林明利,鄭美玲,盧宏全,林耀庭 （. 儋州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 儋州 57700；. 海南西部中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 儋州 57700；. 儋州市人民醫(yī)院普外科，海南 儋州 57700）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率持續(xù)上升。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)約占乳腺癌的15%，復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和病死率最高，且缺乏有效的靶向治療方案[1]。TNBC 的典型特征是缺乏雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長(zhǎng)因子受體2，因其無有效治療靶點(diǎn)，治療有一定局限，且預(yù)后較差[2]。因此，尋找新的TNBC 預(yù)后標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)十分重要。circRNAs 是一類新型的非編碼RNA，其特征是缺乏3'poly(A)尾巴的特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs 在許多癌癥中是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，如下調(diào)circDDX17可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡[4]。敲低circDNMT1 可抑制乳腺癌細(xì)胞集落形成、遷移、侵襲和腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA/miRNA/mRNA軸參與TNBC的發(fā)展[6]。下調(diào)miR-377-3p 會(huì)促進(jìn)TNBC 的進(jìn)展[7]，而下調(diào)PUM1 會(huì)抑制TNBC 的進(jìn)展[8]。但目前circDNMT1 是否可通過調(diào)節(jié)miR-377-3p/PUM1 軸影響TNBC 的惡性生物學(xué)行為尚不清楚。因此，本研究旨在探究circDNMT1 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影響及其作用機(jī)制，以期為該病的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

收集儋州市人民醫(yī)院2018年至2021年收治的24例TNBC 患者的TNBC 組織（TNBC 組）及其鄰近正常組織（NOR 組）。本研究經(jīng)儋州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018-10099），符合《赫爾辛基宣言》，所有患者均簽署對(duì)手術(shù)的知情同意書。

TNBC 細(xì)胞系4T1、Eph41424、JC，正常乳腺上皮細(xì)胞系HC11均購自上海酶研生物科技有限公司；si-NC、si-DNMT1、anti-NC、anti-miR-377-3p購自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司；PUM1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2抗體均購自英國Abcam 公司。30 只BALB/c 小鼠[體質(zhì)量（20±2）g]購自廣州銳格生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0059]。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-377-3p、circDNMT1表達(dá)

使用TRIzol 試劑提取組織和細(xì)胞的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)qRT-qPCR 試劑盒配制反應(yīng)體系，然后擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃45 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6或GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-377-3p、circDNMT1的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將4T1細(xì)胞添加至含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，待4T1 細(xì)胞培養(yǎng)至75%匯合時(shí)，用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并分為4T1組（未處理的4T1 細(xì)胞）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-DNMT1 組（轉(zhuǎn)染si-DNMT1）、si-DNMT1+anti-NC 組（同時(shí)轉(zhuǎn)染si-DNMT1 和anti-NC）、si-DNMT1+anti-miR-377-3p 組（同時(shí)轉(zhuǎn)染si-DNMT1 和anti-miR-377-3p）。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)檢測(cè)。

1.4 CCK-8檢測(cè)4T1細(xì)胞增殖水平

將各組4T1細(xì)胞按5×103/孔的密度接種至96孔板上，然后在細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48 h 時(shí)向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組4T1 細(xì)胞在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4T1細(xì)胞凋亡水平

將各組4T1細(xì)胞加入胰酶消化成細(xì)胞懸液，用PBS清洗后調(diào)整4T1細(xì)胞濃度為5×105/mL。取100 μL細(xì)胞懸液與10 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 混合，置于4 ℃冰箱孵育15 min，PBS 清洗2 次，隨后加入480 μL結(jié)合緩沖液重懸4T1 細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=（細(xì)胞凋亡數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-377-3p 與PUM1、circDNMT1的關(guān)系

TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-377-3p 與circDNMT1、PUM1 是否存在結(jié)合位點(diǎn)。將含miR-377-3p 結(jié)合位點(diǎn)的野生型circDNMT1/PUM1 序列和不含miR-377-3p 結(jié)合位點(diǎn)的突變型circDNMT1/PUM1 序列克隆到pmirGLO 載體中，分別命名為WT-circDNMT1、MUT-circDNMT1、WT-PUM1、MUT-PUM1，然后將上述序列與mimic-NC、miR-377-3p mimic共轉(zhuǎn)染到4T1細(xì)胞中，分別記為miR-NC+WT-circDNMT1 組、miR-377-3p mimic+WT-circDNMT1 組、miR-NC+MUT-circDNMT1組、miR-377-3p mimic+MUT-circDNMT1 組和miR-NC+WT-PUM1 組、miR-377-3p mimic+WT-PUM1 組、miR-NC+MUT-PUM1 組、miR-377-3p mimic+MUTPUM1 組。培養(yǎng)48 h 后使用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組4T1細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.7 Western blot 檢測(cè)EMT 及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

將TNBC 組織和鄰近正常組織及各組4T1 細(xì)胞經(jīng)RIPA 裂解緩沖液裂解后提取總蛋白，經(jīng)凝膠電泳（120 V，藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端附近時(shí)停止電泳）分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜（200 mA，1 kD約1 min）上，脫脂牛奶封閉，隨后加入PUM1（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）一抗和GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃下放置過夜后，TBST 清洗3 次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG 二抗（1∶5 000），在37 ℃下孵育1 h后加入顯色劑，用Image J軟件量化目的蛋白的灰度值。

1.8 荷瘤小鼠模型驗(yàn)證circDNMT1對(duì)4T1移植瘤的影響

將4T1細(xì)胞接種至6周齡小鼠腹部脂肪墊（4×105/只），4 d后觀察成瘤情況。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（注射等量生理鹽水）、陰性對(duì)照組（尾靜脈注射si-NC）、DNMT1 沉默組（尾靜脈注射si-DNMT1）、聯(lián)合對(duì)照組（尾靜脈注射si-DNMT1 和anti-NC）、聯(lián)合沉默組（尾靜脈注射si-DNMT1和anti-miR-377-3p），每組6只。

接種后35 d 麻醉處死小鼠，取出腫瘤組織，稱重后于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察腫瘤形態(tài)變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1 在組織和細(xì)胞中的表達(dá)

與NOR 組比較，TNBC 組組織中circDNMT1、PUM1 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），miR-377-3p 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與HC11 細(xì)胞比較，JC、Eph41424 及4T1細(xì)胞中circDNMT1、PUM1表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），miR-377-3p 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），且在4T1 細(xì)胞中表達(dá)差異最顯著，因此本研究選擇4T1 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1、2。

圖1 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在TNBC組織中的表達(dá)

圖2 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在各細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在4T1細(xì)胞中的表達(dá)

與4T1 組、si-NC 組比較，si-DNMT1 組細(xì)胞中circDNMT1 水平以及PUM1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），miR-377-3p 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與si-DNMT1 組、si-DNMT1+anti-NC 組比較，si-DNMT1+anti-miR-377-3p 組細(xì)胞PUM1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-377-3p表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 circDNMT1、miR-377-3p、PUM1在各組4T1細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 對(duì)4T1 細(xì)胞增殖的影響

與4T1 組、si-NC 組比較，si-DNMT1 組細(xì)胞24 h、48 h 的OD 值顯著降低（P＜0.05）；與si-DNMT1 組、si-DNMT1+anti-NC 組比較，si-DNMT1+anti-miR-377-3p組細(xì)胞24 h、48 h的OD值顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組4T1細(xì)胞增殖能力比較

2.4 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 對(duì)4T1 細(xì)胞凋亡的影響

與4T1 組、si-NC 組比較，si-DNMT1 組4T1 細(xì)胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與si-DNMT1 組、si-DNMT1+anti-NC 組比較，si-DNMT1+anti-miR-377-3p組細(xì)胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組4T1細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 對(duì)4T1 細(xì)胞EMT的影響

與4T1 組、si-NC 組比較，si-DNMT1 組4T1 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與si-DNMT1組、si-DNMT1+anti-NC組比較，si-DNMT1+anti-miR-377-3p 組4T1 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組4T1細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

2.6 circDNMT1靶向調(diào)控miR-377-3p/PUM1軸

通過TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-377-3p 與circDNMT1、PUM1 均存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖7a。與miR-NC+WT-circDNMT1 組比較，miR-377-3p mimic+WT-circDNMT1 組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC+MUT-circDNMT1 組比較，miR-377-3p mimic+MUT-circDNMT1 組細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）；與miR-NC+WT-PUM1組比較，miR-377-3p mimic+WT-PUM1 組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而與miR-NC+MUTPUM1 組比較，miR-377-3p mimic+MUT-PUM1 組細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見圖7b、c。

圖7 circDNMT1靶向調(diào)控miR-377-3p/PUM1軸

2.7 沉默circDNMT1 或miR-377-3p 對(duì)4T1 在小鼠體內(nèi)增殖的影響

與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，DNMT1 沉默組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著減少（P＜0.05）；與DNMT1 沉默組、聯(lián)合對(duì)照組比較，聯(lián)合沉默組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），見圖8a。

圖8 沉默circDNMT1或miR-377-3p對(duì)4T1在小鼠體內(nèi)增殖的影響

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞排列密集，邊界清晰；DNMT1沉默組、聯(lián)合對(duì)照組細(xì)胞排列疏松，胞核固縮，細(xì)胞碎片增多；聯(lián)合沉默組組小鼠腫瘤細(xì)胞排列比較密集，邊界趨于清晰，見圖8b。

3 討論

乳腺癌是女性常見的癌癥，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，而TNBC 是最具侵襲性的亞型之一[1]。TNBC 常見的治療方法包括手術(shù)、化療、放療和免疫療法[9]。然而，由于局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高，晚期TNBC患者的預(yù)后并不理想。因此，亟需尋找新的靶點(diǎn)開發(fā)新的有效治療策略[10]。CircRNAs 具有末端共價(jià)連接、穩(wěn)定性高、組織特異性表達(dá)模式等特點(diǎn)，是人類疾病診斷、治療和預(yù)后的理想生物標(biāo)志物[11]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA、蛋白質(zhì)支架或翻譯模板，從而在TNBC 中發(fā)揮重要作用[12]。此外，上調(diào)circDNMT1 可以通過激活自噬來促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[13]，而下調(diào)circDNMT1 可以抑制乳腺癌的進(jìn)展[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，circDNMT1 在TNBC 組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，說明circDNMT1 可能具有促進(jìn)TNBC進(jìn)展的作用。

上皮標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)降低及間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin 表達(dá)升高是EMT 的典型特征[14]。細(xì)胞增殖和凋亡對(duì)于TNBC細(xì)胞的生長(zhǎng)極其重要，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、caspase-3和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞凋亡，從而起到治療效果[15]。本研究結(jié)果顯示，與4T1 組、si-NC 組比較，si-DNMT1 組細(xì)胞miR-377-3p 表達(dá)，4T1 細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved caspase-3、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高，OD 值及Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示沉默DNMT1 可抑制4T1 細(xì)胞增殖、EMT，促進(jìn)其凋亡。

hsa_circ_0131242 可以通過海綿化hsa-miR-2682促進(jìn)TNBC 的進(jìn)展[16]。而circRNA/miRNA/mRNA 軸在TNBC 中的研究也有報(bào)道[17]。本研究通過TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，circDNMT1 與miR-377-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)。研究顯示，下調(diào)miR-377-3p 會(huì)促進(jìn)TNBC 的進(jìn)展[7,18]。本研究結(jié)果亦顯示，在TNBC 組織和細(xì)胞中miR-377-3p 下調(diào)，沉默circDNMT1 后miR-377-3p 表達(dá)顯著升高；且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，circDNMT1與miR-377-3p 存在靶向關(guān)系。因此，我們推測(cè)沉默circDNMT1 可能通過上調(diào)miR-377-3p 來抑制TNBC 的進(jìn)展。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該猜測(cè)，我們對(duì)4T1 細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染si-DNMT1 和anti-miR-377-3p，結(jié)果顯示，下調(diào)miR-377-3p 會(huì)逆轉(zhuǎn)沉默circDNMT1 對(duì)4T1 細(xì)胞增殖、EMT 的抑制作用和對(duì)凋亡的促進(jìn)作用。PUM1 是乳腺癌的生物標(biāo)志物[19]，下調(diào)PUM1會(huì)抑制TNBC 的進(jìn)展[8]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-377-3p 與PUM1 也存在靶向關(guān)系，PUM1 在TNBC 組織和細(xì)胞中上調(diào)，且沉默circDNMT1 后PUM1 蛋白表達(dá)水平顯著下降，下調(diào)miR-377-3p 后PUM1 蛋白表達(dá)水平顯著上升，表明沉默circDNMT1 可能通過上調(diào)miR-377-3p 來抑制PUM1 表達(dá)，進(jìn)而抑制4T1 細(xì)胞增殖、EMT，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，本研究通過荷瘤小鼠模型驗(yàn)證circDNMT1 對(duì)4T1 移植瘤的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-DNMT1組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著減少，腫瘤細(xì)胞排列疏松，胞核固縮，細(xì)胞碎片增多，進(jìn)一步證明circDNMT1 可能是TNBC患者的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上，在TNBC 中沉默circDNMT1 可能通過上調(diào)miR-377-3p 來抑制PUM1 表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、EMT，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。