1D4可抑制PD-L1表達，而過表達miR-18a-5p則促進了PD-L1表達。這說明circDCUN1D4可能通過抑制miR-18a-5p 促進FBP1 表達，進而阻礙癌細胞免疫逃逸。

綜上，上調(diào)circDCUN1D4 可以抑制miR-18a-5p 表達，促進FBP1 表達，進而抑制肺癌細胞的增殖，促進其凋亡，阻斷其免疫逃逸，為肺癌的靶向治療提供有力依據(jù)。但本研究也存在不足，如靶向關(guān)系未采用pull down 實驗進一步驗證，且circDCUN1D4 對肺癌的作用涉及靶點較多、機制較復(fù)雜，還需進一步研究。