張華山,張元澤 （. 聊城市第二人民醫(yī)院/山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬聊城二院麻醉科，山東 臨清 560；. 武漢市普仁醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 43008）

腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)功能損傷后，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)會破壞血腦屏障內(nèi)皮細胞的緊密連接，導(dǎo)致血管源性水腫，嚴重者易發(fā)展為殘疾，以缺血對側(cè)肢體無法行動為主要特征[1]。因此，血腦屏障結(jié)構(gòu)功能的完整性是影響腦缺血患者康復(fù)的重要因素。丙泊酚是臨床常用的全身麻醉誘導(dǎo)藥物，具有一定抗氧化、抑制炎癥的作用，其對腦缺血患者康復(fù)具有正向調(diào)節(jié)作用[2-3]。然而，丙泊酚對腦缺血后血腦屏障結(jié)構(gòu)的影響機制尚不明確。故本研究就丙泊酚對腦缺血模型大鼠血腦屏障的保護作用與機制展開探討，以期為丙泊酚在腦缺血治療中的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

48只10周齡雄性清潔級SD 大鼠購自山東大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2019-0001，體質(zhì)量（260±10）g。所有動物飼養(yǎng)于清潔級動物房中，飼養(yǎng)條件為正常日夜節(jié)律，室內(nèi)溫度（23±2）℃，自由飲水進食，實驗操作均遵循3R 原則，充分保證動物福利。所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后隨機分為假手術(shù)組、腦缺血組、丙泊酚組、丙泊酚+LY294002 組，每組12只。

1.2 實驗材料與儀器

丙泊酚注射液購自西安立邦制藥有限公司（批號：20190320）；PI3K 抑制劑LY294002 購自美國MCE公司；L3600 尼龍線栓購自廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；立體定位儀購自南京卡爾文生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）、伊文思藍（Evans blue,EB）購自美國Sigma 公司；PI3K 兔抗鼠多克隆抗體、p-AKT 兔抗鼠多克隆抗體、t-AKT 兔抗鼠多克隆抗體購自武漢Proteintech 公司；Occludin 兔抗鼠多克隆抗體、Claudin-5 兔抗鼠多克隆抗體購自美國Abcam 公司；HRP 標記山羊抗兔IgG（H+L）抗體購自武漢Proteintech 公司；TNF-α、IL-6、IL-1β 的ELISA 試劑盒購自武漢Elabscience公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 LY294002側(cè)腦室注射 腦缺血模型構(gòu)建前24 h，取丙泊酚+LY294002 組大鼠，以3%戊巴比妥鈉完全麻醉大鼠，俯臥位將頭部固定于立體定位儀上。眼睛滴加眼藥水保護，頂部剃毛消毒，剪開頂部皮膚，雙氧水氧化骨膜。設(shè)計穿刺點位置：以前囟為原點-0.8 mm，中線兩側(cè)±1.5 mm，穿刺深度3.5 mm。使用微量注射器于大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射LY294002 溶液（0.3 mg·kg-1），然后縫合頭皮，并置于37 ℃恒溫毯上維持體溫，蘇醒后轉(zhuǎn)移至鼠籠中。其余各組大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射10 μL生理鹽水。

1.3.2 腦缺血模型構(gòu)建 取腦缺血組、丙泊酚組、丙泊酚+LY294002 組大鼠，以3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上。頸部皮膚消毒剃毛，切開頸部中線左側(cè)約3 mm 處皮膚，長約1 cm。逐層剝離組織暴露頸總動脈，沿頸總動脈向上鈍性分離頸外動脈與頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸外動脈并封閉頸內(nèi)動脈與頸總動脈，在頸外動脈近心端開口，插入線栓，向前緩慢前進約15 mm，阻塞頸總動脈和顱內(nèi)中動脈血流。假手術(shù)組大鼠僅分離出頸總動脈，結(jié)扎頸外動脈，不進行其他處理。腦缺血期間，丙泊酚組與丙泊酚+LY294002組大鼠經(jīng)尾靜脈滴注丙泊酚，速率20 mg·kg-1·h-1，假手術(shù)組與腦缺血組大鼠滴注生理鹽水30 min，期間持續(xù)監(jiān)測大鼠心率。給藥1 h 后，緩慢撤出線栓，結(jié)扎頸外動脈，縫合傷口。結(jié)束后將大鼠置于37 ℃恒溫毯上維持體溫，蘇醒后轉(zhuǎn)移至鼠籠中。

1.3.3 Zea Longa 法評估大鼠神經(jīng)功能 腦缺血模型構(gòu)建24 h后，參考文獻[4]中Zea Longa法評分標準對所有大鼠進行神經(jīng)功能評分。0 分：大鼠四肢正常，能夠正常行走；1 分：大鼠能夠正常直線行走，甚至左轉(zhuǎn)，但提起大鼠尾部時大鼠右前肢無法完全伸展；2 分：在1 分基礎(chǔ)上，大鼠能夠行走，但僅能向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，仍有較強的平衡能力；3 分：大鼠行走困難，僅能向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，且側(cè)推易傾倒；4分：大鼠無法行走，且意識喪失。1.3.4 TTC 染色測定大鼠腦梗死面積 神經(jīng)功能評分結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉完全麻醉大鼠，各組隨機抽取3 只大鼠，參考文獻[5]抽取腦脊液。將大鼠斷頭取腦。腦組織置于-20 ℃冰箱中冷凍10 min，然后切成6 片厚約2 mm 的切片，于2% TTC 溶液中37 ℃水浴避光孵育20 min，每5 min翻動切片。待梗死區(qū)域腦組織呈白色，無梗死區(qū)域腦組織呈紅色后，應(yīng)用Image J軟件測定梗死區(qū)域面積占比。

1.3.5 干濕重法評估大鼠腦水腫程度 神經(jīng)功能評分結(jié)束后，各組隨機取出3 只大鼠，3%戊巴比妥鈉完全麻醉大鼠，抽取腦脊液，斷頭取腦。使用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹干，稱量獲得濕重，放入120 ℃烤箱中烘至水分完全消失，約12 h，稱量獲得干重。計算大鼠腦水腫程度。腦水腫程度（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.6 EB示蹤法觀察大鼠血腦屏障完整性 神經(jīng)功能評分結(jié)束后，各組隨機取出3 只大鼠，皮下注射4 mL·kg-1EB 溶液。大鼠自由活動2 h 后，3%戊巴比妥鈉完全麻醉大鼠，斷頭取腦。取缺血半球腦組織，加入2 mL 甲酰胺勻漿10 min 至細胞懸液，置于54 ℃下恒溫孵育2 h。再以12 000 r/min 離心20 min 后取上清液，采用紫外分光光度計在620 nm 波長下檢測吸光度值，參考EB 標準濃度曲線計算各組大鼠缺血半球腦組織中EB含量。

1.3.7 ELISA 法檢測腦脊液中炎癥細胞因子含量將腦脊液以12 000 r/min 離心10 min，取上清，按照炎癥細胞因子的ELISA 試劑盒說明書，在預(yù)包被抗體的樣品板中加入樣品、抗體試劑、底物、終止液，期間根據(jù)要求進行洗板、孵育，然后在450 nm、610 nm 波長處檢測吸光度值，通過各個標準曲線計算出大鼠腦脊液中炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.3.8 Western blot 檢測大鼠PI3K/AKT 信號通路蛋白與血腦屏障緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin 表達 神經(jīng)功能評分結(jié)束后，每組隨機取3 只大鼠，3%戊巴比妥鈉完全麻醉后，抽取腦脊液，斷頭取腦，分離并獲取大腦基底節(jié)組織，稱重后加入含PMSF 的RIPA 裂解液提取總蛋白[腦組織質(zhì)量（mg）∶裂解液體積（mL）=1∶4]。提取出組織蛋白溶液后加入上樣緩沖液，100 ℃水浴中煮沸后進行SDS-PAGE 凝膠電泳（恒壓30 V/30 min，90 V/90 min），以上樣緩沖液到達底端為電泳終點。獲取目的蛋白條帶，濕法轉(zhuǎn)膜將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（恒流2 mA/60 min），整個過程冰浴。4%脫脂牛奶封閉PVDF 膜2 h，PBST 洗凈后分別加入PI3K兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）、p-AKT兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）、t-AKT 兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）、Claudin-5 兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）或Occludin 兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）、β-actin 兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）覆蓋PVDF 膜，4 ℃冰箱中孵育過夜。次日洗凈一抗，加入HRP 標記山羊抗鼠IgG（H+L）二抗（1∶5 000）或HRP 標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶5 000），室溫避光孵育2 h。添加ECL 發(fā)光液，顯影后使用Image J圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin或t-AKT作為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能正常，能正常行走，精神、毛發(fā)狀態(tài)良好；與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠神經(jīng)功能評分增加（P＜0.05），多數(shù)大鼠行走困難，且向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，部分大鼠側(cè)推時易跌倒；與腦缺血組相比，丙泊酚組大鼠神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05），多數(shù)大鼠為右前肢蜷曲，無法完全伸展，但行走狀態(tài)較好；與丙泊酚組相比，丙泊酚+LY294002 組大鼠神經(jīng)功能評分無顯著變化（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、梗死面積占比、EB含量、腦水腫程度比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、梗死面積占比、EB含量、腦水腫程度比較（±s）

*：與假手術(shù)組相比，P＜0.05；#：與腦缺血組相比，P＜0.05；△：與丙泊酚組相比，P＜0.05

EB含量（μg·g-1）0.96±0.15 6.34±0.44*2.72±0.39#5.11±0.83△腦水腫程度（%）74.03±2.23 83.48±2.80*75.40±3.21#79.52±2.62組別假手術(shù)組腦缺血組丙泊酚組丙泊酚+LY294002組神經(jīng)功能評分（分）0 2.50±0.80*1.58±0.67#2.16±0.83梗死面積占比（%）0 46.22±3.52*20.98±2.89#36.63±4.64△

2.2 丙泊酚對腦缺血大鼠腦梗死的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織染色正常，無梗死出現(xiàn)；與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)較大面積的梗死（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚組大鼠腦梗死面積占比明顯降低（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+LY294002 組大鼠腦梗死面積占比明顯增加（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色

2.3 丙泊酚對腦缺血大鼠血腦屏障完整性的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織中EB 含量較低；與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦組織中EB 含量明顯升高（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚組大鼠腦組織中EB 含量明顯降低（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+LY294002 組大鼠腦組織中EB 含量明顯升高（P＜0.05），見表1。

2.4 丙泊酚對腦缺血大鼠腦水腫程度的影響

與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦水腫程度明顯升高（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚組大鼠腦水腫程度明顯降低（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+LY294002組大鼠腦水腫程度無顯著變化（P＞0.05），見表1。

2.5 丙泊酚對腦缺血大鼠腦脊液中炎癥細胞因子的影響

假手術(shù)組大鼠腦脊液中炎癥細胞因子處于基線水平；與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦脊液中TNF-α、IL-6、IL-1β 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚組大鼠腦脊液中TNF-α、IL-6、IL-1β 表達水平降低（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+LY294002 組大鼠腦脊液中TNF-α、IL-6、IL-1β 表達水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠腦脊液中炎癥細胞因子的含量（±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠腦脊液中炎癥細胞因子的含量（±s，pg·mL-1）

*：與假手術(shù)組相比，P＜0.05；#：與腦缺血組相比，P＜0.05；△：與丙泊酚組相比，P＜0.05

組別假手術(shù)組腦缺血組丙泊酚組丙泊酚+LY294002組TNF-α 36.19±9.94 261.22±32.11*61.48±9.77#185.28±27.44△IL-6 32.65±6.24 93.85±7.54*40.18±7.14#76.05±5.61△IL-1β 22.02±6.59 96.35±9.57*38.31±5.97#79.27±9.69△

2.6 丙泊酚對腦缺血大鼠腦組織中PI3K/AKT 的影響

與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠缺血側(cè)基底組織中PI3K、p-AKT 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚組腦組織中PI3K、p-AKT 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+LY294002組腦組織中PI3K、p-AKT蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 各組大鼠腦組織中血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白表達（±s）

表3 各組大鼠腦組織中血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白表達（±s）

*：與假手術(shù)組相比，P＜0.05；#：與腦缺血組相比，P＜0.05；△：與丙泊酚組相比，P＜0.05

組別假手術(shù)組腦缺血組丙泊酚組丙泊酚+LY294002組Occludin 0.85±0.11 0.13±0.02*0.83±0.10#0.47±0.10△Claudin-5 0.81±0.05 0.26±0.06*0.86±0.08#0.40±0.08△

表3 各組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號通路蛋白表達（±s）

表3 各組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號通路蛋白表達（±s）

*：與假手術(shù)組相比，P＜0.05；#：與腦缺血組相比，P＜0.05；△：與丙泊酚組相比，P＜0.05

p-AKT/t-AKT 0.92±0.03 0.19±0.03*0.77±0.05#0.27±0.06△組別假手術(shù)組腦缺血組丙泊酚組丙泊酚+LY294002組PI3K/β-actin 0.97±0.09 0.22±0.04*0.80±0.11#0.43±0.04△

圖2 各組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達

2.7 丙泊酚對腦缺血大鼠血腦屏障緊密連接的影響

與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦組織中Occludin、Claudin-5 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚組大鼠腦組織中Occludin、Claudin-5蛋白表達升高（P＜0.05）；與腦缺血組相比，丙泊酚+LY294002組大鼠腦組織中Occludin、Claudin-5 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腦組織中血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白表達

3 討論

建立與臨床病理生理相近的模型是實驗成功的前提。大鼠頸動脈及基底節(jié)血液供給與人類相似，血管損傷部位明顯，可重復(fù)性較高。故本研究選擇頸動脈線栓阻塞法構(gòu)建局灶性腦缺血大鼠模型，結(jié)果顯示，腦缺血模型構(gòu)建24 h 后，腦缺血組大鼠出現(xiàn)以對側(cè)前肢無法伸展為主的癥狀，且伴有行走困難；TTC染色顯示，腦缺血組大鼠缺血側(cè)腦組織梗死面積占比較高。這些結(jié)果與臨床患者的半身不遂癥狀及CT 中缺血側(cè)腦組織動脈高密度影情況一致[6]，提示本研究中腦缺血模型構(gòu)建成功。

已有學(xué)者證實了腦缺血并發(fā)疾病與血腦屏障通透性改變密切相關(guān)[7]。Zuo 等[8]研究顯示，血腦屏障的破壞會造成外周血液中白蛋白、其他水溶性化合物及大量水分子滲入到神經(jīng)元的內(nèi)環(huán)境中，形成血管源性水腫。本研究中腦缺血組大鼠腦組織中緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin 表達明顯低于假手術(shù)組，而EB含量和腦水腫程度明顯高于假手術(shù)組，提示腦缺血會造成血管內(nèi)皮緊密連接蛋白減少，破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能完整。此外，血腦屏障通透性增加會導(dǎo)致炎癥介質(zhì)等有害分子進入腦內(nèi)，從而引起炎癥反應(yīng)，造成血腦屏障破壞加劇[9]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血組大鼠腦脊液中炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 含量明顯升高。這些促炎細胞因子可通過級聯(lián)反應(yīng)加重腦缺血的病理損傷過程[10]。

丙泊酚的作用機理是降低腦組織代謝、減緩腦血流量、擴張血管、降低顱內(nèi)壓，屬于中樞神經(jīng)保護麻醉藥物[11]。在蛛網(wǎng)膜下腔出血誘發(fā)的中樞神經(jīng)損傷中，丙泊酚已被證實可以明顯減少TNF-α、IL-1β等炎癥細胞因子釋放，發(fā)揮中樞神經(jīng)保護作用[12]。此外，丙泊酚還可以減輕腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷[2]。本研究構(gòu)建大鼠腦缺血模型后注射丙泊酚治療，結(jié)果顯示丙泊酚可以明顯抑制大鼠缺血腦組織中炎癥細胞因子浸潤，維持血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而降低腦水腫程度，減少腦梗死區(qū)域，發(fā)揮腦組織保護作用。

為了進一步探索丙泊酚發(fā)揮抗腦缺血的機制，本研究通過Western blot 對可能涉及的信號通路蛋白進行檢測，結(jié)果顯示，丙泊酚組大鼠缺血側(cè)腦組織中p-AKT 水平升高，且上游PI3K 蛋白表達增加。PI3K/AKT 信號通路參與腦缺血發(fā)生的一系列生理過程，具有調(diào)控缺血后神經(jīng)元程序性凋亡與促進神經(jīng)元存活的作用[13]。AKT 是一種相對分子質(zhì)量為60 kD 的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過與PI3K 結(jié)合調(diào)控NF-κB 和Bcl-2等轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制凋亡基因的表達，提高血管內(nèi)皮細胞的活力，進而發(fā)揮維持血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用[14]。為了進一步研究PI3K/AKT 信號通路在丙泊酚保護血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能完整中的作用，本研究借助大腦立體定位儀，將PI3K 抑制劑LY294002注入腦缺血大鼠側(cè)腦室中，結(jié)果顯示，LY294002 可以成功逆轉(zhuǎn)丙泊酚的抗腦缺血作用，導(dǎo)致大鼠腦脊液中炎癥細胞因子釋放增加，血腦屏障通透性增加，梗死面積占比升高。然而，本研究中丙泊酚+LY294002 組大鼠神經(jīng)功能評分有增加趨勢，但增加不明顯，與丙泊酚組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，可能是LY294002 逆轉(zhuǎn)了丙泊酚的治療作用，但由于本研究樣本量較小，導(dǎo)致組間差異不顯著；此外，丙泊酚組和丙泊酚+LY294002組大鼠腦水腫程度無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是腦水腫程度基值較高，腦水腫程度的變化較小導(dǎo)致。

綜上所述，本研究證實了丙泊酚具有明顯的神經(jīng)功能保護作用，其機制是通過激活PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮血腦屏障保護作用。