李敬茹,李中霞,牛寧寧,喬 緣,韓 蕓,林雪容 （河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000）

急性T 淋巴細(xì)胞白血病是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，常采用抗癌藥物聯(lián)合方案、靶向治療、骨髓抑制劑等進行治療，雖然無法治愈，但大部分患者可有效緩解癥狀，恢復(fù)正常生活[1]。然而，現(xiàn)有的治療方案容易誘發(fā)不良反應(yīng)，如水鹽代謝紊亂、骨質(zhì)疏松等，且容易產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[2]。因此，開發(fā)新型抗急性T 淋巴細(xì)胞白血病藥物具有較高的臨床應(yīng)用價值。阿魏酸是當(dāng)歸、川穹、益母草等多種中藥中的主要有效成分之一[3]。研究顯示，阿魏酸作為抗腫瘤的天然藥物，對乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用[4-5]，但阿魏酸對急性T 淋巴細(xì)胞白血病的作用尚不清楚?；诖耍狙芯刻岢霭⑽核嵩诩毙訲 淋巴細(xì)胞白血病中也具有抗腫瘤活性的假設(shè)，為證實該假設(shè)，本研究觀察阿魏酸對急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，并探究其潛在的作用分子機制，以期豐富阿魏酸抗腫瘤活性的研究，為臨床急性T 淋巴細(xì)胞白血病的藥物開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

急性T 淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫；30 只雄性BALB/c 裸鼠（6 周齡、體質(zhì)量18～22 g）購自河北省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2022-001。

純度98%以上阿魏酸單體（批號：J-042，成都瑞芬思生物科技有限公司），純度98%以上PI3K/AKT 抑制劑LY294002（批號：G2431，美國Sigma），RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（批號：CD-02168-ML、10270-106，美國Gibco），CCK-8 檢測試劑盒、蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記蛋白二抗（批號：210510、210128、210807，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒、Transwell 小室、基質(zhì)膠（批號：556507、353093、354234，美國BD），Ki67、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cleaved caspase-3、 caspase-3、 cleaved caspase-9、caspase-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、β-actin抗體（批號：9449、2586、5256、9662、7237、9508、2445、5415、5741、9188、4228、4225、4070、4685、4970，美國Cell Signaling Technology）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮Jurkat細(xì)胞，然后在5%CO2、37 ℃的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時，離心傳代培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞活性 將Jurkat 細(xì)胞以4×105/孔接種于96孔板，分為對照組（正常培養(yǎng)）、阿魏酸處理組（給予1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L阿魏酸），各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h，800 r/min 板式離心3～5 min，各孔添加含有20 μL CCK-8 試劑的培養(yǎng)基，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處細(xì)胞OD 值，細(xì)胞活性=加藥孔OD 值/對照孔OD 值×100%。

1.2.3 克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力 將Jurkat細(xì)胞以100/mL 接種于培養(yǎng)皿，分為對照組、阿魏酸處理組（5、10、20 μmol/L）和LY294002處理組（50 μmol/L），培養(yǎng)細(xì)胞2～3 周，培養(yǎng)皿中觀察到肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，加入GIMSA 染液染色10 min，干燥后計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)目，細(xì)胞克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平 將Jurkat細(xì)胞以5×106/孔接種于6 孔板，分為對照組、阿魏酸處理組（5、10、20 μmol/L）和LY294002處理組（50 μmol/L），培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106/mL，分別加入Annexin V-FITC和PI染液，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，以凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值代表細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 預(yù)先以基質(zhì)膠包被Transwell 小室上室，將對照組、阿魏酸處理組（5、10、20 μmol/L）和LY294002 處理組細(xì)胞以2×104/mL 接種于小室上室，培養(yǎng)24 h 后取出小室，去除表面細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10～15 min，隨機挑選5 個視野，計數(shù)染色細(xì)胞，結(jié)果取平均值。

1.2.6 移植瘤模型的建立與檢測 取BALB/c裸鼠隨機分為正常組和阿魏酸處理組，每組15 只，均以1×107/mL Jurkat 細(xì)胞接種于裸鼠左前肢腋下，接種當(dāng)日阿魏酸處理組以75 mg/kg阿魏酸灌胃[6]，正常組以生理鹽水灌胃，每日1 次，接種后每5 d 測量種植瘤的長徑和短徑，腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2，接種第30 天處死裸鼠，剝離腫瘤組織稱重后待測。

1.2.7 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達 添加RIPA裂解液提取各組細(xì)胞和腫瘤組織中蛋白，經(jīng)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，取30～70 μg 蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再經(jīng)半干法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，隨后加入抗體Ki67（1:1 500）、PCNA（1:1 000）、cleaved caspase-3（1:1 000）、caspase-3（1: 1 000）、cleaved caspase-9（1: 1 000）、caspase-9（1:1 000）、E-cadherin（1:2 000）、N-cadherin（1:1 500）、Vimentin（1:1 000）、PTEN（1:1 000）、p-PI3K（1:1 000）、PI3K（1:1 000）、p-AKT（1:1 000）、AKT（1:1 000）、β-actin（1:3 000），4 ℃孵育過夜，第2 天再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:3 000）室溫孵育1 h，添加ECL 顯色液后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白圖像，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值表示Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和PTEN蛋白相對表達量，cleaved caspase-3 與caspase-3 比值、cleaved caspase-9 與caspase-9 比值表示其蛋白活化水平，p-PI3K 與PI3K 比值、p-AKT 與AKT 比值表示其蛋白磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞活性的影響

隨著阿魏酸濃度增加，細(xì)胞活性降低，隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞活性也降低，見圖1?？紤]細(xì)胞毒性對實驗結(jié)果的影響，后續(xù)實驗選取培養(yǎng)時間為24 h，阿魏酸實驗濃度為5、10、20 μmol/L。

圖1 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞活性的影響

2.2 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，5、10、20 μmol/L 阿魏酸處理組和LY294002處理組細(xì)胞克隆形成率，Ki67、PCNA蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

2.3 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，5、10、20 μmol/L 阿魏酸處理組和LY294002 處理組細(xì)胞凋亡率明顯升高，10、20 μmol/L阿魏酸組和LY294002 處理組cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9 水平明顯升高（P＜0.05），見圖3。

2.4 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞侵襲的影響

與對照組比較，10、20 μmol/L 阿魏酸處理組和LY294002 處理組細(xì)胞侵襲數(shù)，N-cadherin 和Vimentin蛋白表達明顯減少/降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 阿魏酸對Jurkat細(xì)胞侵襲的影響

2.5 阿魏酸對Jurkat 細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT 信號通路的影響

與對照組比較，10、20 μmol/L 阿魏酸處理組和LY294002處理組細(xì)胞中PTEN表達明顯升高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平明顯降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 阿魏酸對Jurkat 細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT 信號通路的影響

2.6 阿魏酸對急性T 淋巴細(xì)胞白血病移植瘤模型的影響

與正常組比較，阿魏酸處理組小鼠腫瘤質(zhì)量減輕，體積減小，腫瘤組織中Ki67、N-cadherin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平均明顯降低，cleaved caspase-3/caspase-3、E-cadherin、PTEN 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，天然藥物在抗癌的發(fā)展和治療方面有巨大的潛在價值[7]。阿魏酸是自然界普遍存在的一種酚酸，具有抗癌、抗氧化、抗炎等多種生物活性[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸是一種多靶點的天然抗腫瘤藥物，具有性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低的優(yōu)勢。毛廣顯等[9]研究顯示，阿魏酸可有效促進食管癌細(xì)胞的自噬，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。Yue等[10]報道，阿魏酸衍生物可調(diào)控多種信號通路，抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移，為阿魏酸衍生物抗癌藥物的開發(fā)提供了重要的科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，阿魏酸可抑制Jurkat細(xì)胞活性；同時，阿魏酸還可抑制細(xì)胞克隆形成和侵襲能力，提高細(xì)胞凋亡率。這表明阿魏酸可能通過抑制Jurkat 細(xì)胞增殖與侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而阻礙急性T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)展。

腫瘤細(xì)胞的惡性行為涉及多種基因、蛋白的共同調(diào)控，Ki67、PCNA 主要參與細(xì)胞周期調(diào)控，可作為細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，其表達水平越高，表明細(xì)胞增殖能力越強[11]。細(xì)胞凋亡以caspases 家族的激活為起點，caspase-3 和caspase-9 是凋亡過程的主要效應(yīng)蛋白，cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 分別是caspase-3 和caspase-9 的活化形式，cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9 水平可反映細(xì)胞凋亡程度[12]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要基礎(chǔ)，這個過程中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 等表達降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin 表達升高，從而促進腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[13]。本研究中，相較于對照組，10、20 μmol/L阿魏酸處理后Jurkat 細(xì)胞中Ki67、PCNA、N-cadherin、Vimentin 降低，cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9、E-cadherin 升高，進一步提示阿魏酸可影響Jurkat細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲。

PI3K/AKT 信號通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲過程的重要信號通路[14]。PTEN 可對PI3K 的3-磷酸化位點去磷酸化，并負(fù)向調(diào)節(jié)AKT 信號，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15-16]。急性T 淋巴細(xì)胞白血病是一種異質(zhì)性疾病，致癌因子可介導(dǎo)多種信號通路參與急性T 淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展。Tottone 等[17]研究顯示，PTEN 作為腫瘤抑制增強因子，其缺失與急性T 淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Meng 等[18]研究表明，天然植物成分白藜蘆醇可上調(diào)PTEN 表達，抑制PI3K/AKT 信號通路活性，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗白血病作用。本研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸可上調(diào)PTEN 表達，下調(diào)p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平，且20 μmol/L 阿魏酸處理組效果與PI3K/AKT 抑制劑LY294002 相當(dāng)，提示阿魏酸抑制Jurkat 細(xì)胞增殖、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路有關(guān)。Luo 等[19]研究也指出，阿魏酸在宮頸癌HeLa 和Caski 細(xì)胞中可抑制PI3K/AKT 信號通路的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，本研究通過構(gòu)建急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat 細(xì)胞動物模型，同樣發(fā)現(xiàn)阿魏酸可抑制腫瘤的生長，表明阿魏酸在體內(nèi)也可抑制急性T淋巴細(xì)胞白血病的進展。

綜上，阿魏酸可顯著降低急性T 淋巴細(xì)胞白血病Jurkat 細(xì)胞活性，降低細(xì)胞增殖抗原Ki67、PCNA，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin 表達，促進凋亡效應(yīng)蛋白cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9 和上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 的表達，從而抑制細(xì)胞克隆形成和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時還可上調(diào)PTEN 表達，其可能通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)上述作用。本研究初步評價了阿魏酸在體內(nèi)外對急性T 淋巴細(xì)胞白血病發(fā)展的影響及機制，為阿魏酸用于急性T 淋巴細(xì)胞白血病的治療提供了實驗數(shù)據(jù)支撐，但阿魏酸是否還存在其他的調(diào)控機制有待進一步分析。